Name: Expressão, purificação e ligação lipossoma dos heterodimers brotamentos do SNX-BAR do fermento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Aprenda a expressão, purificação e ligação lipossoma de heterodímeros SNX-BAR em levedura. Este método permite estudar propriedades biofísicas e especificidades lipídicas de proteínas de remodelamento de membrana.

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Pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde o número de premiação GM060221 e em parte pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde o número de prêmio T32GM007223. R.C. foi apoiado em parte pelo Programa de Bolsas de Pesquisa da Faculdade UNC-Charlotte.

1. Construção da tensão do fermento
<ol><li>Comece com TVY614 (pep4Δ::LEU2 prb1Δ::hisG prc1Δ::HIS3)11 como a cepa pai. Esta cepa é deficiente para proteases vacuolares, que contribuem para a maioria da degradação da proteína após a lisose celular e, portanto, permite uma purificação mais limpa e eficiente.</li>
	<li>Projetar primers12 e integrar aplicação em conjunto purificação (TAP) tag no C-terminus de Atg20 (SNX-BAR ORF 1) usando recombinação homóloga. Use a reação em cadeia de polimerase (PCR) para confirmar integrações(Figura 2).</li>
	<li>Executar uma mancha ocidental de lysate celular contra a tag TAP para confirmar a integração adequada13. Nota: Recomendamos a colheita de 3 OD (1 OD - 1 x 107 células) de células para sds-page e verificação de manchas ocidentais. Note-se que a integração da tag TAP deve ocorrer antes de substituir os promotores endógenos com o promotor GAL1 para permitir uma verificação mais fácil tag TAP via mancha ocidental.</li>
	<li>Substitua os promotores endógenos do Snx4 (SNX-BAR ORF1) e atg20 (SNX-BAR ORF 2) pelo promotor GAL1 não escalotado usando recombinação homóloga sequencial e etapas de transformação de cada ORFindividual 14.</li>
	<li>Use primers flanqueados fora dos locais de integração para PCR confirmar integrações bem sucedidas(Figura 2). Isso resultará em um fenótipo nulo dos SNX-BARs direcionados na ausência de galactose no meio de crescimento.</li>
</ol>2. Indução de Levedura e Purificação SNX-BAR Dimer
Nota: As células de levedura podem ser propagadas em YPD padrão (extrato de levedura, peptone e 2% de placa de ágar de glicose) à medida que as modificações são cromossomicamente integradas.
<ol><li>Inocular um grande cotonete de células em 50 mL de YP padrão (extrato de levedura e peptone) médio com 2% raffinose e 0,1% de glicose como fonte de carbono em um frasco de pelo menos 4x o volume da cultura e crescer durante a noite em 30 ° C shaker para permitir a aeração adequada. Espere que o crescimento neste meio será mais lento em comparação com ypd padrão.</li>
	<li>Na manhã seguinte, use a precultura de 50 mL para inocular em 1 L do meio yp padrão com 2% de raffinose e 0,1% de glicose e crescer para 4-5 h em 30 °C shaker. Nota: O volume de pré-cultura usado para inocular a cultura 1 L pode ser ajustado dependendo do OD600 da precultura. O OD600 da cultura 1 L após a inoculação deve ser em torno de 0,2 para permitir pelo menos duas duplicações durante o crescimento de 4-5 h.<ol>
<li>Use um frasco de Fernbach perplexo para o crescimento para permitir a aeração adequada, um frasco de volume 2.8 L é suficiente. Menos aeração pode resultar em crescimento mais lento e pelota celular menor após a colheita.</li>
	</ol></li>
	<li>Verifique OD600 para se certificar de que a cultura está na fase de log (0,5-1) após 4-5 h de crescimento. Dependendo do crescimento da tensão, faça ajustes ao tempo de crescimento para permitir pelo menos duas duplicações. Adicione a 2% de galactose e cresça durante a noite em 30 °C shaker. Nota: O OD600 após o crescimento durante a noite pode variar, mas a cultura deve ser saturada. Note-se que as células não precisam ser removidas de 0,1% de glicose antes da adição de 2% de galactose para este protocolo de crescimento. Recomendamos a colheita de 3 OD de células não induzidas e induzidas nesta etapa para SDS-PAGE e mancha ocidental para verificação (Figura 3A,B, Pista 1-2).</li>
	<li>Colheas células por centrífuga a 4500 x g por 15 min. Um rotor balançando do balde que acomode a cultura do volume de 1 L pode ser usado aqui.</li>
	<li>Transfira a pelota do fermento em um tubo cónico de 50 mL; um segundo passo de centrífuga pode ser realizado conforme necessário. A pelota celular geralmente será em torno de 10-15 mL em volume medido por marcações de graduação e pode ser usado imediatamente ou armazenado a -80 °C.<ol>
<li>Resuspender a pelota em 15 mL purificação buffer (50 mM Tris pH 7.4, 300 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM Dithiothreitol (DTT), protease inibidor cocktail) para fazer volume final em torno de 30 mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Chill um homogeneizador 4 °C antes de usar e equilibrá-lo com tampão de purificação. Células de lyse usando um disruptor de células mecânicas ou homogeneizador. Amostra de carga no homogeneizador e lyse em 20.000-25.000 psi para 2-3 rodadas; note que, à medida que as células ficam lysed, mais pressão de entrada é necessária para manter 20.000-25.000 psi. Recolher o lysate celular em um tubo cônico de 50 mL no gelo. Nota: Se amostras adicionais precisarem ser lysed, o homogeneizador deve ser completamente limpo e equilibrado antes de carregar a próxima amostra. Mantenha todas as corsadas celulares no gelo.</li>
	<li>Imediatamente limpar o lysate celular em 35.000 x g para 1 h a 4 °C. Transfira cuidadosamente o supernatant em novo tubo. Note-se que os lipídios da lyse celular flutuarão até o topo durante a centrifugação e não afetarão a purificação. Nota: Recomendamos economizar 0,5-1% do lysate e pelota para amostras SDS-PAGE. Normalmente, não são observadas grandes diferenças e uma mancha ocidental adicional pode ser feita para confirmar a solubilidade proteica tap (Figura 4, Pistas 1 e 2, respectivamente).</li>
	<li>Equilibre 300 μL de contas de sefarof IgG com tampão de purificação. Adicione ao lysate de células limpas e incubada por 2 h, girando a 4 °C.</li>
	<li>Coletar contas em uma coluna de cromatografia de 10 mL e permitir que o lysate desvinculado flua completamente.</li>
	<li>Lave contas usando 10 mL de tampão de lavagem (50 mM Tris pH 7.4, 300 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2,1 mM DTT), adicionando 1 mL de cada vez e permitindo que flua completamente. Nota: Recomendamos economizar 2% das contas de IgG para a amostra SDS-PAGE. Normalmente, observamos quatro grandes bandas; duas proteínas SNX-BAR e IgG Heavy and Light Chains(Figura 4,Pista 3). Recomendamos economizar quantidades equivalentes de 'eluate' e 'contas IgG após TEV' para comparar para a eficiência de clivagem TEV.</li>
	<li>Coletar contas e transferi-los para um tubo de microcentrífuga. Adicione a 500 μL de volume total com tampão de lavagem fresca e 2 μL de 10 mg/mL TEV protease e incubar durante a noite, girando a 4 °C.</li>
	<li>Na manhã seguinte, retire o supernatant completamente usando uma agulha 27 G e avaliar a pureza da proteína por 10% poliacrilamida SDS-PAGE (Figura 4, Pista 4). Nota: Normalmente obtemos 500 μL de 0,5-1 mg/mL de 95% heterodemer puro (Figura 4,Pista 4). Purificação adicional usando resina de calmodulina também pode ser feito, no entanto, normalmente vemos uma redução significativa no rendimento e recomendamos parar aqui se a pureza é >90%. TEV não interfere com ensaios de ligação lipossoma, embora TEV pode adicionalmente ser removido usando Contas agarose Ni-NTA15.</li>
	<li>Para se concentrar, transfira a amostra para um filtro centrífuga de 0,5 mL com 10 kda de corte e centrífuga de acordo com as instruções do fabricante para 50 μL ou menos. Quantificar as proteínas concentradas usando o ensaio proteico bradford. Guarde a 4 °C e use dentro de uma semana.</li>
</ol>3. Preparação para Lipossoma
<ol><li>Comprar lipídios comercialmente disponíveis: fósforoarfrina (PS), PI3P, ergosterol e fosfatatidylcholine (PC). Se necessário, resuspender em solvente recomendado para fazer lipídios de ações. Nota: Os lipídios são resuspensos em uma mistura de metanol/clorofórmio por recomendações do fabricante. Certifique-se de estoques lipídicos são claras e aquecidas à temperatura ambiente antes de usar. Lipídios resuspendidos podem ser armazenados gás argônio e selados usando filme de cera (ou equivalente) a -20 °C por 6-12 meses ou até que a perda de atividade seja observada.</li>
	<li>Calcule o volume exigido de cada estoque lipídico para criar uma mistura com a composição lipídica desejada (ver Tabela 1). Assuma um total de 1 toupeira de lipídios na mistura lipídicas.</li>
	<li>Executar este passo em um capô de fumaça química. Limpe seringas de vidro elaborando um volume completo de seringa de clorofórmio e descartando-o em um recipiente de resíduos. Repita mais duas vezes. Ao transferir clorofórmio, use apenas seringas de vidro ou pipetas. Ao elaborar clorofórmio, puxe a rolha lentamente para evitar a introdução de bolhas de gás na seringa.</li>
	<li>Use seringas de vidro para transferir lipídios de estoque calculados em um tubo de cultura de vidro limpo para fazer uma mistura lipídica final de 1% PI3P, 20% ergosterol, 30% PS, PC (Tabela 1). Dependendo dos solventes cada lipídio é resuspendido, a mistura pode ficar turva após a adição de cada lipídio. Nota: Para variar as concentrações de PS (0-30%), ajustar os volumes em conformidade e compensar com pc variável (Tabela 1).</li>
	<li>Seque cuidadosamente a mistura lipídica usando gás nitrogênio direcionado à mistura lipídica em um movimento circular para secar lipídios uniformemente. Use o baixo fluxo de gás para manter os lipídios na parte inferior do tubo de vidro durante o processo de secagem. Envolva o tubo de cultura de vidro com papel alumínio, deixando a abertura descoberta, e desidratar ainda mais no vácuo por 1 h.</li>
	<li>Adicione 400 μL de buffer de ligação (50 mM Tris pH 7.4, 300 mM NaCl, 1 mM MgCl2)para desidratar completamente lipídios para fazer uma concentração liposoma final de 2,5 mM. Nota: A concentração lipossoma final pode ser ajustada adicionando mais ou menos tampão de ligação. Por exemplo, 200 μL tampão de ligação pode ser adicionado para produzir uma concentração de lipososoma de 5 mM, se necessário (veja abaixo).<ol>
<li>Suspender os lipídios agitando em velocidade média em um vórtice à temperatura ambiente por 30 min. Buffer deve aparecer nublado como lipídios são resuspensos.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfira lipossomas resuspendidos para um tubo de microcentrífuga. A partir deste ponto, as pontas de pipetas de plástico podem ser usadas como lipídios não são mais resuspensas em clorofórmio. Note-se que a solução de lipossoma deve parecer nublado.</li>
	<li>Liofreça-descongele lipossomos sete a oito vezes submergindo o tubo de microcentrífuga primeiro em nitrogênio líquido, depois em um banho de água de 37 °C. A mistura de lipossoma deve aparecer completamente congelada e sólida por olho antes de descongelar.</li>
	<li>Executar etapas envolvendo clorofórmio em um capô de fumaça química. Limpe duas seringas de vidro de 1 mL, elaborando e descartando volumes completos de seringa de clorofórmio, três vezes cada, para remover quaisquer lipídios residuais. Equilibre cada seringa de vidro com água ultrapura através da elaboração de dois volumes de seringas, em seguida, equilibrar com tampão de ligação através da elaboração de dois volumes de seringa.</li>
	<li>Monte o mini-extruso de acordo com as recomendações do fabricante. Equilibre uma membrana de 200 nm e duas peças de suportes de filtro (ver Tabela de Materiais),submergindo cada um em tampão de ligação.</li>
	<li>Sanduíche a membrana entre o filtro suporta e coloque no mini-extruso. Para reduzir o volume morto no mini-extruso montado e para se certificar de que a montagem é hermética, passe um volume de tampão de ligação comparável ao volume da mistura de lipossoma através de mini-extruso usando as seringas de vidro 1 mL.</li>
	<li>Use uma das seringas de vidro 1 mL e misture a mistura de lipososoma. Inverte o tubo de microcentrífuga para coletar o último da mistura de lipossoma na tampa do tubo para o desenho para a seringa de vidro.</li>
	<li>Extrude os lipossomos, passando pela membrana de 200 nm 19-21 vezes. Colete lipossomos extrudados em um novo tubo de microcentrífuga. Nota: Os lipossomos extruded devem parecer menos nebulosos do que lipossomos antes da extrusão. Os lipossomas devem ser usados no mesmo dia e armazenados no gelo. A última extrusão deve colocar lipossomas na seringa oposta à que começou.</li>
</ol>4. SNX-BAR Liposome Binding e Tubulation
<ol><li>Proteína purificada pré-clara a 100.000 x g em um ultracentrífuga por 20 minutos a 4 °C antes de realizar experimentos de ligação lipossoma e sedimentação. Retire o supernatant e transfira-o para um novo tubo de microcentrífuga; não perturbe a pelota se houver uma.</li>
	<li>Para realizar ensaios de encadernação lipossoma e tubulação, incubar 4 μM purificado Snx4-Atg20 e 2,5 mM lipossomos em um volume de reação total de 20 μL, variando o volume de lipossomas adicionados. Nota: No mesmo experimento, o mesmo volume de lipossomos deve ser usado.</li>
	<li>Incubar a reação a 30 °C por 30 min. Nota: Sugerimos maximizar a quantidade de lipossomos de 2,5 mM adicionados a cada reação usando nada menos que 10 lipossomas μL para permitir a visualização durante a sedimentação. Se 10 μL de 2,5 mM lipossomos é usado em uma reação de 20 μL, a concentração final de lipossomas será de 1,25 mM. Se as proteínas purificadas forem diluídas e for necessário mais volume para a proteína 4 μM, os lipídios podem ser resuspensos em 200 μL durante o passo de reidratação para dobrar a concentração de lipossomas (ver Passo 3.6); no entanto, isso vai exigir saber a concentração de proteínaantes de fazer os lipossomos.</li>
	<li>
Visualize e quantifique a tubulação dos lipossoma.
	<ol>
<li>Processe reações de ligação lipossoma imediatamente para análise de microscopia eletrônica. Detectar amostras em uma grade de malha de cobre revestida de carbono e mancha negativa usando acetato uranyl de 1%(Figura 5B)16.</li>
		<li>Analise amostras em um microscópio eletrônico de transmissão (200 kV).</li>
		<li>Use o software de análise de imagem para medir e quantificar o diâmetro do túbulo. Para quantificar com precisão o diâmetro do túbulo de um único tubule, tome três medições de diâmetro ao longo do comprimento de um tubule e média(Figura 5B). Nota: A análise biscada da variação foi usada para determinar o significado estatístico (Figura 5E). O acetato uranyl é radioativo e tóxico. A certificação apropriada da segurança do laboratório é exigida executar esta etapa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ligação e sedimentação de lipossoma.
	<ol>
<li>Transfira a reação (20 μL, do passo 4.3) para um tubo de centrífuga de policarbonato e use um rotor compatível para girar a 100.000 x g em um ultracentrífuga por 20 min a 4 °C. Retire cuidadosamente o supernatant e transfira para o novo tubo de microcentrífuga. Note-se que a pelota deve permanecer intacta.</li>
		<li>Resuspenda a pelota em SDS-PAGE 40 μL de buffer de amostra e transfira para um novo tubo de microcentrífuga. Adicione 20 μL de buffer de amostra para o supernatant. Carregar quantidades equivalentes de pelota e supernatant em um 10% poliacrilamida SDS-PAGE gel e realizar coloração Coomassie para visualizar SNX-BARs obrigados a lipossomas (Figura 5A).</li>
		<li>Para quantificar a quantidade de complexo SNX-BAR na fração de pelotas, quantifique as intensidades da banda usando densitometria e quantifique a proporção de proteínas SNX-BAR na fração de pelotas. Nota: A análise biscada da variação foi usada para determinar o significado estatístico (Figura 5C).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Teasdale, R. D., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+PX+%28phox-homology%29+domain+and+SNX+%28sorting+nexin%29+protein+families%3A+structures%2C+functions+and+roles+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Insights into the PX (phox-homology) domain and SNX (sorting nexin) protein families: structures, functions and roles in disease.</a> The Biochemical Journal. 441 (1), 39-59 (2012).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Retromer+Complex+and+Sorting+Nexins+in+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Retromer Complex and Sorting Nexins in Neurodegenerative Diseases.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 79(2018).</li>
<li>Burd, C., Cullen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retromer%3A+a+master+conductor+of+endosome+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Retromer: a master conductor of endosome sorting.</a> Cold Spring Harbor perspectives in Biology. 6 (2), (2014).</li>
<li>Chi, R. J., Harrison, M. S., Burd, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+endosome-derived+transport+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of endosome-derived transport carriers.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (18), 3441-3455 (2015).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+receptor+trafficking%3A+Retromer+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic+%28Copenhagen%2C+Denmark%29%22%5BJournal%5D)">Endosomal receptor trafficking: Retromer and beyond.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (8), 578-590 (2018).</li>
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<li>van Weering, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+SNX-BAR-mediated+assembly+of+distinct+endosomal+sorting+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for SNX-BAR-mediated assembly of distinct endosomal sorting tubules.</a> The EMBO Journal. 31 (23), 4466-4480 (2012).</li>
<li>Chi, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fission+of+SNX-BAR-coated+endosomal+retrograde+transport+carriers+is+promoted+by+the+dynamin-related+protein+Vps1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fission of SNX-BAR-coated endosomal retrograde transport carriers is promoted by the dynamin-related protein Vps1.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (5), 793-806 (2014).</li>
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<li>Purushothaman, L. K., Ungermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo+induces+retromer-mediated+membrane+remodeling+on+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Cargo induces retromer-mediated membrane remodeling on membranes.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2709-2719 (2018).</li>
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<li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+%28TAP%29+method%3A+a+general+procedure+of+protein+complex+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li>
<li>Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reliable+protein+extraction+from+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Rapid and reliable protein extraction from yeast.</a> Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).</li>
<li>Longtine, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additional+modules+for+versatile+and+economical+PCR-based+gene+deletion+and+modification+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).</li>
<li>Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+soluble+His%286%29-tagged+TEV+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease.</a> Methods in Molecular Biology. 498, 297-307 (2009).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+structure+of+lipoproteins+revealed+by+an+optimized+negative-staining+protocol+of+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 52 (1), 175-184 (2011).</li>
<li>Yong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+the+SNX1%2FSNX6+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of the SNX1/SNX6 complex.</a> Protein Expression and Purification. 151, 93-98 (2018).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Aqui, demonstramos um fluxo de trabalho otimizado para purificar os dimers SNX-BAR em levedura e dois ensaios para avaliar suas propriedades biofísicas em lipossomas sintéticos. A principal vantagem sobre a expressão típica de proteína recombinante em Escherichia coli ou outros sistemas é a capacidade de expressar uniformemente as proteínas SNX-BAR em um hospedeiro nativo, evitando assim as questões de toxicidade e insolubilidade encontradas na purificação de SNX-BARs em outros sistemas. Também é notável que o n...

Organelas ligadas à membrana, como a membrana plasmática, o retículo endoplasmico, o aparelho Golgi, o lisósoma (vacuole de levedura) e o endosome compõem o sistema de endosmembrana da célula eucariótica. A maioria das organelas tem a capacidade de comunicar e trocar material com outras organelas através de transportadores de transporte de vesículas. Como a célula coordena a embalagem e formação de transportadores de transporte de vesículas dentro do sistema de endosmembrana não é bem compreendida. No entanto, as proteínas e lipídios que constituem grande parte do sistema de endosmembrana são conhecidos por se originar de internalizar vesículas endócticas da membrana plasmática (PM). O endosome é o organela principal do acceptor para estas vesículas e é compreendido de jogos interconectados múltiplos de organelas tubulares. A principal função do endosome é facilitar a aquisição de nutrientes, regular o volume de negócios de proteínas e lipídios, proteger contra a infecção por patógenos e servir como a principal fonte de reposição de lipídios para a membrana plasmática. Como o endosome recebe a maior parte das proteínas de carga e lipídios da membrana plasmática, ele atua como um compartimento de triagem, isolando as cargas em transportadores de transporte endosômico tubular (ETCs). Quaisquer proteínas não seqüecidas em ETCs são deixadas para serem degradadas através do sistema endo-lossômico. A desregulação da classificação de carga em ETCs pode levar à perda de absorção de nutrientes, rotatividade de proteínas ou homeostase lipídica, resultando em inúmeras distúrbios metabólicos, de desenvolvimento e neurológicos1,2. No entanto, apesar do papel central dos ETCs no endossômico, o mecanismo subjacente de como o endossôpode pode coordenar seletivamente a embalagem de uma infinidade de cargas heterogêneas em portadores tubulares não é conhecido.
A família de triagem nexina (SNX) é uma classe evolutivamente conservada de proteínas que foram consideradas críticas para muitas reações de transporte de vesículana na célula3,4,5. A triagem de nexinas é recrutada para a membrana endossômica e ajuda na captura de carga através de seu domínio característico de homologia foscar (PX), que liga fosphatidylinositol-3-monofosfato (PtdIns(3)P), um lipídio enriquecido na membrana endossô. Mamíferos codificam trinta e três proteínas SNX, que podem ser ainda mais divididas em várias subfamílias, de acordo com a presença de outros domínios1. Mais notavelmente, a subfamília SNX-BAR é a maior subfamília composta por doze em humanos, enquanto no fermento em ascensão, Saccharomyces cerevisiae, a subfamília é reduzida para apenas sete SNX-BARs. As proteínas SNX-BAR têm um domínio PX e um domínio Bin-Anfiphysin-Rvs (BAR) que desencadeia reservatórios lipídicos para ligar membranas de curvatura positiva. Consequentemente, a família SNX-BAR tem uma afinidade natural com o endossôe e pode mediar a formação etc através de suas habilidades de remodelação da membrana. In vitro, as propriedades de remodelação dos SNX-BARs podem ser induzidas pela adição de SNX-BARs purificados a lipossomos sintéticos e a formação subsequente de tubulos estreitos e revestidos pode ser visualizada por microscopia eletrônica. Usando esses métodos, os pesquisadores determinaram que tanto a concentração de oligomerização quanto a força de constrição parecem variar entre a família SNX-BAR, sugerindo que eles poderiam ajudar tanto na formação quanto na scission dos ETCs.
Os SNX-BARs podem ser classificados ainda mais por suas propriedades exclusivas de dimerização. Ensaios e estudos estruturais in vitro vinculativos demonstraram que as proteínas SNX-BAR só podem formar homodimers ou heterodimers específicos. Portanto, em princípio, cada potencial dimer-oligomer SNX-BAR poderia fornecer um casaco tubule para uma via de tráfico específico de carga e, da mesma forma, a oligomerização restrita dos outros protomermers SNX-BAR, também pode definir caminhos de exportação distintos. No entanto, devido ao grande número de SNX-BARs e diversidade dentro da família SNX, uma hipótese de carga nexina-one de triagem é altamente improvável. Em vez disso, um esforço coordenado usando uma infinidade de fatores, como SNX-BARs, carga, especificidade lipídicas e outras dependências é mais provável. Da mesma forma, estudos recentes da família levedura SNX4 revelaram evidências de especificidade lipídica adicional, além de PtdIns (3)P, para potencializar transportadores de transporte endôssomo6. Neste estudo, SNX-BAR homodimer Mvp1-Mvp1 foi purificado de bactérias e heterodimers nativos Snx4-Atg20 e Vps5-Vps17 foram expressos e purificados em alto rendimento de levedura, enquanto apenas Snx4-Atg20 foi encontrado para ligar preferencialmente phosphatidylserine (PS) e forma estreita tubo-como estruturas em estudos de ligação liposome6. Enquanto outros no campo revelaram propriedades importantes dos SNX-BARs usando homodimers SNX-BAR recombinantemente purificados de bactérias, toxicidade associada à expressão heterodimers SNX-BAR em sistemas semelhantes têm dificultado a sua caracterização nativa7,8,9,10. Portanto, sem um sistema confiável para obter heterodimers nativos recombinantemente expressos, os pesquisadores devem renunciar a essas linhas de investigação. Na Figura 1,apresentamos um fluxo de trabalho em quatro partes para 1) construímos uma cepa de levedura superexpressando heterodimers SNX-BAR para purificação de afinidade tandem, 2) expressar e purificar heterodimers nativos SNX-BAR, 3) preparar lipossomos sintéticos unilamellares, e 4) configurar uma tubulação liossoma ou ensaio sedimentações, fornecendo uma ferramenta vital para os pesquisadores para investigar o catálogo crescente de nexinos classificação encontradona natureza.

<table><tbody><tr><td>0,2 &mu; m Membranas PC</td><td>Avanti</td><td>610006</td><td></td></tr><tr><td>coluna de cromatografia Poly-Prep de 10 mL (Bio-Rad)</td><td>Agulha Bio-Rad</td><td>731-1550</td><td></td></tr><tr><td>27 G</td> BD <td>Biosciences</td><td>301629</td><td></td></tr><tr><td>Filtro ultracentrífugo Amicon com corte de 10K</td><td>Amicon</td><td>UFC501024</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador Avestin EmulsiFlex-C3 Ensaio</td><td>Avestin</td><td>EF-C3</td><td></td></tr><tr><td>BCA</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Optima MAX-XP Ultracentrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>393315</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de Protease Completo Coquetel</td><td>Roche</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>DOPS</td><td>Avanti</td><td>840035</td><td></td></tr><tr><td>Ergosterol (Sigma)</td><td>Sigma</td><td>47130-U</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de Extrusora com Bloco 0.2 &mu; L/1 mL</td><td>Avanti</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>FEI Tecnai F20 microscópio eletrônico de transmissão (200 kV)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cultura de vidro</td><td>VWR</td><td>47729-570</td><td></td></tr><tr><td>IgG sepharose beads (GE Healthcare)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0969-01</td><td></td></tr><tr><td>Seringas de vidro microltro</td><td>Hamilton</td><td>7637-01</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Excella E25</td><td>Eppendorf</td><td>M1353-0000</td><td>ou equivalente com agitação de 30 graus; C</td></tr><tr><td>Ni-NTA Magnetic Agarose Beads</td><td>Pierce</td><td>78605</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94516</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>VWR</td><td>52858-076</td><td></td></tr><tr><td>PI3P</td><td>Echelon</td><td>P-3016</td><td>ou Echelon equivalente</td></tr><tr><td>Conjunto de garrafa de policarbonato</td><td>Beckman Coulter</td><td>355622</td><td></td></tr><tr><td>TLA-100 Ângulo fixo Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>343840</td><td></td></tr><tr><td>Tipo 45 Ti Rotor</td> Dessecador a vácuo <td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, fundo e tampa com válvula de soquete</td><td>VWR</td><td>75871-436</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de vácuo Alcatel (Pascal 2005 C1)</td><td>A& J Vacuum</td><td>PN07050</td><td></td></tr><tr><td>Vortex com suporte de espuma</td><td>VWR</td><td>10153-838</td><td></td></tr><tr><td>KIT VWR MICROTUBE</td><td>VWR</td><td>12620-880</td><td></td></tr></tbody></table>

expressão, purificação e ligação lipossoma dos heterodimers brotamentos do snx-bar do fermento

Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers

As proteínas SNX-BAR são uma classe evolutivamente conservada de proteínas de remodelação da membrana que desempenham papéis fundamentais na triagem e tráfico de proteínas e lipídios durante a endocitose, classificação dentro do sistema endosômico e autofagia. Central para a função de proteína SNX-BAR é a capacidade de formar homodimers ou heterodimers que ligam membranas usando altamente conservado phox-homologia (PX) e BAR (Bin / Anfiphysin / Rvs) domínios. Além disso, a oligomerização dos dimers SNX-BAR nas membranas pode provocar a formação de túbulos e vesículas de membrana e esta atividade é pensada para refletir suas funções como proteínas de revestimento para transportadores de transporte derivados do endosome. Os investigadores têm utilizado por muito tempo estudos de ligação in vitro usando proteínas recombinantes de SNX-BAR em lipossomos sintéticos ou vesículas unilamellares gigantes (GUVs) para revelar a composição precisa dos lipids necessários para conduzir a remodelação da membrana, assim revelando seu mecanismo da ação. No entanto, devido a desafios técnicos com sistemas de dupla expressão, toxicidade da expressão de proteína SNX-BAR em bactérias e falta de solubilidade de proteínas SNX-BAR individuais, a maioria dos estudos até o momento examinaram homodimers SNX-BAR, incluindo dimers não fisiológicos que se formam durante a expressão em bactérias. Recentemente, otimizamos um protocolo para superar as principais deficiências de um sistema típico de expressão bacteriana. Usando este fluxo de trabalho, demonstramos como expressar e purificar com sucesso grandes quantidades de heterodimers SNX-BAR e como reconstituí-los em lipossomos sintéticos para ensaios de ligação e tubulação.

Este protocolo descreve um método para a produção reproduzível e robusta de complexos endógenos de levedura SNX-BAR que podem ser usados para ensaios de remodelação da membrana a jusante (Figura 1). A construção da cepa de levedura utilizada para purificação aproveita a eficiência da recombinação homóloga no fermento em brotamento, permitindo modificações nos loci genômicos dos SNX-BARs alvo (Figura 2). Este projeto tem duas vant...

Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho para a expressão, purificação e ligação liposoma de heterodimers SNX-BAR em levedura.

Expressão, purificação e ligação lipossoma dos heterodimers brotamentos do SNX-BAR do fermento

SNX-BAR proteins are an evolutionarily conserved class of membrane remodeling proteins that play key roles in sorting and trafficking of protein and ...

SNX-BARs são proteínas de remodelação de membranas que desempenham papéis-chave na doença humana. Usando nossos métodos, podemos determinar suas propriedades biofísicas precisas para facilitar a ligação lipídica e a remodelação da membrana. A purificação das proteínas SNB-BAR das células de levedura permite a aquisição de dimers homo nativos e hetero SNX-BAR, minimizando a toxicidade e insolubilidade frequentemente encontradas com sistemas de expressão não-nativos.Nossos métodos podem ser usados para entender as especificidades lipídicas de todas as leveduras SNX-BARs ou para produzir proteínas SNX-BAR recombinantes de qualquer outro organismo. Um conjunto de extrusor correto é essencial para evitar a perda de lipossomos durante o processo de extrusão. Para os alunos iniciantes ou aqueles novos no campo, observar visualmente os passos mais críticos melhorará muito suas chances de sucesso.Comece inoculando um grande cotonete de células de levedura em um frasco pelo menos quatro vezes o volume da cultura contendo 50 mililitros de YP médio padrão complementados com 2% raffinose e 0,1% de glicose como fonte de carbono e crescer a cultura durante a noite em um shaker Celsius de 30 graus. Na manhã seguinte, inocular a pré-cultura de 50 mililitros em um litro de média YP padrão com 2%raffinose e 0,1% de glicose em um volume de 2,8 litros confundiu o frasco de Fernbach por uma cultura de quatro a cinco horas na incubadora de agitação. Quando a densidade óptica em 600 nanômetros atingir 0,2, adicione galactose a uma concentração final de 2% às células para uma cultura noturna na incubadora de agitação.Na manhã seguinte, colde células por centrifugação e transfira a pelota de levedura para um tubo cônico de 50 mililitros. Resuspengue a pelota em 15 mililitros de tampão de purificação para obter um volume final de cerca de 30 mililitros e carregue a suspensão da célula em um homogeneizador refrigerado a quatro graus Celsius. Lyse as amostras de 20 a 25.000 libras por polegada quadrada por duas a três rodadas e transfira o lysate para um novo tubo cônico de 50 mililitros no gelo.Limpe imediatamente o lisecelular por centrifugação e transfira cuidadosamente o sobrenante para um novo tubo. Em seguida, equilibre 300 microliters de contas IgG Sepharose com três re-suspensões no tampão de purificação antes de adicionar as contas ao lysate celular limpo para uma incubação de duas horas com rotação a quatro graus Celsius. No final da incubação, adicione as contas a uma coluna de cromatografia de 10 mililitros e permita que o lysate desvinculado flua.Lave as contas 10 vezes com um mililitro de tampão de lavagem por lavagem, permitindo que cada lavagem flua completamente antes de adicionar o próximo volume. Após a última lavagem, use uma pipeta e um tampão fresco para transferir as contas para um tubo de microcentrifutura. Leve o volume total das contas para 500 microliters com tampão de lavagem fresco e remova as contas do lysate com dois microliters de 10 miligramas por mililitro TEV protease para uma incubação noturna com rotação a quatro graus Celsius.Na manhã seguinte, use uma agulha de calibre 27 para remover completamente o sobrenante e avaliar a pureza proteica por 10% de policlamida página SDS. Em seguida, quantifique as proteínas concentradas usando o ensaio proteico de Bradford de acordo com os protocolos padrão e armazene a proteína por até uma semana a quatro graus Celsius. Para preparar os lipossomos, use seringas de vidro para transferir lipídios de estoque para um tubo de cultura de vidro limpo para alcançar uma mistura lipídica final de 1%fosfaticdylinositol-3-fosfato, 20% ergosterol, 30% fosfatidylserina, fosfatidylcholina como descrito na tabela.Dependendo dos solventes em que cada lipídio é resuspendido, a mistura pode ficar nublada após a adição de cada lipídio. Seque cuidadosamente as misturas lipídicas direcionando gás nitrogênio de baixo fluxo para as misturas em um movimento circular para tratar os lipídios uniformemente na parte inferior do tubo de vidro. Em seguida, enrole o tubo de cultura de vidro com papel alumínio deixando a abertura descoberta e desidratando ainda mais os lipídios no vácuo por uma hora.No final da incubação, adicione 400 microliters de tampão de ligação a cada frasco para reidratar completamente os lipídios em uma concentração lipossa final de 2,5 mililitros antes de reutilizar os lipídios em velocidade média em um vórtice à temperatura ambiente por 30 minutos. O tampão deve ficar nublado à medida que os lipídios são resuspended. Transfira os lipossomos resuspendados para um tubo de microcentrífuga e congele os tubos em nitrogênio líquido seguido de descongelamento em um banho de água de 37 graus Celsius sete a oito vezes.Em um capô de fumaça química, limpe duas seringas de vidro de um mililitro com um volume total de clorofórmio três vezes por seringa para remover quaisquer lipídios residuais e equilibrar cada seringa com dois volumes de água ultrauso e dois volumes de tampão de ligação. Monte um mini-extrusor de acordo com as recomendações do fabricante. Em seguida, submergir dois pedaços de suporte de filtro em uma membrana de 200 nanômetros em tampão de ligação.É importante montar o mini-extrusor para que ele seja completamente hermético. E uma boa maneira de verificar se há vazamentos é passar buffer através do dispositivo. Sanduiche a membrana entre os suportes do filtro e coloque a membrana no mini-extrusor.Usando uma das seringas de um mililitro equilibrado, passe um volume de tampão de ligação semelhante ao volume da mistura lipossorosa através do mini-extrusor e use a outra seringa para soltar a mistura lipossa invertendo o tubo de microcentrifuuge para coletar o último dos lipossomos na tampa do tubo para sua coleta. Em seguida, extrude os lipossomos através da membrana de 200 nanômetros 19 a 21 vezes e colete os lipossomos extrudados em um novo tubo de microcentrífuga. Antes de realizar os ensaios de ligação lipossomo SNX-BAR e ensaios de tubulação, pré-limpe a proteína purificada por ultracentrifugação e transfira o supernatante para um novo tubo de microcentrifuuagem sem perturbar a pelota.Em seguida, incubar quatro micromolar de SNX4-ATG20 purificados e 2,5 mililitros de lipossomos em um volume total de reação de 20 microliters para uma incubação de 30 minutos a 30 graus Celsius. Para visualizar e quantificar a tubulação lipossa, no final da incubação, localize imediatamente as amostras em uma grade de malha de cobre revestida de carbono e mancha negativa com acetato de 1%uranyl. Em seguida, analise as amostras em um microscópio eletrônico de transmissão a 200 kilovolts.Para ligação liposódica e sedimentação, transfira 20 microlitadores da reação para um tubo de centrífuga de policarbonato e gire a amostra com um roteador compatível em uma ultracentrifuagem. No final da centrifugação, transfira cuidadosamente o supernante para um novo tubo de microcentrifuuagem e resuspenda a pelota em 40 microliters de buffer de amostra de página SDS. Transfira a suspensão da pelota para um novo tubo de microcentrifuuagem e adicione 20 microliters de tampão de amostra ao supernascer.Em seguida, carregue volumes de amostras equivalentes de pelota e supernascer em um gel de página SDS de 10% de poliacrilamida e execute a coloração coomassie para visualizar os SNX-BARs ligados aos lipossomos. Para verificar se há indução adequada da expressão SNX-BAR, uma mancha ocidental contra a etiqueta de purificação de afinidade tandem pode ser usada, pois os níveis de proteína dos SNX-BARs podem não ser detectados através da mancha de Coomassie. Após a purificação do heterodimer SNX-BAR, as bandas dos dois SNX-BARs devem aparecer em uma relação estequiométrica de um para um e deve haver pouca ou nenhuma banda contaminante.Nesta análise representativa, os heterodimers SNX-BAR foram expressos, purificados e ligados a lipossomos sintéticos como demonstrado. Note que o MVP1 formou homodimers e foi expresso em bactérias como esperado. A ligação SNX-BAR a diferentes composições lipossas poderia ser quantificada por densitometria para avaliar os efeitos da fosfatidíserina, por exemplo, na ligação lipossosom.A imagem de microscopia eletrônica permite a medição de túbulos lipossois SNX4-ATG20 com a maioria dos túbulos tipicamente possuindo diâmetros entre 14 e 26 nanômetros. Observe que sNX-BARs purificados podem ser reconstituídos com complexos de captura de carga em lipossomos para entender como montagens completas podem influenciar a remodelação da membrana. Ao comparar a ligação de diferentes combinações de dimers SNX-BAR purificados com lipossomos sintéticos compostos por liposetos diferentes, as proteínas SNX-BAR foram encontradas possuindo preferências distintas de ligação lipídica.Sempre trabalhe em um capô ao manusear clorofórmio e certifique-se de usar o EPI adequado ao manusear afiadas ou material de vidro.

expression-purification-liposome-binding-budding-yeast-snx-bar

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

MITO permite a detecção de interações sensíveis transitória e estável entre as proteínas que são expressas no modelo de Saccharomyces cerevisiae organismo. Tem sido aplicado com sucesso para estudar exógenos e leveduras proteínas integrais da membrana, a fim de identificar seus parceiros interagem de uma forma de alto rendimento.

Split-Ubiquitina Yeast Membrana Baseado Two-Hybrid (MITO) do sistema: uma ferramenta poderosa para identificação de interações proteína-proteína

A preparação de extractos de células de alta qualidade de levedura é um primeiro passo necessário para a análise de proteínas individuais ou proteomas inteiros. Aqui nós descrevemos um protocolo de homogeneização rápido, eficiente e confiável para as células de levedura de brotamento que foi otimizado para preservar as funções da proteína, interações e modificações pós-traducionais.

Brotando Yeast extração e purificação de proteínas para o estudo da função, interações e modificações pós-traducionais

Este manuscrito descreve a detecção de sumoylation e ubiquitinação de proteínas cinetócoro, Ndc10 e Ndc80, na levedura Saccharomyces cerevisiae brotamento.

Técnica de purificação de proteína que permite a detecção de SUMOilação e Ubiquitination de brotamento Yeast kinetochore Proteínas Ndc10 e Ndc80

Fornecemos um método básico reprodutível para a microscopia de longo prazo do ciclo de vida sexual da levedura de fissão. Com pequenos ajustes descritos, o protocolo apresentado permite que a pesquisa se concentre em diferentes etapas do processo reprodutivo.

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Única molécula fluorescência In Situ Hybridization (smFISH) análise em Budding fermento crescimento vegetativo e meiose

Processamento em lote de telas 2-híbrido de levedura permite a comparação direta dos perfis de interação de várias proteínas de isca com um conjunto altamente complexo de proteínas da fusão de rapina. Aqui, descrevemos como implementar sua utilização para tais telas, novos reagentes e métodos refinados.

Uma tela de 2-híbrido de levedura em lote para comparar as interações da proteína

Um procedimento de isolamento de RNA em tandem (viagem) para recuperação de complexos mRNA-proteínas endogenamente formado é descrito. Especificamente, complexos de RNA-proteína são quitosana na vivo, polyadenylated RNAs são isolados de extratos com grânulos de oligo (descolamento) e particulares mRNAs são capturados com modificados oligonucleotides antisentidos do RNA. Proteínas vinculadas a mRNAs são detectadas pela análise de immunoblot.

Um procedimento de isolamento de RNA em Tandem do Oligonucleotide-baseado para recuperar complexos mRNA-proteínas eucariotas

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Aqui, descrevemos a utilização do Grafix (Gradient Fixation), uma centrifugação de gradiente de glicerol na presença de um crosslinker, para identificar interações entre fatores de emenda que se ligam transitoriamente ao complexo de emendas.

Utilização de Grafix para a detecção de Interagentes Transintes de Saccharomyces cerevisiae Subcomplexos Spliceosome

O ensaio ACT1-CUP1, um ensaio de crescimento de cobre, fornece uma leitura rápida do splicing de RNA mensageiro precursor (pré-mRNA) e do impacto que os fatores de splicing mutantes têm na função spliceossomal. Este estudo fornece um protocolo e destaca a personalização possível para abordar a questão do splicing de interesse.

Ensaios de ACT1-CUP1 determinam as sensibilidades específicas do substrato de mutantes spliceossomais em leveduras em brotamento

Este protocolo descreve as etapas essenciais para a realização de campanhas de seleção de exibição de superfície de levedura para enriquecer as variantes de proteína que se ligam a um antígeno de interesse.

Engenharia de proteínas por exibição de superfície de levedura

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