Classificação celular ativada pela fluorescência para o isolamento de populações celulares escleracianas
31 de maio de 2020
Os corais criam ecossistemas biodiversos importantes para humanos e organismos marinhos. No entanto, ainda não entendemos todo o potencial e função de muitas células de coral. Aqui, apresentamos um protocolo desenvolvido para o isolamento, rotulagem e separação de populações de células de corais pedregosos.
Este protocolo facilita a identificação e isolamento de populações de células de coral vivos em um nível de descrição não possível anteriormente. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o acesso a um nível de especificidade celular que até agora tem sido quase inatingível. Demonstrando o procedimento estará a Dra.
Para configurar o citômetro de fluxo para classificação de células de coral ao vivo, abra um novo modelo de projeto no software do citrômetro de fluxo e selecione os lasers apropriados para a análise no painel laser. Em seguida, crie um gráfico de dispersão lateral versus dispersão para a frente nas parcelas apropriadas para configurar a estratégia de gating e análise. Para análise citométrica de fluxo e triagem das células de coral vivos, carregue a amostra celular não manchada de controle na câmara amostral do cítômetro e inicie o processo de leitura.
Como as células de coral são particularmente frágeis, mantenha a pressão do cítômetro baixa para evitar a lise celular. No gráfico de dispersão, ajuste a tensão multiplicadora de fotos para centralizar os pontos e comece a registrar os eventos. No gráfico de dispersão dianteira versus lateral, crie um portão ao redor das células em torno da marca 10 até a 4ª marca no eixo x de dispersão dianteira.
Substitua a amostra de controle pela primeira amostra de células manchadas e registou aproximadamente 10.000 células antes de fazer uma pausa. Em seguida, portão os eventos que são exclusivos para o grupo amostral manchado. Para classificar as células de coral vivas, depois de selecionar a população celular de interesse no software do citómetro de fluxo, coloque um tubo de microcentrifusagem contendo 250 a 500 microliters da solução de coleta apropriada na câmara de coleta de cítmetros para cada população classificar.
Uma vez que uma quantidade apropriada de tempo tenha passado para eliminar os detritos, comece a classificar a população desejada para coletar entre 10.000 e vários milhões de células. Cada vez que uma nova mancha, espécie ou classificador é usado, classifique pelo menos 20.000 células de interesse em 500 microliters de meio de coloração para permitir que uma verificação de pureza seja realizada na população de interesse e reanalisar as células classificadas para confirmar que os eventos estão sendo lidos dentro do portão usado para a triagem inicial. Para estudos in vitro, armazene as células classificadas no gelo até que sejam transferidas para uma incubadora ou ambiente esterilizado.
Para trazer outras partículas não celulares que não compartilham a mesma forma ou granularidade que as células de coral podem ser removidas da análise criando uma seleção de portão em um gráfico de dispersão para frente e lateral. As células mortas podem ser excluídas comparando o sinal DAPI das suspensões celulares não manchadas e manchadas usando um histograma e gating as células altas expressas por DAPI. Em paralelo, as células que hospedam a simbiodeneasia de autofluorescência podem ser removidas gating contra células com o sinal alto no canal vermelho distante.
Após esse processo de gating iterativo, as células remanescentes representam as populações de células de coral vivas intactas que carecem de simbiodeneasia. Essas células podem então ser classificadas em diferentes subpopulações celulares por coloração para características como atividade reativa de espécies de oxigênio e/ou conteúdo líssomo. É fundamental lembrar que algumas células são mais frágeis do que outras e executar esse processo com o mais cuidado possível.
Uma vez que células específicas tenham sido isoladas, elas podem ser usadas para ensaios funcionais x-vivo, como estabelecer culturas celulares e criar perfis transcriômicos.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este estudo aborda a necessidade de um melhor entendimento das células de coral, que são cruciais para a biodiversidade nos ecossistemas marinhos. Os autores apresentam um protocolo inovador para o isolamento e marcação de populações de células de corais escleractíneos, alcançando um nível sem precedentes de especificidade celular.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Biologia de corais
- Técnicas de isolamento celular
- Biodiversidade de ecossistemas
Antecedentes
- Os corais formam ecossistemas essenciais para a vida marinha.
- O conhecimento atual sobre as funções das células dos corais é limitado.
- O isolamento de populações específicas de células de corais é fundamental para pesquisas futuras.
Métodos Utilizados
- Citometria de fluxo para separação de células vivas
- Corais pétreos como organismo modelo
- Estratégia de seleção para identificar e isolar tipos celulares específicos
Resultados Principais
- O protocolo permite a identificação e separação de populações vivas de células de coral.
- Garante a pureza e viabilidade das células separadas para ensaios futuros.
- Facilita o estudo de subpopulações e suas funções.
Conclusões
- O estudo apresenta um método confiável para o isolamento de células de coral, ampliando o potencial de pesquisa.
- Os achados contribuem com informações valiosas sobre a biologia do coral e a saúde do ecossistema.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento de populações celulares específicas a partir de tecidos complexos continua sendo um desafio crítico na validação inicial de alvos e na redução de riscos mecanicistas. A citometria de fluxo ativada por fluorescência (FACS) permite a investigação celular de alta resolução, contribuindo para a confiança preditiva em respostas específicas de vias. Essa capacidade é diretamente aplicável a fluxos de trabalho de descoberta em biofármacos que exigem ensaios funcionais precisos e perfis transcriptômicos de tipos celulares raros ou frágeis.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas com resolução em nível de célula única, isolando populações viáveis para validação funcional.
- Valor Operacional: Reduz a ambiguidade mecanicista ao separar subpopulações de células viáveis de detritos, células mortas e sinais associados a simbiontes.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao gerar insumos purificados para ensaios posteriores que esclarecem o engajamento do alvo e a modulação de vias.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Produz suspensões celulares padronizadas e viáveis, adequadas para ensaios funcionais reprodutíveis e perfilagem de resposta à dose.
- Valor Operacional: Estabelece estratégias de seleção que garantem a prontidão do ensaio e minimizam a variabilidade entre execuções experimentais.
- Escalabilidade: Permite a coleta de número suficiente de células (10.000 a vários milhões) para triagem em múltiplas placas e aplicações de ômicas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta as fases de descoberta e pré-clínica ao permitir o isolamento consistente de populações celulares relevantes para a doença, possibilitando acompanhamentos mecanicistas.
- Alinhamento de Biomarcadores: Facilita a coloração para marcadores de resposta ao estresse (por exemplo, espécies reativas de oxigênio, conteúdo de lisossomos) para correlacionar fenótipos celulares com desfechos funcionais.
- Avanço Ajustado ao Risco: Populações purificadas melhoram a confiabilidade dos dados em modelos pré-clínicos, reduzindo falsos positivos provenientes de amostras heterogêneas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A citometria de fluxo se integra ao continuum de descoberta, desde a testagem de hipóteses sobre alvos até a identificação de compostos líderes e a validação pré-clínica, ao permitir entradas celulares precisas em cada etapa.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante o isolamento de populações vivas de células de coral (ou análogas de mamíferos) para interrogatório funcional específico de vias.
- Triagem: Fornece populações celulares padronizadas e selecionadas que aumentam a reprodutibilidade dos ensaios e a confiabilidade dos resultados quantitativos.
- Análises: Gera amostras de alta pureza que permitem perfis precisos de transcriptômica, proteômica ou metabolômica para comparação entre condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta inicial à validação pré-clínica por meio da preparação consistente de subpopulações celulares viáveis e responsivas ao estresse.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma capacidade de plataforma reutilizável em diversos projetos que exigem resolução subcelular, independentemente do sistema modelo.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir o ruído proveniente de células não alvo e permitir a desvinculação mecanicista de alvos.
- Valor Operacional: Padroniza a preparação de amostras por meio de seleção reprodutível, ordenação com baixa pressão e métodos de coleta que preservam a viabilidade.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar ou não ao fornecer dados biológicos mais limpos, reduzindo o risco de falhas em estágios avançados decorrentes de suposições incorretas sobre os alvos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco por meio de dados confiáveis específicos de subpopulações que orientam os critérios de avanço.
Considerações de Implementação
- Requer experiência na configuração de citometria de fluxo, incluindo seleção de laser, otimização de voltagem e delimitação de portas em gráficos de dispersão para células frágeis.
- Depende de instrumentação capaz de separação em baixa pressão e detecção multiparamétrica (dispersão para frente/lateral, canais de fluorescência).
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de marcação, meios de coleta e limiares de delimitação de portas para garantir reprodutibilidade.
- Deve levar em conta a variabilidade na fragilidade celular entre espécies ou condições, exigindo otimização iterativa do estresse cisalhante e da duração da marcação.
- Limitado pela qualidade da preparação da amostra; a dissociação enzimática ou mecânica deve preservar a integridade do epítopo e a viabilidade celular para uma separação precisa.
