Avaliação in vitro da função cardíaca usando cardiomócitos esfolados

Essa técnica permite o esclarecimento da fisiopatologia das doenças cardíacas por meio da investigação da correlação entre parâmetros in vitro e in vivo em modelos animais e humanos. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o estudo da função do miofilamento profundo usando biópsias muito pequenas ou amostras que foram armazenadas congeladas. Esta técnica permite avaliar in vitro o impacto de intervenções terapêuticas nos miofilamentos.

Antes de tentar um experimento, é aconselhável praticar a extração de cardiomiócitos algumas vezes para aprender a selecionar, colar e ativar os cardiomiócitos com bom tamanho, estrias e forma. Antes de iniciar o procedimento, ajuste a temperatura do aparelho de teste na câmara para 15 graus Celsius e ligue o transdutor de força e o motor. Descongele de três a cinco microgramas de amostra miocárdica em uma placa de Petri contendo 2,5 mililitros de solução ISO relaxante e use um bisturi para cortar com precisão o tecido em pequenos pedaços sem causar danos celulares desnecessários.

Quando todo o tecido tiver sido cortado, use uma ponta de pipeta cortada para transferir todo o volume de solução e fragmentos de tecido para um copo Potter-Elvehjem e use um moedor para romper mecanicamente o tecido em 30 a 40 rotações por minuto. Quando uma boa suspensão celular for obtida, adicione 250 microlitros de Triton a um tubo de 15 mililitros contendo 2,25 mililitros de ISO de relaxamento e adicione a suspensão celular à solução resultante. Inverta suavemente o tubo três vezes para misturar e deixe o tubo descansar em temperatura ambiente por um minuto, seguido de uma incubação de quatro minutos no gelo.

No final da incubação do gelo, aumente o volume final do tubo para 15 mililitros com ISO de relaxamento adicional e misture os tubos três vezes por inversão, conforme demonstrado, centrifugue as células e remova cuidadosamente quase todo o líquido, exceto os últimos três mililitros do sobrenadante. Após a última lavagem, remova o sobrenadante até um volume de cinco a 10 mililitros de suspensão celular. Para a seleção de cardiomiócitos esfolados, adicione uma gota de suspensão celular em uma lamínula colocada em cima de uma lâmina de vidro em um suporte de lâmina de microscópio invertido e use a objetiva 20X para selecionar um único cardiomiócito em forma de bastonete com um bom padrão de estrias e tamanho.

Use as duas mãos para girar a lamínula até que o cardiomiócito selecionado esteja posicionado horizontalmente com suas extremidades alinhadas com a agulha do transdutor de força e o motor e use uma ponta de pipeta para colocar uma linha fina de cola ao longo da lateral da lamínula. Para colar a célula no lugar, mergulhe as pontas da agulha do transdutor de força e do motor na linha de cola para criar um halo de cola ao redor de ambas as pontas e mova rapidamente a ponta da agulha do transdutor de força para baixo para que ele cole em uma borda do cardiomiócito. Repita este procedimento com a ponta do motor e a outra extremidade da célula.

Após cinco a oito minutos, mova os dois micromanipuladores simultaneamente para levantar as agulhas cerca de 15 micrômetros para evitar colar a célula na lamínula. Para medir as forças ativas e passivas e a sensibilidade ao cálcio, encher o primeiro poço experimental com 55 a 100 microlitros de solução relaxante e encher o segundo poço experimental com 55 a 100 microlitros de solução ativadora. Usando o software da câmera, defina a região de interesse para uma área do cardiomiócito com um padrão claro de estrias e defina o comprimento do sarcômero para 2,2 micrômetros.

Meça a distância entre os dois extremos do cardiomiócito e registre o valor como o comprimento do miócito no software. Em seguida, mova as agulhas um pouco mais alto e mova suavemente o estágio do microscópio para que a célula se mova da lamínula para o poço que contém a solução relaxante na parte de trás do estágio. Selecione o protocolo que contém o encurtamento de duas células para ocorrer quando a célula emergir sequencialmente nas soluções de cálcio e relaxante.

Para provocar uma contração isométrica, mova o estágio do microscópio para que o cardiomiócito se mova da solução relaxante para a solução ativadora. Ao atingir o platô de força, comece a registrar os dados de força. Após 10 segundos, mude a célula para a solução relaxante e registre os dados até que o teste pare.

Para determinar a sensibilidade ao cálcio, substitua a solução de ativação por 55 a 100 microlitros de cada solução de cálcio e registre os dados conforme demonstrado. Ao final da medição, estique as pontas do transdutor de força e do motor para retirar as agulhas da célula e use um cotonete embebido em acetona para remover cuidadosamente o halo de cola das pontas das agulhas. Embora um certo grau de deterioração e diminuição da força seja esperado após experimentos prolongados, os valores de tensão ativa dentro dos cardiomiócitos permeabilizados funcionais devem ser relativamente estáveis.

Aqui, são mostrados traços de força representativos de três dos oito registros de força necessários para realizar um protocolo de sensibilidade ao cálcio do miofilamento. Ao transferir a célula para um poço contendo a solução ativadora, os cardiomiócitos começam a desenvolver força até atingir um platô. Após um teste rápido de folga, os valores basais de força zero podem ser obtidos.

A inclinação da última parte desta curva pode ser usada para determinar o valor da taxa de redesenvolvimento da força, que é uma medida da taxa aparente de fixação e desprendimento da ponte. Depois de transferir a célula de volta para um poço contendo a solução relaxante, a célula relaxa e sua força cai. Além da sensibilidade ao cálcio do miofilamento e das medições de ativação dependentes do comprimento, as dependências do comprimento do sarcômero da tensão passiva e as dependências do comprimento do sarcômero da força ativada pelo cálcio por área da seção transversal e a tensão independente do cálcio podem ser calculadas.

Por fim, é importante ressaltar que a forma como os cardiomiócitos são isolados impacta significativamente nos resultados. O uso de cardiomiócitos esfolados para avaliar a função cardíaca in vitro é uma técnica importante para esclarecer as alterações que ocorrem no nível celular, bem como para estudar os mecanismos do miofilamento em diferentes condições fisiológicas e patológicas. Esse método tem a vantagem de exigir uma quantidade mínima de amostra miocárdica e permitir o uso de cardiomiócitos de uma ampla variedade de espécies, localizações cardíacas e patologias.