Modificação genética de cianobactérias por conjugação usando o kit de ferramentas de clonagem modular CyanoGate
31 de outubro de 2019
Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo como i) montar um vetor auto-replicante usando o kit de ferramentas de clonagem modular CyanoGate, ii) introduzir o vetor em um hospedeiro cianobacteriano por conjugação, e iii) caracterizar cepas transgênicas de cianobactérias usando um leitor de placa ou citometria de fluxo.
As cianobactérias são um importante filo de micróbios fotossintéticos que são cada vez mais reconhecidos como plataformas úteis para biologia sintética e aplicações de biotecnologia renovável. Assim, desenvolver técnicas robustas para simplificar o design, clonagem e introdução de DNA heterólogo em diferentes espécies cianobacterianas é importante. Assim, esta técnica demonstra um método bem estabelecido chamado conjugação ou acasalamento triparental para introduzir DNA em espécies cianobacterianas que não são naturalmente transformáveis.
A conjugação tem sido realizada com sucesso em uma ampla gama de cepas cianobacterianas de células únicas a espécies filamentous multicelulares. Se você está tentando esta técnica pela primeira vez, por favor, tome cuidado para lidar tanto com suas cepas cianobacterianas quanto suas cepas de E.coli com cuidado. Por exemplo, não centrifugar acima dos valores dados no protocolo e não vórtice.
Misturar bactérias e cianobactérias pode parecer estranho para usuários iniciantes. Esperamos que, demonstrando o processo de conjugação, ajudemos a esclarecer isso. Após a construção de montagens de nível um, escolha um vetor de aceitação de nível T apropriado.
Escolha um link final apropriado para ligar a extremidade três prime do conjunto de nível um final para a espinha dorsal nível T. Para montar um ou mais conjuntos de nível um no nível T, prepare uma mistura de reação com PBI1 e o vetor de link final necessário. Configure o programa de cicloviário térmico e prossiga de acordo com o manuscrito.
No primeiro dia, cresça a cultura cianobacteriana criando uma nova cultura de Synechocystis PCC 6803 ou Synechococcus elongatus UTEX 2973. Com um laço estéril térmico, raspe as células da placa de ágar BG-11 axenic e coloque em um frasco cônico de 100 mililitros cheio de 50 mililitros de médio BG-11 fresco para inoculado. Coloque o frasco em uma incubadora agitada com iluminação para cultivar as culturas celulares Synechocystis PCC 6803 a 30 graus Celsius a 100 RPM.
Para Synechococcus elongatus UTEX 2973, cresça as culturas celulares a 40 graus Celsius a 100 RPM. Após um a dois dias, desenhe um milímetro da cultura celular e meça em um espectrômetro. A absorvância em OD 750 atinge 0,5 a 1,5.
No segundo dia, inocular uma cepa de ajudante MC1061 E.coli contendo vetores PRK24 e PRL528 em cinco mililitros de meio LB com ampicillina a uma concentração de 100 microgramas por mililiter e clorograma a uma concentração de 25 microgramas por mililitro. Cresça a 37 graus Celsius durante a noite a 225 RPM em uma incubadora de agitação. Em seguida, inocular cinco mililitros de meio LB contendo antibióticos apropriados com a cultura E.coli carregando o vetor de carga nível T.
Cresça a cultura a 37 graus Celsius durante a noite a 225 RPM em uma incubadora agitada. No terceiro dia, centrifugar o ajudante e a carga E.coli durante a noite culturas a 3.000 g por 10 minutos em temperatura ambiente. Descarte o supernatante sem perturbar a pelota celular.
Lave as pelotas adicionando cinco mililitros de meio LB fresco sem antibióticos. Resuspenque a pelota tubondo suavemente para cima e para baixo e centrífuga para remover o supernatante. Repita esta etapa de lavagem três vezes para remover antibióticos residuais da cultura da noite para o dia.
Após a última lavagem, resuspenja a pelota celular pela metade do volume do meio LB do volume de cultura inicial. Em seguida, combine 450 microliters da cepa auxiliar com 450 microliters da cepa de carga em um tubo de dois mililitros e deixe em temperatura ambiente. Em seguida, prepare a cultura cianobacteriana centrifugando um mililitro da cultura cianobacteriana a 1.500 g por 10 minutos em temperatura ambiente.
Em seguida, descarte o supernatante cuidadosamente sem perturbar a pelota celular. Lave a pelota quatro vezes adicionando um novo meio BG-11 do mesmo volume inicial. Adicione 900 microliters da cultura cianobacteriana lavada a 900 microliters das cepas combinadas de E.coli em um tubo de dois mililitros.
Misture as culturas gentilmente se esforçando para cima e para baixo. Incubar a mistura em temperatura ambiente por 30 minutos para Synechocystis PCC 6803 ou duas horas para Synechococcus elongatus UTEX 2973. Centrifugar a mistura a 1.500 g durante 10 minutos em temperatura ambiente.
Remova 1,6 mililitros do supernasce e resuspense a pelota no restante do supernatante. Coloque um filtro de membrana de 0,45 mícria em uma placa de ágar LB BG-11 sem antibióticos. Espalhe cuidadosamente 200 microlitadores da mistura de cultura E.coli/cianobacteriana na membrana com um espalhador estéril ou uma ponta dobrada estéril.
Sele a placa com filme de parafina e coloque a placa em uma incubadora iluminada por 24 horas. Após 24 horas, transfira cuidadosamente a membrana usando fórceps esterilizados por chama para uma placa de ágar BG-11 fresca contendo antibióticos apropriados para selecionar para o vetor de carga. Sele a placa com filme de parafina e incubar sob as mesmas condições anteriormente até que as colônias apareçam.
Colônias normalmente aparecem após 7-14 dias para Synechocystis PCC 6803 e 3-7 dias para Synechococcus elongatus UTEX 2973. Para selecionar conjugantes, usando uma haste inoculante estéril de calor, selecione pelo menos duas colônias individuais da membrana e listrada em uma nova placa de ágar BG-11 contendo antibióticos apropriados. Em seguida, inocular uma raia de cultura cianobacteriana em um tubo de centrífuga de 15 mililitros contendo cinco mililitros de meio LB e incubar a 37 graus Celsius durante a noite a 225 RPM em uma incubadora de agitação.
A cultura clara confirma a ausência de contaminação por E.coli. Após um período de crescimento suficiente de sete dias, escolha colônias axenic individuais para criar culturas líquidas para armazenamento criogeno de longo prazo ou experimentação subsequente. Neste estudo, foi demonstrado o fluxo de trabalho de montagem do Golden Gate.
Após a transformação da reação da assembleia, foram identificadas assembleias bem sucedidas utilizando-se de triagem branca azul padrão das colônias E.coli. O de expressão eYFP no vetor nível um e no vetor de link final um vetor foram então montados em um vetor de aceitação nível T para dar ao vetor cpcBA-eYFP. O vetor cpcBA-eYFP montado foi verificado por restrição de digestão.
A transferência conjugal bem sucedida do cpcBA-eYFP ou do vetor pPMQAK1-T resultou no crescimento de até várias centenas de colônias na membrana para synechocystis PCC 6803 e Synechococcus elongatus UTEX 2973. Como esperado para o forte promotor Pcpc560, os valores para fluorescência eYFP normalizada do leitor de placas e fluorescência eYFP por célula do citômetro de fluxo foram elevados em comparação com o controle negativo. Tanto com o leitor de placas quanto com o citómetro de fluxo, os valores de fluorescência foram mais elevados em Synechococcus elongatus UTEX 2973 do que em Synechocystis PCC 6803.
Certifique-se de incubar pelo tempo mínimo de acordo com qual cepa você está conjugando.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para montar um vetor autorreplicável utilizando o kit modular de clonagem CyanoGate e introduzi-lo em hospedeiros cianobacterianos por conjugação. Destaca a importância dessas técnicas para simplificar o projeto e a clonagem de DNA heterólogo em cianobactérias, que são valiosas para aplicações em biologia sintética.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Biologia sintética
- Biotecnologia
- Engenharia genética de cianobactérias
Antecedentes
- Cianobactérias são microrganismos fotossintéticos importantes utilizados na biotecnologia renovável.
- A conjugação é um método para introduzir DNA em cianobactérias que não são naturalmente transformáveis.
- São necessárias técnicas robustas para clonagem de DNA em diversas espécies de cianobactérias.
Métodos Utilizados
- Montagem de vetores autorreplicantes utilizando o kit CyanoGate.
- Conjugação para introduzir DNA em cianobactérias.
- Caracterização utilizando leitores de placas e citometria de fluxo.
Resultados Principais
- Construção e verificação bem-sucedidas do vetor cpcBA-eYFP.
- Conjugação bem-sucedida demonstrada em Synechocystis PCC 6803 e Synechococcus elongatus UTEX 2973.
- Estabelecimento de técnicas para seleção de cianobactérias transgênicas.
Conclusões
- O estudo ilustra um método confiável para manipulação genética de cianobactérias.
- Destaca avanços em ferramentas para biologia sintética e aplicações renováveis.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Fluxos de trabalho padronizados de clonagem modular e conjugação, como os possibilitados pelo kit CyanoGate, são fundamentais para acelerar a engenharia genética em cianobactérias. Essas capacidades simplificam a construção e transferência de vetores de expressão, apoiando testes rápidos de hipóteses e validação funcional em processos biotecnológicos renováveis. A abordagem aumenta a confiança preditiva e a escalabilidade para descobertas em estágios iniciais e desenvolvimento de linhagens plataforma.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Facilita a montagem e o teste rápidos de construtos genéticos para a investigação de vias metabólicas.
- Permite a validação funcional de promotores e partes genéticas em hospedeiros cianobacterianos relevantes.
- Apoia a desmistificação biológica ao permitir a medição direta dos produtos de expressão.
- Melhora a confiança preditiva na seleção de alvos em plataformas microbianas fotossintéticas.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prepara cepas de cianobactérias geneticamente definidas para fluxos de trabalho de triagem posteriores.
- Padroniza a montagem e transferência de vetores, garantindo reprodutibilidade entre experimentos.
- Permite leituras quantitativas por meio de marcadores fluorescentes utilizando leitores de placas e citometria de fluxo.
- Apoia plataformas de ensaio escaláveis e reutilizáveis para aplicações em biologia sintética.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Alinha sistemas de cianobactérias modificadas com as linhas de desenvolvimento de cepas industriais.
- Garante a continuidade da validação de partes genéticas até a otimização de cepas pré-clínicas.
- Reduz os riscos no avanço de cepas modificadas rumo a aplicações em bioprodução.
- Permite a comparação de construtos genéticos em múltiplas espécies de cianobactérias.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O fluxo de trabalho modular de clonagem e conjugação CyanoGate integra-se na interface entre descoberta inicial e engenharia de linhagens, permitindo uma progressão contínua desde o design do construto até a validação funcional em cianobactérias.
- Biologia do Descobrimento: Apoia testes baseados em hipóteses de elementos genéticos e sequências regulatórias.
- Triagem: Fornece saídas quantitativas reprodutíveis de fluorescência para análise comparativa.
- Análises: Utiliza dados de leitor de placas e citometria de fluxo para avaliar o desempenho de construtos.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta científica ao desenvolvimento pré-clínico de cepas para bioprodução renovável.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho padronizado e modular, adaptável a diversos hospedeiros cianobacterianos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade na função de partes genéticas.
- Valor Operacional: Aprimora a reprodutibilidade, padronização e escalabilidade dos fluxos de trabalho de engenharia.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de prosseguir/interromper e alocação eficiente de recursos no desenvolvimento de plataformas.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de cepas projetadas para desenvolvimento adicional.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em clonagem molecular, cultivo de cianobactérias e técnicas de conjugação.
- Requer acesso a ciclos térmicos, espectrofotômetros, leitores de microplacas e citômetros de fluxo.
- Exige padronização rigorosa entre equipes para montagem e transferência reprodutíveis de vetores.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes espécies de cianobactérias ou fundos genéticos.
- Manuseio cuidadoso é essencial para prevenir contaminação e garantir conjugação bem-sucedida.
