Name: Isolamento e Cultura dos neurônios oculomotores, trochlear e motores espinhais de pré-natal Islmn:GFP Ratos Transgênicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Aprenda a isolar e cultivar neurônios motores oculares, troclear e espinhais de embriões de camundongos transgênicos Isl1mn:GFP. Este método permite estudos comparativos sobre vulnerabilidade seletiva em doenças do neurônio motor.

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Agradecemos a Brigitte Pettmann (Biogen, Cambridge, MA, EUA) por instrução em técnicas de dissecação da SMN; O Dana Farber Cancer Institute Flow Cytometry Facility, a Immunology Division Flow Cytometry Facility da Harvard Medical School, o Joslin Diabetes Center Flow Cytometry Core, Brigham and Women's Hospital Flow Cytometry Core e Boston Children's Hospital Flow Cytometry Research Facility for FACS isolation of primary motor neurons; A.A. Nugent, A.P. Tenney, A.S. Lee, E.H. Nguyen, M.F. Rose, membros adicionais do laboratório de Engle e membros do consórcio do Projeto ALS para assistência técnica e discussão ponderada. Este estudo foi apoiado pelo Projeto ALS. Além disso, a R.F. foi financiada pela Japan Heart Foundation/Bayer Yakuhin Research Grant No exterior e pela bolsa de treinamento do NIH Em Genetics T32 GM007748; J.J. foi apoiado pelo programa de treinamento NIH/NEI nas Bases Moleculares de Doenças Oculares (5T32EY007145-16) através do Schepens Eye Research Institute e pelo Developmental Neurology Training Program Postdoctoral Fellowship (5T32NS007473-19) através do Boston Children's Hospital; M.C.W foi apoiado pela NEI (5K08EY027850) e pela Children's Hospital Ofthalmology Foundation (Faculty Discovery Award); e.C.E. é um investigador do Instituto Médico Howard Hughes.

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Os autores declaram nenhum conflito de interesses.

Historicamente, estudos in vitro de neurônios motores CN3 e/ou CN4 têm contado com culturas heterogêneas como dissociada17,18,19,20,21, explant17,22,23,24,25,26,e ...

A cultura dos neurônios motores primários é uma ferramenta poderosa que permite o estudo do desenvolvimento neuronal, função e susceptibilidade a estressores exógenos. As culturas dos neurônios motores são particularmente úteis para o estudo de doenças neurodegenerativas, como a esclerose lateral amiotrófica (ELA)1,2,cujos mecanismos de doença são incompletamente compreendidos. Curiosamente, apesar da morte celular significativa de neurônios motores espinhais (SMNs) em pacientes com ELA e camundongos modelo ALS, morte celular em neurônios oculomotores (CN3s) e neurônios trochlear (CN4s) são relativamente escassos1,3,4,5,6,7,8,9. Portanto, análises comparativas de culturas puras de CN3s/CN4s e SMNs poderiam fornecer pistas importantes sobre mecanismos subjacentes à vulnerabilidade relativa. Infelizmente, uma grande barreira para tais análises tem sido a incapacidade de crescer culturas purificadas desses neurônios motores.
Muitos protocolos foram descritos para a purificação de SMNs de modelos animais. A maioria desses protocolos utiliza centrifugação de gradiente de densidade10,11,12 e/ou p75NTR-técnicas de triagem de células baseadas em anticorpos13,14,15,16. A centrifugação do gradiente da densidade explora o tamanho maior de SMNs relativo a outras pilhas espinal, visto que o p75NTR é uma proteína extracellular expressada exclusivamente por SMNs na medula espinal. Quase 100% de culturas smn puras foram geradas por um ou ambos os protocolos11,12,14. No entanto, esses protocolos não têm sido bem-sucedidos na geração de culturas CN3/CN4 porque cn3s/CN4s não expressam p75NTR,e outros marcadores específicos do CN3/CN4 não foram identificados. Eles também são menores do que as SMNs e, portanto, mais difíceis de isolar com base no tamanho. Em vez disso, estudos in vitro de CN3s ou CN4s têm contado com a dissociada17,18,19,20,21, explant17,22,23,24,25,26, e fatia27,28 culturas, que são compostas de tipos de células heterogêneas, e não existem protocolos para o isolamento e cultura dos CN3primários ou CN4s.
Aqui, um protocolo é descrito para a visualização, isolamento, purificação e cultivo de CN3s, CN4s e SMNs do mesmo dia embrionário 11,5 (E11,5) IslMN:GFP camundongos transgênicos29 (Figura 1, Figura 2A). IslMN:GFP rotula especificamente os neurônios motores com um GFP farnesylated que localiza a membrana celular. Este protocolo permite a comparação de espécies e idade-combinados de vários tipos de neurônios motores, a fim de elucidar mecanismos patológicos na doença do neurônio motor.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugado com cabra anti-rato IgG (H+L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11001</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594-conjugado F(ab')2 cabra anti-coelho IgG (H+L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11072</td><td>1:400</td></tr><tr><td>B27 Suplemento (50x), sem soro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria llu SORP Flow Cytometer</td><td>BD Bioscience</td><td>- </td><td>Possui 4 sistemas de laser equipados com lasers de 405, 488, 594 e 640 nm.</td></tr><tr><td>BD Falcon 70&mu; m Filtros de células de nylon</td><td>CORNING</td><td>352350</td><td>Para filtrar as células dissociantes antes do FACS.</td></tr><tr><td>Tubos de ensaio de fundo redondo BD Falcon com tampa de pressão</td><td>CORNING</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>BDNF Human</td><td>ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.</td><td>Microplaca de cultura de células CYT-207</td><td></td></tr><tr><td>, 96 poços, PS, fundo F (poço de chaminé)</td><td>Greiner Bio-One International</td><td>655090</td><td>Tentamos vários pratos de 96 poços e este foi o melhor para cultura e análises após os</td></tr><tr><td>vidros de cobertura circular ICC para microscopia</td><td>Karl Hecht & Assistente</td><td>1001/14</td><td>Utilizamos esta lamínula por a área ser grande (diâmetro: 14 mm).</td></tr><tr><td>CNTF Humano</td><td>ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.</td><td>CYT-272</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ciclopiazônico de Penicillium cyclopium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1530</td><td>CPA. Um dos estressores do ER.</td></tr><tr><td>4&prime;,6-diamidino-2-fenilinodol (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>Dumont #5 Fórceps Inox Tamanho da ponta 0,05 mm x 0,01 mm Pontas Biologie Instrumento</td><td>cirúrgico Roboz</td><td>RS-5015</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP25205</td><td></td></tr><tr><td>GDNF Human</td><td>ProSpec-Tany TechnoGene, Ltda.</td><td>CYT-305</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Solução salina balanceada (HBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate E</td><td>BrainBits</td><td>HE</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate E baixa fluorescência</td><td>BrainBits</td><td>HELF</td><td>A fluorescência que dificulta a observação das expressões GFP do embrião deve ser baixa.</td></tr><tr><td>Soro de cavalo, inativado pelo calor, origem neozelandesa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26050-070</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Tocris Cookson</td><td>2845</td><td>Isobutilmetilxantina</td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz' s L15 médio</td><td>Fisher Scientific</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Micro Tesoura de Dissecação</td><td>Roboz Instrumento Cirúrgico</td><td>RS-5913</td><td></td></tr><tr><td>Micro Faca 4.75" 1.7 mm x 27 mm lâmina</td><td>Roboz Instrumento Cirúrgico</td><td>RS-6272</td><td></td></tr><tr><td>Moria Mini Colher Perfurada</td> Ferramentas <td>de Ciências Finas</td><td>10370-19</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal de camundongo para &beta;-tubulina neuronal classe III (TUBB3)</td><td>BioLegend</td><td>801202</td><td>1:500, TUJ1</td></tr><tr><td>Nikon Perfect Focus Eclipse Ti microscópio de fluorescência de células vivas e software Elements</td><td></td> <td>Nikon-Differential</td> <td>imagens de contraste de interferência e imagens imunocitoquímicas das culturas de células foram capturadas com estes equipamentos</td></tr><tr><td>Ácido Nítrico 90%, Fumegante (ACS Certificado)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A202-212</td><td>Para enxaguar lamínulas</td></tr><tr><td>Olympus 1.7 mL Microtubos, Transparente</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-281</td><td>Estes são os tubos que descrevemos "tubos de microcentrífuga de 1.7 mL" no contexto.</td></tr><tr><td>Sistema de dissociação de papaína</td><td>Worthington Biochemical Corp</td><td>LK003150</td><td>solução de papaína e solução de inibidor de alubumina-ovomucoide são preparadas a partir deste kit.</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Poli D-lisina (PDL)</td><td>MilliporeSigma</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal de coelho para ilhota1</td><td>Abcam</td><td>ab109517</td><td>1:200</td></tr><tr><td>SMZ18 e SMZ1500 estereomicroscópios de zoom com DS-Ri1 câmera</td><td>Nikon-Dissection</td><td></td> <td>foi realizada e imagens de embriões e tecidos dissecados são capturadas sob esses microscópios de fluorescência.</td></tr><tr><td>Encapsulante de silicone preto Sylgard 170 - kit A+B 0,9 kg</td><td>Dow Corning</td><td>1696157</td><td>Fazemos pratos de dissecação usando este kit.</td></tr><tr><td>Pratos tratados com TC, 100 mm x 20 mm</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-202</td><td>Fazemos pratos de dissecação usando este prato.</td></tr><tr><td>Pinça de Curativo Thum 4,5" Serrilhada 2,2 mm Largura da Ponta</td><td>Roboz Instrumento Cirúrgico</td><td>RS-8100</td><td></td></tr><tr><td>Transdutor para LOGOQ e VET</td><td>GE Healthcare</td><td>L8-18i-RS</td><td>Para ultrassom em camundongos fêmeas</td></tr><tr><td>Máquina de ultrassom veterinária</td><td>GE Healthcare</td><td>LOGOQ e VET</td><td>Para ultrassom em camundongos fêmeas</td></tr><tr><td>Microscópio confocal de varredura a laser Zeiss LSM série 700 e Zen Software</td><td>Carl Zeiss</td><td>-</td><td>A imagem confocal do embrião foi capturada com esses equipamentos</td></tr></tbody></table>

isolamento e cultura dos neurônios oculomotores, trochlear e motores espinhais de pré-natal islmn:gfp ratos transgênicos

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Neurônios oculomotores (CN3s) e neurônios trochlear (CN4s) apresentam notável resistência a doenças degenerativas do neurônio motor, como esclerose lateral amiotrófica (ELA) quando comparados aos neurônios motores espinhais (SMNs). A capacidade de isolar e cultura cn3s rato primário, CN4s, e SMNs proporcionaria uma abordagem para estudar os mecanismos subjacentes a esta vulnerabilidade seletiva. Até o momento, a maioria dos protocolos utiliza culturas géterogêneas celulares, que podem confundir a interpretação dos resultados experimentais. Para minimizar os problemas associados às populações de células mistas, as culturas puras são indispensáveis. Aqui, o primeiro protocolo descreve em detalhes como purificar e cultivar eficientemente CN3s/CN4s ao lado de contrapartes de SMNs dos mesmos embriões usando o dia embrionário 11.5 (E11.5) IslMN:GFP embriões transgênicos do rato. O protocolo fornece detalhes sobre a dissecção e dissociação de tecidos, isolamento celular baseado em FACS e cultivo in vitro de células dos núcleos CN3/CN4 e SMN. Este protocolo adiciona um novo sistema de cultura CN3/CN4 in vitro aos protocolos existentes e, simultaneamente, fornece uma cultura SMN pura e de espécies combinadas para comparação. Análises com foco nas características morfológicas, celulares, moleculares e eletrofisiológicas dos neurônios motores são viáveis neste sistema de cultura. Este protocolo permitirá a pesquisa nos mecanismos que definem o desenvolvimento do neurônio motor, a vulnerabilidade seletiva, e a doença.

O objetivo deste protocolo era purificar e cultura altamente tanto cn3s primários / CN4s e SMNs a longo prazo para permitir análises comparativas dos mecanismos subjacentes distúrbios do neurônio motor (ver Figura 1 e Figura 2 para visão geral).
Uma vez que os neurônios foram isolados com sucesso e crescidos na cultura, quase puro cn3 primário/cn4 e smn culturas foram o...

Este trabalho apresenta um protocolo para produzir culturas celulares homogêneas de neurônios motores oculomotores primários, trochlear e espinhais. Essas culturas podem ser usadas para análises comparativas das características morfológicas, celulares, moleculares e eletrofisiológicas dos neurônios motores oculares e espinhais.

Isolamento e Cultura dos neurônios oculomotores, trochlear e motores espinhais de pré-natal Islmn:GFP Ratos Transgênicos

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral ...

Este é o primeiro protocolo para purificar simultaneamente e eficientemente e cultivar neurônios motores oculares e espinhais primários de camundongos embrionários. Permite o estudo de mecanismos subjacentes à doença do neurônio motor. Este protocolo adiciona um novo componente de cultura in vitro oculomotor aos sistemas existentes e fornece espécies puras e culturas de neurônios motores espinhais para comparação.Na esclerose lateral amiotrófica, os neurônios motores espinhais degeneram enquanto os neurônios oculomotores são relativamente poupados. Comparar essas culturas poderia fornecer insights sobre mecanismo de doença e terapia. Este método facilitará os estudos dos mecanismos subjacentes ao desenvolvimento do neurônio motor, doenças e vulnerabilidade seletiva.Nosso sistema de cultura permite a caracterização da morfologia do neurônio motor, biologia molecular e eletrofisiologia. Para aqueles novos nessa técnica, recomendamos muita prática. A dissecção pode ser tecnicamente desafiadora e vários dissetores podem ser necessários para obter neurônios suficientes para a cultura primária.Comece colhendo embriões positivos Islet1 EGF de um camundongo grávida aproximadamente 11,5 dias após a fertilização. Pulverize o abdômen completamente com etanol e remova o útero com tesoura de microdisseção estéril e fórceps de curativo. Lave brevemente o útero em PBS estéril.Em seguida, transfira-o para a placa de dissecção cheia de PBS estéril pré-refrigerado. Sob a luz brilhante do microscópio, remova cuidadosamente os embriões do útero usando tesouras de microdisseção, fórceps de curativo do polegar e pinças Dumont 5. Em seguida, use uma mini colher perfurada Moria estéril para transferir cada embrião para um poço separado de uma placa de 24 poços cheia de hibernação pré-refrigerada E médio de baixa fluorescência suplementado com 1X V27.Mantendo a placa no gelo, transfira um embrião para uma placa de dissecção estéril e cubra-a completamente com a solução de sal balanceada estéril de Hank ou HBSS. Use pinças para remover a face do embrião e a cauda sem danificar o cérebro médio. Em seguida, coloque o embrião propenso com membros estondo e cauda apontando para a frente do microscópio.Use pinças para abrir o teto do quarto ventrículo, a fim de gerar uma pequena abertura. Use esta abertura para conectar pinças no espaço criado entre o quarto ventrículo e seu telhado. Disseque ao longo da superfície dorsal do embrião rostral até o córtex e lateral para a placa do chão e coluna motora.Em seguida, abra o tecido dissecado de forma aberta para revelar os núcleos CN3 e CN4 positivos da GFP. Separe cuidadosamente o cérebro médio ventral do embrião e remova tecido meningeal com pinças e uma faca de microdisseção. Disseque os núcleos positivos do GFP positivo CN3 e CN4 para longe da placa do piso e de outros tecidos circundantes GFP positivos, tomando cuidado para evitar tocar ou danificar os neurônios.Se coletar núcleos CN3 e CN4 separados, corte ao longo do cérebro médio desses dois núcleos e use uma pipeta P1000 para coletar o tecido de cérebro médio ventral dissecado com HBSS mínimo. Coloque-o em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro rotulado cheio de meio de dissecção e armazene o tubo no gelo até a dissociação. Continue puxando cérebros médios ventral de embriões adicionais no mesmo tubo até que o número total atenda aos requisitos experimentais.Para dissecar a medula espinhal ventral, mantenha o embrião propenso com a cabeça virada para a frente do microscópio. Segure-o com um par de pinças e insira a ponta do outro par na parte caudal não aberta do quarto ventrículo. Abra o resto do cérebro traseiro e da medula espinhal dorsalmente sobre toda a extensão rostrocaudal do embrião.Corte o tecido dorsal a partir do quarto ventrículo e trabalhando em direção ao canal central da medula espinhal caudal usando as fórceps como tesoura. Em seguida, segure o embrião com um conjunto de pinças e belisque o retalho do tecido dorsal de cada lado com o outro par. Remova a medula espinhal ventral usando a faca de microdisseção para perfurar diretamente abaixo do SMN positivo GFP levantando a medula espinhal ventral com movimentos semelhantes à serra em ambos os lados.Corte a medula espinhal transversalmente no limite superior do membro inferior e remova a porção lombar cervical. Corte transversalmente diretamente acima de C1, onde o primeiro GFP positivo anterior horn projeta. Coloque o lado dorsal da medula espinhal ventral para cima e segure-o pressionando o tecido negativo GFP entre as colunas SMN positivas do GFP com um par de pinças.Remova o restante do mesenquime anexado, DRGs e medula dorsal, aparando ambos os lados da coluna SMN positiva GFP com a faca de microdisseção. Use uma pipeta P1000 para coletar o tecido da medula espinhal ventral dissecada com HBSS mínimo e colocá-lo em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro rotulado cheio de meio de dissecção. Armazene-o no gelo até a dissociação e continue puxando medulas espinhais ventrais de embriões adicionais no mesmo tubo.Adicione o volume apropriado de solução de papain a cada um dos tubos de microcentrifuuge com as amostras de tecido dissecado. Incubar os tubos a 37 graus Celsius por 30 minutos agitando os tubos a cada 10 minutos por movimento de dedo. Após a incubação, triturar suavemente cada suspensão oito vezes com uma pipeta P200 e centrifuá-la a 300 vezes g durante cinco minutos.Resuspenque as pelotas celulares com o volume apropriado da solução inibidora de ovomucóide de albumina, pipetando suavemente para cima e para baixo. Repita a centrifugação. Em seguida, remova cuidadosamente o supernaspe com uma pipeta P1000.Resuspenquei as células no volume apropriado do meio de dissecção. Filtre as suspensões através de um filtro de célula de 70 micrômetros. Em seguida, use a classificação FACS para isolar células positivas GFP dissecadas de CN3/CN4 e SMN.Diluir as suspensões celulares isoladas com o meio de cultura do neurônio motor pré-aquecido a 37 graus Celsius às densidades apropriadas e adicionar 200 microliters da suspensão a um poço de uma placa de 96 poços revestida de laminina PDL. Cultuize os neurônios em uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono certificando-se de atualizar o meio de cultura do neurônio motor a cada cinco dias. Quando os neurônios isolados foram cultivados com sucesso na cultura, culturas cn3/CN4 primárias quase puras e SMN foram obtidas e mantidas por 14 dias in vitro.As purezas das culturas em dois dias in vitro foram de 93,5% para CN3/CN4 e 86,7% para SMN quando avaliadas pela imunocitoquímica com o marcador de neurônio motor Islet1 e marcador neuronal TUJ1. As purezas dependiam fortemente da idade dos embriões e na definição dos limites apropriados para os portões GFP durante o FACS. A pureza dos neurônios isolados dos embriões E10,5 eram comparáveis aos dos embriões E11,5.No entanto, a pureza diminuiu significativamente quando foram utilizados embriões E13,5. Para determinar se as CN3/CN4s primárias e as SMNs apresentaram respostas diferenciais aos estressores de ritúlume endoplasmáticos, as células foram tratadas com concentrações variadas de Ácido Ciclopiazônico ou CPA em dois dias in vitro e fixadas três dias depois para imunocitoquímica avaliar as razões de sobrevivência. O número de neurônios viáveis em cada amostra foi contado e as razões de sobrevivência foram calculadas.As monoculturas CN3/CN4 foram significativamente mais resistentes ao tratamento de CPA em comparação com as monoculturas SMN. Após este procedimento, muitos métodos adicionais podem ser realizados para examinar neurônios motores. Alguns exemplos incluem estudos de eletrofisiologia, biologia celular, transcrição ou acessibilidade à cromatina.

isolation-culture-oculomotor-trochlear-spinal-motor-neurons-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Uma forma alternativa de isolar motoneurônios embrionárias de camundongos a partir da medula espinhal é descrito. O método leva em consideração o fato de que a lectina pode ligar para a afinidade baixo do nervo receptor do fator de crescimento p75NTR. Este preplating lectina baseado permite uma purificação semelhante ao que, com um anticorpo específico contra o p75NTR.

Lectina baseado em isolamento e cultura de motoneurônios embrionárias de rato

Isolamento de crista neural embrionário a partir do tubo neural facilita o uso...

Isolamento e cultivo de células da crista neural do tubo neural embrionário murino

O vídeo demonstra o isolamento de neurônios oculomotores, trocleares e motores espinhais de um embrião de camundongo transgênico. O embrião expressa neurônios motores marcados com uma proteína fluorescente verde (GFP) para fácil visualização e identificação. Os neurônios motores são isolados cirurgicamente sob um microscópio de fluorescência e mantidos em meio de cultura.

Isolamento e cultura de neurônios oculomotores, trocleares e motores espinhais de um embrião de camundongo

Este vídeo demonstra a cultura ex vivo e a imagem de fatias oculomotoras de embriões de camundongos transgênicos. Os embriões são isolados e incluídos em agarose. Usando um vibratome, são obtidas fatias contendo os núcleos oculomotores e os olhos. As fatias são mantidas em cultura e fotografadas usando um microscópio de fluorescência.

Cultura ex vivo e imagem de fatias oculomotoras de embriões de camundongos transgênicos

As causas da degeneração dos neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo durante a doença de Parkinson não são totalmente compreendidas. Os sistemas de cultura celular fornecem uma ferramenta essencial para o estudo das propriedades neurofisiológicas desses neurônios. Aqui apresentamos um protocolo otimizado, que pode ser utilizado para modelagem in vitro da neurodegeneração.

Isolamento, cultura e Long-Term Manutenção da Primária mesencefálico Dopaminergic neurônios dos cérebros de roedores Embryonic

Este estudo apresenta uma técnica para o isolamento de neurônios de ratos neonatais WT. Requer a dissecção cuidadosa da medula espinhal do rato neonatal, seguida da separação de neurônios do tecido da medula espinhal através da clivagem mecânica e enzimática.

Isolamento e cultura de neurônios da medula espinhal de ratos neonatais

Descrevemos o isolamento de Fima de oligodendrócitos mouse principal, que permite o isolamento das células para cultura em vitro rápido e específico.

Isolamento de Fima rápida e específica de oligodendrócitos primário de Mouse

O objetivo desta técnica é preparar uma cultura altamente enriquecida de motoneurônios primários (MNs) de murino da medula espinhal. Para avaliar as consequências das mutações causadoras de doenças MN, descrevemos aqui o isolamento destes isolados MNs e seu transfeccao por magnetofection.

Doença de Charcot-Marie-Tooth In Vitro de modelagem por Transfecting Mouse motoneurônios primários

Aqui, apresentamos uma nova técnica microcirúrgica para o isolamento de células-tronco neurais da Eminência ganglionar embrião de rato E13 .

Isolamento e cultura de células-tronco neurais embrionárias de rato

Um ensaio ex vivo da fatia permite que o conseqüência do nervo oculomotor seja imaged no tempo real. As fatias são geradas incorporando E 10.5 ISLMN: embriões de GFP no agarose, cortando em um vibratome, e crescendo em uma incubadora do estágio-parte superior. O papel das vias de orientação do AXON é avaliado pela adição de inibidores aos meios de cultura.

Cultura ex vivo oculomotor Slice de camundongos que expressam GFP embrionário para a imagem de lapso temporal do crescimento do nervo oculomotor

As gânglios ciliares filhotes (CG) fazem parte do sistema nervoso parassimpático. Culturas neuronais de neurônios CG foram mostrados como modelos celulares eficazes no estudo das interações musculares nervosas. Descrevemos um protocolo detalhado para a dissecação, dissociação e cultura in vitro de neurônios CG de embriões de filhotes.

Isolamento e Cultura de Chick Ciliary Ganglion Neurons

Aprenda a isolar e cultivar neurônios motores oculares, troclear e espinhais de embriões de camundongos transgênicos Isl1mn:GFP. Este método permite estudos comparativos sobre vulnerabilidade seletiva em doenças do neurônio motor.

Isolamento e Cultura dos neurônios oculomotores, trochlear e motores espinhais de pré-natal Isl^mn:GFP Ratos Transgênicos

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