Um ensaio de carga bacteriana molecular de tuberculose (TB-MBLA)
30 de abril de 2020
Descrevemos um teste de ensaio de carga bacteriana molecular de tuberculose realizado após a inativação do calor da escória. A inativação do calor torna as amostras de espelo não infecciosas e evita a necessidade de laboratórios de nível de contenção 3 para testes moleculares de tuberculose.
Este ensaio molecular bacteriano da tuberculose responde a três perguntas-chave. Qual: Qual é a magnitude da carga da doença do paciente? Dois: Como a carga da doença do paciente responde à medicação anti-tuberculose?
E três: Qual é a relação entre a carga da doença e a resposta ao tratamento? Este ensaio produz um resultado quantitativo da carga de tuberculose do paciente, e mede como essa carga muda com o tratamento em pouco tempo. Com a modificação, essa metodologia pode ser aplicada a outros patógenos bacterianos.
Já desenvolvemos tecnologia semelhante para diagnóstico de micobactérias não intuberréuas e bactérias associadas à doença pulmonar obstrutiva crônica. Ao executar essa técnica pela primeira vez, assista ao vídeo e pratique os passos. É muito importante praticar com amostras que não são necessárias para os resultados diagnósticos dos pacientes.
A demonstração visual é fundamental porque simplifica o aprendizado e o domínio das etapas, especialmente as partes do método que são difíceis de explicar no texto. Comece preparando as culturas celulares. Em um banco de laboratório limpo ou cabine classe um, colher uma alíquota mililitro de fase exponencial Bacille Calmette-Guerin ou bcg cultura em tubos plásticos de 15 mililitros e fechá-los firmemente.
Ao preparar amostras de escarro do paciente, trabalhe em um espaço bem ventilado e siga as orientações no manual GL One Stop TB. Abra cuidadosamente o copo de espécime e a pipeta de um mililitro em tubos de centrífugas de plástico de 15 mililitros. Então, feche bem os tubos.
Transfira os tubos de amostra para um rack de retenção imerso em um banho de água pré-aquecido a 95 graus Celsius, certificando-se de que 3/4 de cada tubo esteja imerso. Ferva as amostras por 20 minutos. Em seguida, transfira os tubos para o banco para esfriar em temperatura ambiente por cinco minutos.
Realize a extração de RNA em um capô de fumaça se usar um kit com clorofórmio fenol ou etanol de capital tumoral. O procedimento de RNA ilustrado aqui é o procedimento de extração de clorofórmio fenol. No entanto, métodos alternativos para extração de RNA também podem ser usados.
Transfira uma alíquota mililitro da amostra inativada de calor para tubos de 1,5 mililitros e espete 100 microliters de controle de extração em cada amostra. Feche os tubos e misture-os invertendo três vezes. Centrifugar os tubos a 20.000 vezes g por 10 minutos.
Em seguida, aspire o supernascer, deixando 50 microliters de sedimentos. Suspendemos o sedimento em 950 microliters de tampão de lise por pipetação e transferimos toda a suspensão para os tubos de matriz de lise fornecidos com o kit de extração de RNA. Feche bem os tubos e certifique-se de que eles estejam rotulados tanto na tampa quanto na lateral.
Em seguida, homogeneize as amostras por 40 segundos a 6.000 rpm. Centrifugar o lise a 12.000 vezes g durante cinco minutos em temperatura ambiente. Enquanto isso, prepare tubos frescos de um mililitro, e adicione 300 microliters de clorofórmio.
Use uma pipeta de um mililitro para aspirar cuidadosamente o supernaente sem tocar na matriz de lise e transferi-la para o tubo com o clorofórmio. Vórtice os tubos por cinco segundos e deixá-los se contentar por cinco minutos ou até que três fases estejam claramente visíveis. Centrifugar os tubos a 12.000 vezes g durante cinco minutos.
Em seguida, pipeta cuidadosamente a fase superior e transfira-a para um tubo de 1,5 mililitro. Adicione 500 microliters de gelo frio 100% etanol à amostra, feche o tubo e inverta-o três vezes para misturar. Incubar os tubos a menos 80 graus Celsius por 15 minutos ou a menos 20 graus Celsius por 30 minutos.
Em seguida, carregue os tubos em uma micro centrífuga pré-resfriada e centrífuga por 20 minutos a 13.000 vezes g e quatro graus Celsius. Descarte o supernascer, adicione 500 microliters de 70% de etanol gelado e centrífuga por mais 10 minutos a 13.000 vezes g. Descarte todos os supernaspentes.
E incubar os tubos a 50 graus Celsius por 20 minutos para secar a pelota de ácido nucleico, certificando-se de manter os tubos parcialmente abertos para permitir a evaporação do etanol. Em seguida, adicione 100 microliters de núcleo de água livre ao pelotização e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos. Vórtice a amostra por três segundos e proceda com a remoção de DNA ou armazená-la a menos 80 graus Celsius até estar pronta para uso.
O DNA preparado é uma mistura de acordo com as instruções do manuscrito e pipetas 11 microliters em cada tubo contendo extrato de RNA. Vórtice por três segundos e gire brevemente para remover quaisquer gotículas da parede do tubo. Em seguida, incubar o tubo a 37 graus Celsius por 30 minutos no bloco quente ou incubadora.
Após a incubação, adicione um microliter adicional de uma enzima do DNA diretamente ao tubo, e misture bem com o vórtice. Em seguida, incubar os tubos por mais 30 minutos a 37 graus Celsius. Descongelar e vórtice o reagente de inativação do DNA.
Em seguida, adicione 10 microliters a cada extrato de RNA. E incubar os tubos em temperatura ambiente por cinco minutos. Vórtice dos tubos três vezes durante a etapa de incubação.
Em seguida, centrifugar a mistura a 13.000 vezes g por dois minutos e transferir cuidadosamente o supernasal para um tubo livre de RNA de 1,5 mililitro, certificando-se de não tocar em nenhuma das matriz de inativação. Diluir todas as amostras de RNA desconhecidas de um a 10 na água livre do RNA, então, misture-as por vórtice por cinco segundos e girando-as brevemente para baixo. Descongele amostras de MTB e EC-RNA e faça diluições de sete e seis vezes, respectivamente, para uma curva padrão.
Prepare RT plus e RT menos PCR master mixes de acordo com as instruções do manuscrito. Vortex o RT plus misturar e transferir 16 microliters para cada tubo RT plus PCR. Em seguida, o vórtice rt menos misturar e adicionar 16 microliters em cada tubo RT menos PCR.
Adicione quatro microliters de extrato de RNA ou água e duplique nos tubos RT plus. A água é o controle não-modelo ou NTC. Adicione quatro microliters de extrato de RNA ou água aos tubos RT menos.
Carregue os tubos de reação na máquina PCR em tempo real, programe a reação conforme descrito no manuscrito e execute a reação. Para interpretar a resposta ao tratamento, use a curva padrão para converter valores de QC em carga bacteriana e calcular a resposta como a mudança na carga bacteriana durante o período de seguimento do tratamento. A queda da carga bacteriana após o tratamento significa uma resposta positiva, enquanto nenhuma alteração ou aumento da carga bacteriana implica uma resposta negativa.
Para verificar se todos os bacilos de M.tuberculosis eram inativados pelo calor, a densidade óptica das células foi medida e comparada com a das células vivas. Não foi observada alteração no OD ao longo do tempo para as amostras inativadas de calor que não indicam crescimento. Amostras inativadas por calor foram incubadas a 37 graus Celsius para determinar se o RNA se degrada após a inativação térmica das células.
Não foi encontrada diferença entre o RNA colhido imediatamente após a inativação do calor, e o RNA isolou um, dois, três e quatro dias depois em ambas as culturas BCG e tb positiva. Quando a enzima A do RNA foi exogenously adicionada às amostras, antes e depois da inativação do calor, a perda de RNA ocorreu em todas as amostras inativadas de calor ao longo de quatro dias de incubação. O efeito da inativação de calor no RNA ribossômico foi medido nas culturas BCG e na escarro de pacientes positivos da TB.
A carga bacteriana medida de cultura de controle foi maior do que a carga bacteriana combinada de cultura inativada por calor a 80 graus Celsius, 85 graus Celsius e 95 graus Celsius para amostras de BCG e escarro. A inativação térmica das amostras causa perda mínima de RNA, deixando RNA adequado para TB-MBLA a jusante e outros testes moleculares a jusante. A Microscopia Eletrônica de Transmissão foi usada para investigar se as células são líspidas pela inativação do calor.
A inspeção das células em ampliação cada vez maior revelou as paredes celulares intactas e os corpos lipídudos intracelulares visíveis. As células pareciam alongadas, mas não líssedas. Ao tentar este procedimento, é fundamental lembrar de adicionar o controle de extração, que controla quaisquer resultados falsos negativos devido à má extração de RNA.
Essa abordagem pode ser aplicada a bactérias associadas à doença pulmonar obstrutiva crônica, infecção por micobactérias não intuberculous e outros patógenos respiratórios. Os resultados quantitativos da TB-MBLA permitiram a modelagem matemática e farmaco de como os pacientes respondem a uma terapia de tuberculose. Esperamos aplicar a técnica no cuidado de rotina onde os pacientes com tuberculose estão sendo gerenciados.
Visão Geral
Este artigo descreve um ensaio molecular de carga bacteriana para tuberculose realizado após a inativação térmica de amostras de escarro. Este método torna as amostras não infecciosas, permitindo testes mais seguros sem a necessidade de laboratórios de alta contenção.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microbiologia
- Doenças Infecciosas
- Métodos Diagnósticos
Contexto
- A tuberculose é um problema significativo de saúde global.
- A medição precisa da carga bacteriana é crucial para o monitoramento do tratamento.
- Os métodos tradicionais exigem contenção elevada devido às amostras infecciosas.
- A inativação pelo calor fornece uma alternativa mais segura para o manuseio de amostras.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um ensaio seguro e eficaz para medir a carga bacteriana da tuberculose.
- Avaliar a carga da doença do paciente e a resposta ao tratamento.
- Fornecer uma metodologia aplicável a outros patógenos bacterianos.
Métodos Utilizados
- Inativação térmica de amostras de escarro a 95 graus Celsius.
- Extração de RNA utilizando fenol-clorofórmio ou métodos alternativos.
- PCR em tempo real para quantificação da carga bacteriana.
- Preparação de curva padrão para medição precisa.
Resultados Principais
- O ensaio fornece resultados quantitativos da carga de tuberculose.
- Ele mede efetivamente as alterações na carga bacteriana com o tratamento.
- A metodologia pode ser adaptada para outras infecções bacterianas.
- Demonstrações visuais aprimoram a aprendizagem e o domínio da técnica.
Conclusões
- O ensaio desenvolvido é uma alternativa segura para testes de tuberculose.
- Permite o monitoramento eficaz da resposta ao tratamento.
- Potencial para aplicação mais ampla no diagnóstico de outros patógenos bacterianos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O TB-MBLA fornece um método quantitativo baseado em RT-qPCR para medir a carga bacilar de Mycobacterium tuberculosis em amostras de escarro, permitindo a avaliação objetiva da carga da doença e da resposta ao tratamento. Ao incorporar a inativação térmica, o ensaio permite o manuseio seguro de amostras infecciosas fora de instalações com alta contenção, apoiando uma aplicação mais ampla em ambientes de pesquisa básica e translacional. Essa capacidade auxilia na validação de alvos e na redução de riscos mecanicistas no desenvolvimento de fármacos anti-infecciosos, fornecendo biomarcadores reprodutíveis e quantificáveis da carga do patógeno.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a quantificação de alterações na carga bacteriana como uma leitura direta do engajamento do alvo e da eficácia do fármaco.
- Valor Operacional: Fornece uma medida padronizada e reprodutível da carga de patógenos que apoia decisões de avançar/não avançar na otimização de compostos líderes.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Gera medições quantitativas de variáveis dependentes (eCFU/mL) por meio de valores de Cq e curvas-padrão, permitindo análises de resposta à dose e em função do tempo em triagens antimicrobianas.
- Valor Operacional: Fornece leituras escalonáveis e compatíveis com alto rendimento após extração de RNA e RT-qPCR, apoiando a padronização de ensaios em bibliotecas de compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Apoia sistemas relevantes para doenças ao medir a carga bacteriana em matrizes clinicamente relevantes (escarro), vinculando achados in vitro à dinâmica do patógeno ex vivo.
- Valor Operacional: Facilita a continuidade translacional do descobrimento até a validação pré-clínica, fornecendo um biomarcador consistente da resposta ao tratamento em todas as fases do estudo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O TB-MBLA insere-se no continuum de descoberta, desde a fase inicial de testes de hipóteses até a avaliação de eficácia pré-clínica, onde a carga quantitativa do patógeno atua como uma ponte mecanicista entre a exposição ao composto e o resultado biológico.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao medir a carga bacteriana como parâmetro funcional da atividade anti-tuberculosa.
- Triagem: Permite a prontidão do ensaio por meio de protocolos padronizados de extração de RNA e RT-qPCR que geram resultados quantitativos e reprodutíveis para avaliação de compostos.
- Análises: Gera valores de Cq e medidas de eCFU/mL derivadas da curva padrão, permitindo comparação entre condições e análise estatística dos efeitos do tratamento.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica utilizando amostras derivadas de escarro para refletir a carga bacteriana clinicamente relevante, apoiando decisões de avanço com ajuste de risco.
- Reutilização Corporativa: Representa uma capacidade reutilizável para quantificação da carga bacteriana em diferentes patógenos, com aplicabilidade comprovada em micobactérias não tuberculosas e bactérias associadas à DPOC.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva na validação de alvos por meio de um biomarcador quantitativo e mecanicamente vinculado à carga bacteriana.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade e escalabilidade por meio da inativação térmica, extração padronizada de RNA e RT-qPCR com controles internos de extração.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir decisões precoces de prosseguir/não prosseguir baseadas em dados, com base em alterações mensuráveis na carga do patógeno.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização ajustada ao risco ao fornecer um biomarcador translacional que se correlaciona com a resposta ao tratamento nas fases de descoberta e pré-clínica.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em biossegurança molecular, manipulação de RNA e fluxos de trabalho de RT-qPCR para gerenciar as etapas de inativação térmica e extração.
- Depende do acesso a equipamentos de PCR em tempo real, armazenamento refrigerado para reagentes e espaços laboratoriais compatíveis com normas de biossegurança para o processamento inicial das amostras.
- Necessita padronização entre equipes no que se refere à extração de RNA e ao uso de controles de inibição, a fim de garantir resultados consistentes entre diferentes locais.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o ensaio a diferentes tipos de amostras ou patógenos bacterianos além do Mtb.
- Inclui limitações práticas, como perda de RNA de <60% log10 eCFU/mL devido à lise induzida pela inativação térmica, o que pode afetar a sensibilidade em amostras com baixa carga.
