Name: Preparação das mitocôndrias dos tecidos do câncer de ovário e controle dos tecidos ovarianos para análise quantitativa proteômica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Aprenda a isolar e purificar mitocôndrias de tecidos de câncer de ovário e controles usando centrifugação diferencial e gradiente de densidade. Este método viabiliza análises proteômicas quantitativas de alta qualidade.

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Este trabalho foi apoiado pelo Hunan Provincial Hundred Talent Plan (para X.Z.), o Xiangya Hospital Funds for Talent Introduction (to XZ), a National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81572278 e 81272798 to XZ), as doações da China "863" Plan Projeto (Grant No. 2014AA020610-1 para XZ), e a Hunan Provincial Natural Science Foundation of China (Grant No. 14JJ7008 to XZ). X.Z. concebeu o conceito para o presente manuscrito, obteve os dados de proteômica quantitativa iTRAQ de amostras de mitocôndrias, escreveu e revisou o manuscrito, coordenou o trabalho pertinente e foi responsável pelo apoio financeiro e correspondente Trabalho. H.L. preparou amostras de mitocôndrias. A S.Q. participou de trabalhos parciais. X.H.Z participou de escrever e editar o idioma inglês. N.L. analisou os dados de proteômica iTRAQ. Todos os autores aprovaram o manuscrito final.

Amostras de tecido ovariano, incluindo tecidos de câncer de ovário (n = 7) e controle normal tecidos ovarianos (n = 11) foram utilizados para este protocolo. O protocolo atual3,4,5 é aprovado pelo Comitê de Ética Médica do Hospital Xiangya da Universidade Central do Sul, na China.
1. Preparação de mitocôndrias de tecidos humanos de câncer de ovário
<ol><li>Prepare 250 mL do amortecedor mitocondrial da isolação misturando o mannitol de 210 mM, 70 mM sacarose, 100 mM cloreto de potássio (KCl), 50 mM Tris-HCl, 1 mM diamina ácido tetraacético (EDTA), 0,1 mM etileno glicol bis (2-aminoetileno ether) ácido tetraástico (EGTA), 1 mMM inibidor da protease de fenilmetanosulfonyl (PMSF), 2 mM ortovanadate de sódio (V) e 0,2% albumina de soro bovina (BSA), pH 7.4.</li>
	<li>Coloque ~ 1,5 g de tecidos de câncer de ovário em um prato de vidro limpo.</li>
	<li>Adicione 2 mL do amortecedor de isolamento mitocondrial pré-refrigerado para lavar levemente o sangue da superfície do tecido 3x.</li>
	<li>Use uma tesoura oftalmocal limpa para picar totalmente o tecido em cerca de 1 mm3 pedaços, e transfira os tecidos picados em um tubo de centrífuga de 50 mL.</li>
	<li>Adicione 13,5 mL de tampão de isolamento mitocondrial contendo 0,2 mg/mL nagarse e, em seguida, use um homogeneizador elétrico para homogeneizar (escala de uso 2, 10 s 6x, intervalo 10 s) os tecidos picados (2 min, 4 °C).</li>
	<li>Adicione mais 3 mL de isolamento mitocondrial tampão no tecido homogeneia e misturá-los bem por pipetting.</li>
	<li>Centrífuga o tecido preparado homogeneizar (1.300 x g,10 min, 4 °C). Retire a fração nuclear bruta (ou seja, a pelota) e manter o supernatant.</li>
	<li>Recentrifuge o supernatant (10.000 x g,10 min, 4 °C). Retire os microssomos (ou seja, o supernatant) e manter a pelota.</li>
	<li>Adicione 2 mL de tampão de isolamento mitocondrial e resuspender o poço de pelota por pipetting luz.</li>
	<li>Centrífuga a suspensão de pelotas (7.000 x g,10 min, 4 °C). Descarte o supernatant e mantenha as mitocôndrias cruas (ou seja, a pelota).</li>
	<li>Adicione 12 mL de 25% de gradiente de densidade médio (ou seja, Nycodenz) para resuspender as mitocôndrias brutas extraídas.</li>
	<li>Faça um gradiente de densidade descontínuo, enchendo um tubo de baixo para cima com 5 mL de 34%, 8 mL de 30%, 12 mL de 25% (contendo as mitocôndrias brutas do passo 1.11), 8 mL de 23%, e 3 mL de 20% de gradiente de densidade médio, e centrífuga -lo (52.000 x g, 90 min, 4 °C).</li>
	<li>Use uma seringa longa e contundente para coletar as mitocôndrias purificadas na interface entre o meio de gradiente de densidade de 25% e 30% em um tubo limpo.</li>
	<li>Adicione o amortecedor mitocondrial da isolação nas mitocôndrias coletadas para diluí-la a um volume de três vezes. Centrífuga (15.000 x g,20 min, 4 °C) e descarte o supernatant.</li>
	<li>Adicione 2 mL de isolamento mitocondrial tampão para resuspender a pelota, e centrífuga (15.000 x g,20 min, 4 °C). Descarte o supernatant e mantenha a pelota.</li>
	<li>Recolher a pelota final (ou seja, as mitocôndrias purificadas) e armazená-lo em -20 °C. NOTA: Combine todas as mitocôndrias purificadas do tecido do câncer de ovário como a amostra mitocôndria para análise proteômica quantitativa.</li>
</ol>2. Preparação de mitocôndrias de tecidos ovarianos de controle humano
<ol><li>Prepare 250 mL do amortecedor mitocondrial da isolação como descrito na etapa 1.1.</li>
	<li>Coloque ~ 1,5 g dos tecidos ovarianos controle normal em um prato de vidro limpo.</li>
	<li>Adicione 2 mL de tampão de isolamento mitocondrial pré-refrigerado para lavar levemente o sangue da superfície do tecido 3x.</li>
	<li>Use uma tesoura oftalmocal limpa para picar totalmente o tecido em cerca de 1 mm3 pedaços, e transfira os tecidos picados em um tubo de centrífuga de 50 mL.</li>
	<li>Adicione 8 mL de 0,05% de trippsina/20 mM EDTA em soro soro lógico amortecida com fosfato (PBS) aos tecidos de controle picados e digere (30 min, temperatura ambiente), o que ajuda a lixir os tecidos e células e liberar mitocôndrias. Em seguida, centrífuga (200 x g, 5 min). Descarte o supernatant, e manter os tecidos e células.</li>
	<li>Adicione 13,5 mL de tampão de isolamento mitocondrial contendo 0,2 mg/mL nagarse e, em seguida, use um homogeneizador elétrico para homogeneizar (escala de uso 2, 10 s 6x, intervalo 10 s) os tecidos picados (2 min, 4 °C).</li>
	<li>Adicione mais 3 mL de isolamento mitocondrial tampão no tecido homogeneia e misturá-los bem por pipetting.</li>
	<li>Centrífuga o tecido preparado homogeneizar (1.300 x g,10 min, 4°C). Retire a fração nuclear bruta (ou seja, a pelota) e manter o supernatant.</li>
	<li>Recentrifuge o supernatant (10.000 x g,10 min, 4°C). Retire os microssomos (ou seja, o supernatant) e manter a pelota.</li>
	<li>Adicione 2 mL de tampão de isolamento mitocondrial para resuspender o poço de pelota por pipetting luz.</li>
	<li>Centrífuga a suspensão de pelotas (7.000 x g,10 min, 4 °C). Descarte o supernatant e mantenha as mitocôndrias cruas (ou seja, a pelota).</li>
	<li>Adicione 12 mL de 25% de gradiente de densidade médio para resuspender as mitocôndrias brutas extraídas.</li>
	<li>Faça um gradiente de densidade descontínuo, preenchendo um tubo de baixo para cima com 8 mL de 38%, 5 mL de 34%, 8 mL de 30%, 12 mL de 25% (contendo as mitocôndrias brutas do passo 2,12), 8 mL de 23%, e 3 mL de 20% de densidade gradiente médio, e centrífuga -lo (52.000 x g, 90min, C4).</li>
	<li>Use uma seringa longa e contundente para coletar as mitocôndrias purificadas na faixa, desde a interface entre 25% e 30% até a interface entre 34% e 38% em um tubo limpo.</li>
	<li>Adicione o amortecedor mitocondrial da isolação nas mitocôndrias coletadas para diluí-la a um volume de três vezes. Centrífuga (15.000 x g,20 min, 4 °C) e descarte o supernatant.</li>
	<li>Adicione 2 mL de tampão de isolamento mitocondrial para resuspender a pelota, e centrífuga (15.000 x g,20 min, 4 °C). Descarte o supernatant e mantenha a pelota.</li>
	<li>Recolher a pelota final (ou seja, as mitocôndrias purificadas) e armazená-lo em -20 °C. NOTA: Combine todas as mitocôndrias purificadas do tecido ovariano controle como as amostras mitocondriais para análise proteômica quantitativa.</li>
</ol>3. Verificação da qualidade das amostras mitocondriais de tecido purificado
<ol><li>Pegue um tubo de amostras mitocondriais purificadas (ou seja, as pelotas dos tecidos de câncer de ovário do passo 1.16 e os tecidos ovarianos controle do passo 2.17) para verificação com microscopia eletrônica (EM). NOTA: O protocolo detalhado foi descrito anteriormente15,16.</li>
	<li>Prepare o amortecedor de extração de proteína mitocondrial misturando 8 M ureia, 2 M thiourea, 40 mM Tris, 1 mM EDTA, 130 mM dithiothreitol (DTT), e 4% (w:v) 3-(3-cholamidopropyl) dimmethylammonio)-1-propanesulfonate (CHAPS). Ajuste o pH para 8,52.</li>
	<li>Pegue um tubo de amostras mitocondriais purificadas (ou seja, as pelotas dos tecidos de câncer de ovário no passo 1.16 e os tecidos ovarianos controle no passo 2.17) e adicione o amortecedor de extração de proteína mitocondrial (amostras mitocondriais ao buffer de extração de proteínas, 1:5) suspender a pelota. Congele as amostras em nitrogênio líquido 3x e guarde à temperatura ambiente por 2 h.</li>
	<li>Centrífuga a 12.000 x g,30 min, 4 °C, coletar o supernatant (ou seja, a amostra de proteína mitocondrial extraída), e medir o teor de proteína com um ácido bicinchoninic (BCA) kit de ensaio de proteína.</li>
	<li>Prepare 50 mL de 1,5 M Tris-HCl (pH 8.8) misturando 9,08 g de Tris e 40 mL de ddH2O, ajustando o pH para 8,8 usando HCl, e adicionando ddH2O a um volume final de 50 mL. Guarde a 4°C.</li>
	<li>Prepare 50 mL de 1 M Tris-HCl (pH 6.8) misturando 6,06 g de Tris e 40 mL de ddH2O, ajustando o pH para 6,8 usando HCl, e adicionando ddH2O a um volume final de 50 mL. Guarde a 4°C.</li>
	<li>Prepare 100 mL de 30% de solução acrilamida-bis misturando 29 g de acrilamida, 1 g de bis-acrilamida e 80 mL de ddH2O, e adicionando ddH2O a um volume final de 100 mL. Guarde-o em uma garrafa marrom a 4 °C.</li>
	<li>Prepare 1.000 mL de 10x tris-glicina eletroforese tampão misturando 29 g de glicina, 58 g de Tris, 3,7 g de sulfato dodcyl de sódio (SDS), e 800 mL de ddH2O, e, em seguida, adicionando ddH2O a um volume final de 1.000 mL.</li>
	<li>Prepare 10 mL de buffer de carregamento misturando 2 mL de glicerina, 0,02 g de bromofenol azul, 0,4 g de SDS, 2 mL de Tris-HCl pH 6.8 e 7 mL de ddH2O, e depois adicionando ddH2O a um volume final de 10 mL.</li>
	<li>Prepare 10 mL de 10% de sulfato dodcyl-poliacrilúfo (SDS-PAGE) resolvendo gel, misturando 4 mL de ddh2O, 3,3 mL de 30% de solução acrilamida-Bis, 2,5 mL de 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 0,1 mL de 10% SDS, 0,1 mL de 10% de persulfato de amônio e 0,004 mL de tetrametilenodiamina (TEMED). Despeje o SDS-PAGE resolver a solução de gel na placa entre as placas de vidro para o nível da parte inferior do pente. Adicione 2 mL de álcool isópropcia no topo. Deixe 30 min.</li>
	<li>Retire o álcool isópropileno e lave o topo com ddH2O 3x. Despeje a solução de gel de concentração de 5%, contendo 4,1 mL de ddH2O, 1,0 mL de 30% de solução acylide-bis, 0,75 mL de 1 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,06 mL de 10% SDS, 0,06 mL de 10% de perfato de amônio, e 0,006 mL de TEMED. Insira imediatamente o pente na solução do gel de concentração, deixe para 30 min, e retire então o pente.</li>
	<li>Prepare o buffer de eletroforese 1x Tris-glicina diluindo 100 mL de tampão de eletroforese trisglicina 10x com 900 mL de ddH2O e despeje no tanque eletroforético.</li>
	<li>Misture 30 μg das proteínas mitocondriais do câncer de ovário e controle os tecidos ovarianos da etapa 3.4 com tampão de carregamento para atingir um volume final de 20 μL. Ferva a mistura por 5 min, em seguida, separá-lo com o gel de resolução de 10% SDS-PAGE usando uma tensão constante de 100 V. Quando o azul bromenil atinge o fundo, pare a eletroforese.</li>
	<li>Prepare 1,5 L de tampão de transferência eletroforética misturando 150 mL de tampão de eletroforese 10x Tris-glicina, 1.050 mL de ddH2O e 300 mL de metanol.</li>
	<li>Mergulhe a membrana PVDF em 100% metanol por 10 min e no amortecedor de transferência eletroforética por pelo menos 5 min. Mergulhe cinco folhas de papel filtro em 1x tampão de transferência elecrophorética por pelo menos 5 min.</li>
	<li>Tire o gel SDS-PAGE contendo as proteínas e mergulhe-o no amortecedor de transferência eletroforética por 10 min.</li>
	<li>Faça uma fita de transferência colocando uma esponja molhada na placa branca, três folhas de papel de filtro molhado, a membrana PVDF, o gel SDS-PAGE com as proteínas, duas folhas de papel de filtro molhado e a esponja molhada de baixo para cima. Evite bolhas.</li>
	<li>Coloque o de transferência no tanque eletroforético, despeje o amortecedor de transferência eletroforética e, em seguida, transfira para 2 h uma corrente constante de 200 mA.</li>
	<li>Prepare a solução de ações saline (TBS) 10x Tris-buffered (TBS) misturando 12.114 g de Tris, 29.22 g de NaCl, e adicionando ddH2O a um volume final de 500 mL. Prepare 2 L de 1x TBST misturando 200 mL de 10x TBS, 2 mL de Tween-20 e 1.798 mL de ddH2O. Prepare 100 mL de solução de bloqueio misturando 100 mL de TBST e 5 g de BSA.</li>
	<li>Após a transferência, tirar a membrana PVDF, lavar levemente em TBST por 5 min, em seguida, bloqueá-lo em solução de bloqueio para 1 h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubar a membrana PVDF (4 °C durante a noite) com diferentes anticorpos primários específicos para diferentes organelas subcelulares, incluindo laminado B (núcleo celular; anticorpo anti-humano de cabra 1: 1.000 solução de bloqueio), flotilha-1 (citomembrana; coelho anti-humano solução de bloqueio de anticorpos 1:500), COX4I1 (mitocondrana; solução anti-humana de bloqueio de coelhos 1:1.000), GM130 (aparelho Golgi; anticorpo anti-humano de camundongos 1:1.000 solução de bloqueio), catalase (peróxisoma; anticorpo anti-humano coelho 1:1.000 bloqueio solução), e catepsina B (lisóssoma; coelho anticorpo anti-humano 1:1,000 solução de bloqueio). Lave levemente em TBST por 5 min 3x.</li>
	<li>Incubar a membrana PVDF por 1 h à temperatura ambiente com os anticorpos secundários correspondentes (coelho anti-cabra, anti-coelho de cabra ou anti-rato de cabra). Lave levemente em TBST por 5 min 3x. Visualize-o com eletrochemiluminescência (ECL).</li>
</ol>4. análise iTRAQ-SCX-LC-MS/MS
NOTA: Os procedimentos detalhados para a seção 4 referem-se às instruções do iTRAQ(Tabela de Materiais).
<ol><li>Adicione o buffer SDT (4% SDS, 100 mM Tris-HCl pH 7.6 e 100 mM DTT) às amostras mitocondriais purificadas (ou seja, as pelotas dos tecidos de câncer de ovário do passo 1.16 e os tecidos ovarianos de controle do passo 2.17). Vortex a amostra até que não haja precipitação visível. NOTA: A amostra mitocondrial para a relação tampão SDT deve ser 1:5.</li>
	<li>Ferva a amostra tratada com SDT por 5 min, arrefecer a amostra no gelo e, em seguida, centrífuga (2.000 x g, 2 min).</li>
	<li>Coletar o supernatant como as amostras de proteína mitocondrial extraída e medir o teor de proteína com um kit de ensaio de proteína BCA.</li>
	<li>Tome proteínas mitocondriais extraídas por SDT (200 μg de cada amostra) para redução, alquilação, digestão com trippsina, dessalinização e liofofilia3,4. Faça três réplicas para cada amostra.</li>
	<li>Trate os peptídeos tépticos (100 μg de cada amostra) a partir do passo 4.4 com a solução de brometo de amônio tetraetilo de 100 mM (pH 8.5), e rotule os peptídeos tépticos com um dos reagentes iTRAQ de 6 plex de acordo com suas instruções3,4. Rotular cada amostra 3x.</li>
	<li>Misture igualmente 6 amostras de peptídeo téptico rotulado (três de tecidos de câncer de ovário e três de controle de tecidos ovarianos), e seque com um concentrador de vácuo.</li>
	<li>Fracionar os peptídeos misturados com rótulo scq com cromatografia SCX em 60 frações (uma fração por 1 min), em seguida, combinar a cada duas frações como uma amostra scx-fracionado (n = 30).</li>
	<li>Sujeitar cada amostra fracionada por SCX à análise LC-MS/MS em um espectrômetro de massa3,4 juntamente com um sistema LC nano dentro de um gradiente de separação lc de 60 min para obter dados de Em/MS.</li>
	<li>Pesquise os dados de Em/MS para identificar proteínas com o motor de busca(Tabela de Materiais).</li>
	<li>Use as intensidades do repórter-íon do iTRAQ para quantificar cada proteína e determinar proteínas diferencial expressas mitocondrial (mtDEPs) com uma mudança de >1.5 ou <-1.5 vezes, e p < 0.05.</li>
</ol>

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<li>Schrader, M., Costello, J., Godinho, L. F., Islinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome-mitochondria+interplay+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">Peroxisome-mitochondria interplay and disease.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 38, 681-702 (2015).</li>
<li>Bartolák-Suki, E., Imsirovic, J., Nishibori, Y., Krishnan, R., Suki, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mitochondrial+structure+and+dynamics+by+the+cytoskeleton+and+mechanical+factors%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Regulation of mitochondrial structure and dynamics by the cytoskeleton and mechanical factors.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18, 1812(2017).</li>
<li>Rezaul, K., Wu, L., Mayya, V., Hwang, S., Han, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+characterization+of+mitochondrial+proteome+from+human+T+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A systematic characterization of mitochondrial proteome from human T leukemia cells.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 4, 169-181 (2005).</li>
<li>Zhan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+many+proteins+can+be+identified+in+a+2DE+gel+spot+within+an+analysis+of+a+complex+human+cancer+tissue+proteome%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?</a> Electrophoresis. 39, 965-980 (2018).</li>
<li>Zhan, X., Li, N., Zhan, X., Qian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revival+of+2DE-LC%2FMS+in+proteomics+and+its+potential+for+large-scale+study+of+human+proteoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Med+One%22%5BJournal%5D)">Revival of 2DE-LC/MS in proteomics and its potential for large-scale study of human proteoforms.</a> Med One. 3, e180008(2018).</li>
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Os autores não têm nada a divulgar.

Alterações mitocondriais são uma marca registrada do câncer de ovário. A preparação de amostras mitocondriais de alta qualidade do câncer de ovário humano e tecidos de controle para proteômica quantitativa em larga escala beneficia a compreensão aprofundada da função mitocondrial na patogênese do câncer de ovário e alterações na rede molecular mitocondrial, e ajuda a esclarecer seu mecanismo molecular para a descoberta subsequente da terapia alvo e biomarcadores eficazes com base em mitocôndrias4,...

O câncer de ovário é um câncer ginecológico comum com alta mortalidade, mas claro mecanismo molecular1,2. A maioria dos cânceres de ovário são diagnosticados em estágio avançado, o que dificulta seriamente a terapia. As mudanças mitocondriais são uma marca registrada dos cânceres de ovário humano, e as mitocôndrias são os centros de metabolismo energético, sinalização celular e estresse oxidativo3,4,5,6,7. Insights aprofundados sobre as mudanças do proteoma mitocondrial em cânceres de ovário em comparação com o controle do tecido ovariano beneficiarão a compreensão aprofundada dos mecanismos moleculares do câncer de ovário e a descoberta de biomarcadores eficazes e confiáveis e alvos terapêuticos. Metabolismo mitocondrial tem sido proposto e reconhecido como um alvo para a terapia do câncer, e terapia anticondírica pode finalmente ser muito benéfico para prevenir a recorrência e metástase do câncer8. Perfil metabólico individual também já é praticado como uma ferramenta útil para estratificação do câncer e estratégias preditivas9,10.
O objetivo a longo prazo desta pesquisa é desenvolver e usar um método quantitativo de proteômica mitocondrial para estudar o câncer de ovário para esclarecimento de alterações mitocondriais proteoma entre câncer de ovário e controle de tecidos ovarianos, e suas alterações de rede molecular a partir de um ângulo multi-ômicos sistemático 11,12, o que resultará na descoberta de biomarcadores moleculares orientados para mitocôndrias 13 para esclarecimento dos mecanismos moleculares do câncer de ovário,12, o que resultará na descoberta de biomarcadores moleculares direcionados às mitocôndrias13 para esclarecimento dos mecanismos moleculares do câncer de ovário, previsão, e tratamento personalizado de pacientes com câncer de ovário. Tags isóbaricas para quantificação relativa e absoluta (iTRAQ) rotulagem3,4 são um método eficaz para quantificar as mudanças de proteína mitocondrial. A preparação de amostras mitocondriais de alta qualidade do câncer de ovário humano e controle dos tecidos ovarianos são o pré-requisito para a análise quantitativa iTRAQ de proteomas mitocondriais3. Preparação mitocondrial juntamente com proteômica quantitativa iTRAQ tem sido usada com sucesso em programas de pesquisa de longo prazo sobre o câncer de ovário humano proteoma mitocondrial, incluindo o estabelecimento de mapas de referência proteoma mitocondrial3, a análise de perfis mitocondriais expressos diferencialmente4,14 e modificações pós-translacionais, incluindo a fosforialização, que já resultou na descoberta de importante via de sinalização mudanças de rede em cânceres de ovário humano5, incluindo alterações no metabolismo energético4,metabolismo lipídico, e mitopgia via sistemas3.
Estudos anteriores descobriram que a centrifugação de velocidade diferencial em combinação com a centrifugação de gradiente de densidade é um método eficaz para isolar e purificar as mitocôndrias do câncer de ovário humano e controlar os tecidos ovarianos3,4,5,14. A rotulagem iTRAQ juntamente com forte troca de cromação (SCX) cromatografia líquida (LC)-espectrometria de massa em tandem (MS/MS) é a técnica-chave para detectar, identificar e quantificar as proteínas das amostras mitocondriais preparadas.
Aqui, protocolos detalhados para a preparação mitocondrial juntamente com a proteômica quantitativa iTRAQ são descritos. Estes têm sido utilizados com sucesso na análise de proteomas mitocondriais de tecido de câncer de ovário humano. Os protocolos incluem a preparação de amostras, centrifugação de velocidade diferencial, centrifugação de gradiente de densidade, avaliação de qualidade de amostras mitocondriais, digestão de proteínas com trippsina, rotulagem de iTRAQ, fracionação SCX, LC, MS/MS, pesquisa de banco de dados e análise quantitativa de proteínas mitocondriais. Além disso, este protocolo traduz-se facilmente para analisar outros proteomas mitocondriais do tecido humano.

<table><tbody><tr><td>Kit de ensaio de proteína BCA</td> O kit de ensaio de proteína BCA <td>Vazyme</td><td>E112</td><td>é uma versão especial de 3 componentes de nossos populares reagentes BCA, otimizado para medir (A562nm) a concentração total de proteína de soluções de proteína diluída (0,5 a 20 microgramas/ml).</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Solarbio</td><td>A8020-5G</td><td>Fração de choque térmico, origem australiana, livre de protease, baixo ácido graxo, baixa IgG, pH 7, &ge; 98%</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>XiangYi</td><td>TDZ4--WS</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma</td><td>C9426-5G</td><td>BioReagent, adequado para eletroforese, &ge; 98% (HPLC) (Sigma-Aldrich)</td></tr><tr><td>Ácido diamina tetracético (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>798681-100G</td><td>Anidro, fluxo livre, Redi-Dri, &ge; 98%</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td>1,4-Dithiothreitol</td></tr><tr><td>Easy nLC</td><td>Proxeon Biosystems (agora Thermo Fisher Scientific)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethylen glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>E0396-10G</td><td>BioXtra, &ge; 97 .0%</td></tr><tr><td>Homogeneizador</td><td>SilentShake</td><td>HYQ-3110</td><td></td></tr><tr><td>kit de reagentes iTRAQ</td><td>Applied Biosystems Applied Biosystems</td><td></td><td>iTRAQ Reagents&ndash; Guia de Referência Química, P/N 4351918A</td></tr><tr><td>Centrífuga super-rápida de baixa temperatura</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Manitol</td><td>Macklin</td><td>M813424-100G</td><td>O manitol é um poliol (álcool polihídrico) produzido a partir da hidrogenação da frutose que funciona como adoçante, umectante e agente de volume. Possui baixa higroscopicidade e baixa solvência de óleo.</td></tr><tr><td>MASCOT motor de busca</td><td>Matrix Science, Londres, Reino Unido; versão 2.2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nagarse</td><td>Solarbio</td><td>P9090</td><td></td></tr><tr><td>N-hidroxisuccinimida (SDT)</td><td>Sigma</td><td>56480-25G</td><td>Purum, &ge; 97,0% (T)</td></tr><tr><td>Nycodenz</td><td>Alere/Axis-Shield</td><td>1002424-1</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de protease de fluoreto de fenilmetanossulfonil (PMSF)</td><td>Solarbio</td><td>P0100-1ML</td><td>PMSF é um inibidor de protease que reage com resíduos de serina para inibir tripsina, quimotripsina, trombina e papaína.</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Macklin</td><td>P816354-25G</td><td>O cloreto de potássio, KCI, também conhecido como muriato de potássio e silvita, é um sólido cristalino incolor com um sabor salgado que derrete a 776&deg; C (1420 DE). É solúvel em água, mas insolúvel em álcool. O cloreto de potássio é usado em fertilizantes, produtos farmacêuticos, fotografia e como substituto do sal.</td></tr><tr><td>Proteome Discover 1.4</td><td>Matrix Science, Londres, Reino Unido</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>Millipore</td><td>05317</td><td>É 1 rolo, 26,5 cm x 1,875 m, 0,45 &micro; m tamanho de poro, membrana de transferência hidrofóbica de PVDF com baixa fluorescência de fundo para western blotting. É compatível com sondas fluorescentes visíveis e infravermelhas.</td></tr>Coluna científica Sigma 58997 de <tr><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>SCX do <td>espectrómetro maciço de Q</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>É 5-&mu; m tamanho de partícula, comprimento 5cm &times; i.d. 4,6 mm (Supelco).</td></tr><tr><td>Ortovanadato de sódio (V)</td><td>Macklin</td><td>S817660-25G</td><td>O ortovanadato de sódio (Vanadato) é um inibidor competitivo geral das proteínas fosfotirosil fosfatases. A inibição pelo ortovanadato de sódio é reversível com a adição de EDTA ou por diluição.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Macklin</td><td>S824459-500G</td><td>Vetec grau de reagente, 99%</td></tr> <tr><td>Thiourea</td><td>Sigma</td><td>62-56-6</td><td>ACS reagente, &ge; 99,0%</td></tr> <tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>10708976001</td><td>base TRIS é útil na faixa de pH de 7,0-9,0. Tem um pKa de 8,1 a 25 graus C.</td></tr><tr><td>Tripsina (uso em cultura de células)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Esta formulação líquida de tripsina contém EDTA e vermelho de fenol. Gibco Tripsina-EDTA é feito de tripsina em pó, uma mistura irradiada de proteases derivadas do pâncreas suíno. Devido à sua força digestiva, a tripsina é amplamente utilizada para dissociação celular, passagem de cultura celular de rotina e dissociação de tecido primário.</td></tr><tr><td>Ureia</td><td>Sigma</td><td>U5378-100G</td><td>em pó, BioReagente, para biologia molecular, adequado para cultura celular</td></tr></tbody></table>

preparação das mitocôndrias dos tecidos do câncer de ovário e controle dos tecidos ovarianos para análise quantitativa proteômica

Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis

O câncer de ovário é um câncer ginecológico comum com alta mortalidade, mas mecanismo molecular pouco claro. A maioria dos cânceres de ovário são diagnosticados em estágio avançado, o que dificulta seriamente a terapia. As mudanças mitocondriais são uma marca registrada dos cânceres de ovário humano, e as mitocôndrias são os centros de metabolismo energético, sinalização celular e estresse oxidativo. Insights aprofundados sobre as mudanças do proteoma mitocondrial em cânceres de ovário em comparação com o controle do tecido ovariano beneficiarão a compreensão aprofundada dos mecanismos moleculares do câncer de ovário e a descoberta de biomarcadores eficazes e confiáveis e alvos terapêuticos. Um método eficaz de preparação mitocondrial juntamente com uma tag isobaric para quantificação relativa e absoluta (iTRAQ) proteômica quantitativa são apresentados aqui para analisar o câncer de ovário humano e controlar proteomas mitocondriais, incluindo centrifugação de velocidade diferencial, centrifugação de gradiente de densidade, avaliação de qualidade de amostras mitocondriais, digestão de proteínas com trippsina, rotulagem de iTRAQ, fracionação de troca de cacionária forte (SCX), cromatografia líquida (LC), espectrometria de massa tandem (MS/ EM), análise de banco de dados e análise quantitativa de proteínas mitocondriais. Muitas proteínas foram identificadas com sucesso para maximizar a cobertura do proteoma mitocondrial do câncer de ovário humano e para alcançar o perfil de proteína mitocondrial expressa diferencialmente em cânceres de ovário humano.

Houve uma diferença na preparação das mitocôndrias dos tecidos de câncer de ovário e controle dos tecidos ovarianos. Este estudo descobriu que era muito mais fácil preparar mitocôndrias de tecidos de câncer de ovário do que de controle tecidos ovarianos3,4. Algumas melhorias tiveram que ser feitas ao protocolo para a preparação das mitocôndrias dos tecidos ovarianos do controle. Primeiro, antes da homogeneização do tecido, era nec...

Este artigo apresenta um protocolo de centrifugação de velocidade diferencial em combinação com a centrífuga de gradiente de densidade para separar as mitocôndrias dos tecidos humanos de câncer de ovário e controlar os tecidos ovarianos para análise quantitativa de proteômica, resultando em uma amostra mitocondrial de alta qualidade e análise proteômica quantitativa de alta produção e alta reprodutibilidade de um proteoma mitocondrial de câncer de ovário humano.

Preparação das mitocôndrias dos tecidos do câncer de ovário e controle dos tecidos ovarianos para análise quantitativa proteômica

Ovarian cancer is a common gynecologic cancer with high mortality but unclear molecular mechanism. Most ovarian cancers are diagnosed in the advanced ...

Mudanças mitocondriais desempenham papéis importantes nos cânceres de ovário humanos. Este protocolo estabelece uma plataforma eficaz para isolar e purificar mitocôndrias do câncer de ovário humano e os tecidos de controle para análise de proteômica em larga escala. Mitocôndrias, como centros de metabolismo energético, sinalização celular e estresse oxidativo, a visão sobre as mudanças mitocondriais proteome nos cânceres de ovário beneficiam nosso mecanismo molecular compreensivo, e é uma descoberta de biomarcadores eficazes e alvos terapêuticos.Esta técnica utiliza centrifugação de velocidade diferencial em combinação com centrífuga gradiente de densidade para separar mitocôndrias do câncer de ovário humano nos tecidos de controle, o que resulta em amostras de mitocôndrias de alta qualidade para análise quantitativa de proteômica. A preparação das mitocôndrias, juntamente com a proteômica quantitativa iTRAQ, tem sido usada com sucesso na análise do tecido do câncer de ovário humano, que se traduz facilmente para analisar outros tecidos, mitocôndrias proteômicas. Aqueles que nunca realizaram esse método podem achar que pode ser difícil isolar mitocôndrias do controle ovariano do que os tecidos cancerígenos.É necessário adicionar uma trippsina para melhorar a homogeneização do tecido de controle e adicionar uma camada extra de meio gradiente de densidade para melhorar a separação das mitocôndrias. Para iniciar este procedimento, prepare 250 mililitros do tampão de isolamento mitocondrial conforme descrito no protocolo de texto. Coloque aproximadamente 1,5 gramas de tecidos de câncer de ovário em um prato de vidro limpo.Adicione dois mililitros de tampão de isolamento mitocondrial pré-resfriado para lavar levemente o sangue da superfície do tecido. Repita esta lavagem três vezes. Em seguida, use uma tesoura oftálmica limpa para picadinho total do tecido em pedaços que são aproximadamente um milímetro cúbico, e transfira os tecidos picados para um tubo de centrífugo de 50 mililitros.Adicione 13,5 mililitros de tampão de isolamento mitocondrial contendo nagarse a uma concentração de 0,2 miligramas por mililitro. Use um homogeneizador eletrônico para homogeneizar os tecidos picados por dois minutos a quatro graus Celsius. Depois disso, adicione mais três mililitros de tampão de isolamento mitocondrial ao tecido homogeneiza e misture-os bem por pipetação.Centrifugar o tecido preparado homogeneizar a 1.300 xg, e a quatro graus Celsius por 10 minutos. Retire a pelota e mantenha o supernatante. Em seguida, centrifugar o supernante a 10.000 xg e a quatro graus Celsius por 10 minutos.Remova o supernanato contendo microsóbios e mantenha a pelota. Adicione 2 mililitros de tampão de isolamento mitocondrial e suspenda completamente a pelota por tubulação leve. Centrifugar esta suspensão de pelotas a 7.000 xg e a quatro graus Celsius por 10 minutos.Descarte o supernatante, e mantenha a pelota, que contém as mitocôndrias brutas. Adicione 12 mililitros de 25% de gradiente de densidade para suspender re-suspender as mitocôndrias brutas extraídas. Faça um gradiente de densidade descontínua contendo as mitocôndrias brutas re-suspensas, conforme descrito no protocolo de texto, e centrífugue-o a 52.000 xg, e a quatro graus Celsius por 90 minutos.Use uma seringa longa e contundente para coletar as mitocôndrias purificadas na interface entre os meios de 25% e 30% gradientes, e transfira isso para um tubo limpo. Adicione o tampão de isolamento mitocondrial às mitocôndrias coletadas para diluí-lo a um volume de três vezes. Centrifugar a 15.000 xg, e a quatro graus Celsius por 20 minutos.Descarte o supernasce, e mantenha a pelota. Colete a última pelota que contém as mitocôndrias purificadas, e armazene-a a 20 graus Celsius. Primeiro, prepare 250 mililitros do tampão de isolamento mitocondrial, conforme descrito no protocolo de texto.Adicione aproximadamente 1,5 gramas dos tecidos ovarianos de controle normal a uma xícara de vidro limpa. Adicione dois mililitros de tampão de isolamento mitocondrial pré-resfriado para lavar levemente o sangue da superfície do tecido. Repita esta lavagem três vezes.Usando uma tesoura oftálmica limpa, pique totalmente o tecido em pedaços que são aproximadamente 1 milímetro cúbico, e transfira os tecidos picados para um tubo limpo de 50 mililitros. Adicione oito mililitros de uma solução contendo 0,05% de trippsina e 20 mililitros EDTA e PBS aos tecidos de controle picados, e digerir à temperatura ambiente por 30 minutos para ajudar a lise as células e liberar as mitocôndrias. Centrífuga a 200 xg por cinco minutos.Descarte o supernasce, e mantenha os tecidos e células. Adicione 13,5 mililitros de tampão de isolamento mitocondrial contendo nagarse a uma concentração de 0,2 miligramas por mililitro, e use um homogeneizador elétrico para homogeneizar os tecidos picados a quatro graus Celsius por dois minutos. Adicione mais três mililitros de tampão de isolamento mitocondrial ao tecido homogeneiza e misture bem por pipetação.Centrifugar o tecido preparado homogeneizar a 1.300 xg e a quatro graus Celsius por 10 minutos. Retire a pelota e mantenha o supernatante. Centrifugar o supernante a 10.000 xg e a quatro graus Celsius por 10 minutos.Remova o supernatante, que contém os microssósmos, e mantenha a pelota. Em seguida, adicione 2 mililitros de tampão de isolamento mitocondrial e suspenda completamente a pelota por tubulação leve. Centrifugar esta suspensão de pelotas a 7.000 xg e a quatro graus Celsius por 10 minutos.Descarte o supernatante e mantenha a pelota que contém as mitocôndrias brutas. Adicione 12 mililitros de 25% de gradiente de densidade para suspender re-suspender as mitocôndrias brutas extraídas. Faça um gradiente de densidade descontínua contendo as mitocôndrias brutas como descrito no protocolo de texto, e centrifuá-lo a 52.000 xg e a quatro graus Celsius por 90 minutos.Use uma seringa longa e contundente para coletar as mitocôndrias purificadas na faixa da interface entre os meios de 25 e 30% gradientes até a interface entre os meios de 34 e 38%. Transfira as mitocôndrias purificadas para um tubo limpo. Adicione o tampão de isolamento mitocondrial às mitocôndrias coletadas para diluí-lo a um volume de três vezes.Centrifugar a 15.000 xg e a quatro graus Celsius por 20 minutos, e descartar o supernaspe. Adicione 2 mililitros de tampão de isolamento mitocondrial para suspender novamente a pelota e a centrífuga a 15.000 xg e a quatro graus Celsius por 20 minutos. Descarte o supernatante e mantenha a pelota.Pegue a última pelota e guarde-a a 20 graus Celsius. Neste estudo, amostras mitocondriais de alta qualidade são preparadas a partir do câncer de ovário humano e tecidos de controle para proteômica quantitativa em larga escala. Existem algumas diferenças na preparação das mitocôndrias a partir de tecidos de câncer de ovário e controlar tecidos ovarianos, incluindo o uso de um gradiente de densidade descontínua diferente.Após a centrifugação, as mitocôndrias purificadas de tecidos de câncer de ovário são encontradas na interface entre 25% e 30%, enquanto as de tecidos ovarianos de controle são encontradas na faixa da interface entre 25% e 30% até a interface entre 34% e 38% A qualidade das mitocôndrias preparadas é então avaliada com centrifugação de velocidade diferencial e centrífuga de densidade através de microcóspia eletrônica. As imagens do microscópio eletrônico demonstram que, tanto no câncer de ovário quanto no controle dos tecidos ovarianos, as principais organelas isoladas são mitocôndrias, exceto por uma pequena quantidade de peroxisomes. No entanto, a morfologia das mitocôndrias é vista como uma mudança mais em cânceres de ovário do que controlar o tecido ovariano.A qualidade das mitocôndrias preparadas também é avaliada via mancha ocidental. As imagens de manchas ocidentais também demonstram que o principal componente em amostras mitocondriais preparadas de cânceres de ovário e ovários de controle são mitocôndrias, exceto por uma pequena quantidade de peroxisomes, o que é consistente com a análise da microscopia eletrônica. É razoável que os peroxisomes sejam contidos nas mitocôndrias preparadas, pois as mitocôndrias interagem extensivamente com os peroxisomes, o que por sua vez reflete a completude funcional das mitocôndrias.Esses resultados demonstram a alta qualidade das amostras mitocondriais preparadas. Quando estou realizando este procedimento, é muito importante que você pica totalmente tecidos antes da homogeneização, e adicione a trippsina aos tecidos de controle picados. Também é importante que você faça e ou prepare gradiente de densidade descontínua para as amostras de câncer e os controles.Após este procedimento, a proteômica quantitativa iTRAQ ou TMT ou fosfoproteômica pode ser realizada para esclarecer o perfil mitocôndrias proteome do câncer de ovário, e o perfil fosfoproteome pode ser estabelecido para esclarecer os papéis das mitocôndrias no câncer de ovário em grandes profundidades. Essa técnica abre caminho para os pesquisadores estudarem sistematicamente mitocôndrias proteome e o fosfoproteome no câncer de ovário, construir o sistema de rede de caminhos de sinalização e descobrir os biomarcadores confiáveis e os alvos terapêuticos.

preparation-mitochondria-from-ovarian-cancer-tissues-control-ovarian

Research

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Pesquisa sobre o Câncer

Este vídeo descreve o procedimento para isolar mitocôndrias de tecidos de câncer de ovário humano usando centrifugação de velocidade diferencial em combinação com centrifugação por gradiente de densidade. As mitocôndrias isoladas podem ser usadas para análise proteômica do proteoma mitocondrial do câncer de ovário humano.

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Preparação das mitocôndrias dos tecidos do câncer de ovário e controle dos tecidos ovarianos para análise quantitativa proteômica (Vídeo) | JoVE Journal

Preparação das mitocôndrias dos tecidos do câncer de ovário e controle dos tecidos ovarianos para análise quantitativa proteômica

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