Aumentando a Durabilidade de Culturas de Células Neurais Dissociadas Usando Matriz Coralina Biologicamente Ativa

O significado deste protocolo é que ele fornece uma nova maneira de aumentar a durabilidade e o crescimento de neurônios, glia e células-tronco in vitro. Também é aplicável para outras células. A principal vantagem da técnica é o uso de uma matriz feita de esqueleto de coral.

Esta matriz nutre e protege as células neurológicas e promove o crescimento. Sendo de suporte para células neurais in vitro, o esqueleto de coral pode funcionar de forma semelhante como um implante regenerativo em locais de lesão cerebral. Para começar, use um martelo para quebrar o esqueleto do coral e divida-o em fragmentos de 0,5 a dois centímetros.

Para dissolver resíduos orgânicos e não orgânicos, mergulhe os fragmentos do esqueleto de coral em solução de hipoclorito de sódio a 10% por 10 minutos. Em seguida, lave uma vez com água bidestilada Para remover os resíduos orgânicos restantes, mergulhe os fragmentos em uma solução molar de hidróxido de sódio por cinco minutos e depois lave uma vez com água bidestilada

Continue com a remoção dos depósitos orgânicos embebendo os fragmentos em solução de peróxido de hidrogênio a 30% por 10 minutos e lave os fragmentos três vezes com água bidestilada Remova o máximo possível de excesso de água bidestilada e deixe os fragmentos de coral no capô secarem. Em seguida, limpe as lamínulas de vidro mergulhando-as em 10 mililitros de etanol a 95% em uma placa de Petri de vidro de 100 milímetros.

Após 15 minutos, retire o etanol e lave com água bidestilada três vezes, aguardando 10 minutos entre cada lavagem. Remova a água bidestilada e coloque o prato em uma placa de aquecimento pré-aquecida a 80 graus Celsius. Em seguida, mexa suavemente as lamínulas até que a água bidestilada evapore.

Autoclave as lamínulas. Triture os fragmentos de esqueleto de coral usando um almofariz e pilão até a quebra completa. É obtida uma mistura de grãos com tamanhos que variam de 20 a 200 micrômetros.

Alternativamente, triture os fragmentos de esqueleto de coral usando uma retificadora elétrica com lâmina de seis centímetros de comprimento e largura de 0,5 a um centímetro, a uma velocidade de 1000 RPM por 30 segundos. Para purificar os grãos, transfira-os para um filtro elétrico de malha de filtro de 40 mícrons. Ajuste as configurações do filtro elétrico para tremer a 600 amplitudes por minuto e saltar seis vezes por segundo.

Em seguida, autoclave os grãos. Em condições estéreis, adicione os grãos de esqueleto de coral em um PDL de 20 microgramas por mililitro, dissolvido na solução de Hank para atingir a concentração de cinco miligramas ou 10 miligramas de grãos por solução de PDL de um mililitro. Despeje a solução em frascos e pratos na concentração de aproximadamente dois mililitros por 25 centímetros quadrados e incube durante a noite a quatro graus Celsius.

Os grãos afundam e se prendem ao fundo. No dia seguinte, lave os frascos e pratos uma vez com água bidestilada estéril. Deixe os frascos e pratos secarem no capô.

Para revestir a lamínula de vidro, primeiro adicione grãos de esqueleto de coral à água destilada duplamente a uma concentração de cinco ou 10 miligramas por mililitro. Coloque as lamínulas em uma placa de aquecimento pré-aquecida a 80 graus Celsius. Em seguida, pingue 40 microlitros da solução de grãos no centro da lamínula e aguarde 15 minutos para a evaporação completa.

Isso fará com que os grãos adiram à lamínula. Autoclave as lamínulas revestidas e armazene em condições estéreis. Em seguida, coloque as lamínulas na tampa de uma placa estéril de 24 poços, adicione 100 microlitros de solução PDL de 20 microgramas por mililitro a cada lamínula.

Use a ponta para garantir que o líquido cubra toda a região do grão e o restante da superfície da lamínula. Cubra a tampa com o fundo do prato e envolva as laterais do local com filme de parafina. Incube durante a noite a quatro graus Celsius.

No dia seguinte, lave as lamínulas uma vez com água bidestilada e seque no capô. Depois de preparar as cabeças dos filhotes de rato, segure-os pela boca com uma pinça grande. Corte a pele que cobre o crânio com uma pequena tesoura.

Com uma tesoura limpa, entre por baixo do crânio na lateral do cerebelo e corte o crânio para a direita e para a esquerda para permitir sua remoção. Usando uma pinça pequena, retire o crânio do cérebro. Separe o cérebro da cabeça e coloque-o em uma placa de Petri de 60 milímetros contendo dois mililitros de MEM frio.

Sob um microscópio estéreo, use duas pinças pequenas para dissecar o hipocampo. Transfira o hipocampo para o prato preparado de 35 milímetros contendo MEM. Corte o hipocampo em fatias de aproximadamente um milímetro usando o bisturi.

Adicione 200 microlitros de solução de tripsina. Misture delicadamente e incube a 37 graus Celsius e cinco a 10% de dióxido de carbono por 30 minutos. Após a incubação, adicione dois mililitros de MEM frio ao prato para desativar a tripsina.

Em seguida, use uma pipeta de vidro Pasteur com o maior diâmetro para transferir o tecido tripsinizado para um tubo de 15 mililitros contendo um mililitro do primeiro dia médio, pré-aquecido a 37 graus Celsius. Triturar o tecido passando-o pela pipeta de vidro de maior diâmetro 10 a 15 vezes. Em seguida, repita este processo usando a pipeta de vidro com o diâmetro médio.

Continue triturando com a pipeta de menor diâmetro. Evite borbulhar para reduzir a morte celular. Deixe os pedaços de tecido dissociados afundarem por dois a cinco minutos.

Em seguida, transferir o sobrenadante para outro tubo de 15 mililitros. Conte as células usando um hemocitômetro. Para atingir a densidade celular preferível entre 200.000 e 400.000 células por mililitro.

Use o primeiro dia médio para diluir. Em seguida, semeie 100 microlitros de células em cada lamínula de vidro. Certifique-se de cobrir toda a lamínula com células.

Incube a 37 graus Celsius e cinco a 10% de dióxido de carbono. No dia seguinte, adicione 500 microlitros de meio de crescimento neuronal aos poços. Usando uma pinça, remova o primeiro dia médio inclinando a lamínula e transferindo suavemente cada lamínula para o poço apropriado.

Sugue o meio restante da tampa. Incube a placa a 37 graus Celsius e cinco a 10% de dióxido de carbono. Mantenha a incubadora umidificada ao máximo usando uma bandeja de água no fundo da incubadora.

Não substitua o meio. As culturas podem ser mantidas nessas condições por até um mês. Neste estudo, as retificadoras manuais e elétricas produziram resultados semelhantes, com uma mistura de grãos variando entre 20 e 200 micrômetros de tamanho.

Os filtros manuais ou elétricos produziam dois tipos de misturas de grãos. Um com grãos variando de 40 a 200 micrômetros de tamanho e o segundo com tamanho de 40 micrômetros ou menos. Micrografias de contraste de fase mostram que o cultivo de células do hipocampo em lamínulas revestidas com grãos de esqueleto de coral formou redes neuronais complexas na ausência e presença da matriz.

A coloração dos núcleos celulares indicou que 14 dias após a semeadura, a densidade celular foi maior na matriz do que nas lamínulas não revestidas. A coloração com a proteína dois associada aos microtúbulos mostrou que uma rede neuronal e dendrítica complexa se formou na matriz em comparação com o controle. Além disso, as células gliais cultivadas na matriz do esqueleto do coral visualizadas usando a proteína glial fibrilar ácida sofreram mudanças morfológicas significativas.

Eles adquiriram uma aparência mais espinhosa, com processos mais longos, do que as células gliais cultivadas no substrato de controle, onde pareciam mais redondos e planos. Ao isolar as células, É importante lembrar de trabalhar rápido, manter o pH adicionando CO2, se necessário, e trabalhar o mais suavemente possível para evitar o desprendimento dos grãos de coral.