Métodos de Cultura para determinar o limite de detecção e sobrevivência em mídia de transporte de Campylobacter Jejuni em espécimes fecais humanos

A dificuldade da cultura Campylobacter tem inibido estudos fundamentais, como como poucas bactérias são necessárias para produzir doenças. Estas amostras analíticas e inventadas combinadas utilizadas aqui podem abordar essa questão. Esta técnica permite que os sintomas clínicos relevantes do paciente sejam correlacionados com um resultado positivo da cultura fecal e, pela primeira vez, um número real de bactérias.

Aprender quantas bactérias se correlacionarão com a doença fornecerá diagnósticos, um objetivo importante para a detecção e um método sólido para comparar a virulência entre cepas ou espécies de Campylobacter. A cultura campylobacter é simples, mas requer uma preparação rápida e organizada para manter a viabilidade quantitativa. Também é necessário um julgamento considerável para identificar as colônias de Campylobacter entre a flora fecal concorrente em uma placa.

Antes de iniciar uma cultura C.jejuni ou C.coli, coloque luvas, um jaleco e óculos de segurança, e coloque uma folha de proteção descartável dentro de um capô de segurança de fluxo laminar desinfetado. Usando uma linha de técnica estéril a cada estoque bacteriano hidratado ou descongelado em uma placa de ágar específica campylobacter e coloque a placa a 37 graus Celsius por 48 horas em um frasco anaeróbico contendo um gás microaeróbico gerando sachê. 24 horas depois, cubra um frasco de caldo BHI e coloque o frasco em um novo frasco anaeróbico com um sachê que produzirá um ambiente microaeróbico para uma incubação noturna a 37 graus Celsius.

Na manhã seguinte use três mililitros do caldo pré-reduzido e um laço inoculante para raspar a placa inicial da cultura Campylobacter. Transfira o chorume para um tubo estéril e inocula os 97 mililitros restantes do caldo pré-reduzido com os três mililitros de chorume raspado. Coloque o caldo no frasco com o sachê a gás e incubar a cultura a 37 graus Celsius e 115 revoluções por minuto em uma incubadora agitada por 48 a 72 horas, até que a cultura atinja uma densidade óptica de 600 nanômetros de no máximo 4.

Para estabelecer o número de bactérias nesta cultura de estoque puro realizar oito séries de diluição 10 vezes de 100 microliters de caldo em 900 microliters de diluição. Usando contas de revestimento estéreis, espalhe 100 microlitadores de uma vez 10 para o quinto negativo para o quinto negativo para as sete diluições negativas em placas específicas de Campylobacter pré-reduzidas duplicadas e placas de etiqueta com a concentração de diluição antes de colocar as placas em um segundo frasco anaeróbico com um sachê gerador de gás por 48 a 72 horas a 37 graus Celsius. Ao final do período de crescimento, selecione placas com entre 30 a 300 colônias para contagem.

Após a contagem, use as contagens para determinar a colônia formando unidades por mililitro da cultura do caldo de estoque de acordo com a fórmula. É fundamental que a contagem de colônias analíticas seja precisa, pois isso sustenta todos os passos usando piscina fecal cravada. Imediatamente após a contagem, como demonstrado, misture volumes iguais de caldo e piscina fecal negativa de Campylobacter e faça nove diluições subsequentes em piscina fecal negativa, adicionando uma placa de controle com caldo que não contém Campylobacter à piscina fecal para ajudar a identificar as colônias não-Campylobacter.

Raia 10 microliters de cada diluição de fezes campylobacter em placas de ágar específicas de Campylobacter duplicadas e incubar as placas em frasco anaeróbico com um sachê gerador de gás a 37 graus Celsius por aproximadamente 48 horas. No final da incubação, examine visualmente as placas listradas para colônias que se assemelham às culturas puras de Campylobacter. Para confirmar que as colônias são na verdade Campylobacter selecione vários Campylobacter como colônias para coloração de grama e visualize uma área finamente listrada por microscopia leve usando uma lente de imersão de óleo para identificar pequenas bactérias curvadas, espiral ou em forma de charuto.

Uma placa de controle negativa sem adição de Campylobacter é importante para ajudar a identificar outras flora fecal. Considere a última diluição que contém uma colônia visual de Campylobacter como gram-negativo o limite de detecção de cultura. E use a fórmula para calcular a colônia formando unidades por mililitro da diluição positiva em espécime fecal clínico inventado.

Para determinar a viabilidade de Campylobacter armazenado em meio de transporte misture um mililitro da cultura do caldo campylobacter com um mililitro de piscina fecal negativa e prepare 10 diluições seriais duplicadas em piscina fecal negativa. Diluir cada diluição a uma proporção adicional de um a quatro no meio Cary-Blair e armazenar os 20 tubos de diluição e um controle negativo no meio Cary-Blair em tubos de tampa a dois a oito graus Celsius por 96 horas. Começando no tempo zero e a cada 24 horas depois, 10 alíquotas de microliter de cada diluição em placas de ágar seletivas de Campylobacter e incubar as placas a 37 graus Celsius por 48 horas.

Como não há um método independente para estabelecer números bacterianos precisos a partir de amostras de pacientes, duas medidas simultâneas podem ser feitas com um estoque bacteriano puro. Um teste é usado para a detecção visual de colônias de Campylobacter a partir de diluições seriais das bactérias do estoque em uma matriz fecal, simulando espécimes clínicos. O outro teste é usado analiticamente, quantificar as unidades formadoras da colônia por mililitro presente na mesma cultura de estoque de bactérias usada para o espetamento.

Um parâmetro-chave para o sucesso é identificar as colônias de tamanhos entre as flora fecal concorrentes, como ilustrado por esta placa representativa da cultura das fezes cravadas. Aqui, podem ser observados dados típicos de sete experimentos independentes. Simplesmente identificar colônias que se assemelham a Campylobacter dentro das culturas fecais não é suficiente.

Todas as colônias devem ser confirmadas com mancha de grama ou métodos mais avançados. Usamos um imunoensaio enzimático que é mais preciso do que a cultura para detectar espécies incomuns como C.upsaliensis ou C.lari, que crescem mal com antibiótico padrão contendo ágar. Esta técnica estabelece uma base necessária para estudar coisas como o transporte não sintomático de Campylobacter e se altas cargas bacterianas colocam um paciente em maior risco para graves consequências da infecção por Campylobacter.

Use sempre EPI ao trabalhar com bactérias, que muitas vezes são infecciosas e podem ser perigosas, e com a piscina fecal negativa que pode conter patógenos desconhecidos mesmo quando coletados de doadores saudáveis.