Usando embriões de zebrafish Tg (Vtg1:mcherry) para testar os efeitos estrogênicos dos compostos disruptivos endócrinos

Há um alto número de produtos químicos EDC em nosso ambiente, principalmente substâncias estrogênicas. A diversidade química das substâncias pertencentes ao grupo dificulta seus testes, pois diferentes métodos são necessários para sua detecção. Com base na estrutura química, é realmente difícil determinar se uma substância é realmente capaz de funcionar como um estrogênio.

Além disso, essas substâncias nunca estão presentes de forma pura no ambiente, de modo que seus efeitos podem ser influenciados por outros compostos, também. Esse problema é resolvido por métodos de dialética de efeito, como o uso de biomonitor, organismos bioindicadores que mostram efeito estrogênio. Sabe-se que certos genes reagem sensivelmente ao estrogênio em organismos vivos.

A detecção de produtos genéticos por métodos moleculares também é possível no nível de proteína ou mRNA, mas geralmente envolve sacrifício animal. As leis de proteção animal têm se tornando mais rigorosas, e há uma demanda crescente por sistemas de teste alternativos. As tecnologias multigend genéticas representam a possibilidade com esse desenvolvimento e com a descoberta de proteínas fluorescentes, o caminho para a criação de biomarcadores foi pavimentado.

Com a ajuda de tais ativações de genes sensíveis ao estrogênio pode ser testada in vivo. Neste vídeo, um possível método de uso de vtg:1mCherry transgene zebrafish embriões está sendo mostrado para o teste de substâncias estrogênicas com a ajuda de dois compostos. O protocolo pode servir como pano de fundo para estudar o efeito estrogênio de diferentes amostras químicas ou ambientais em embriões biomarcadores.

A linha de zebrafish usada em nossos experimentos é uma linha de zebrafish transgênicos repórter de vitellogenina. A linha foi criada usando o sistema Tol2 Transposon. A construção transgênica utilizada para o desenvolvimento carregava a longa sequência de promotores de vitellogenina-1 naturais, com um alto número de lados ERI.

A expressão do sinal fluorescente na fêmea sexualmente madura é contínua. No entanto, em machos em embriões, ele só aparece pela ação ou presença de substâncias estrogênicas, de modo que estes últimos são mais adequados para testes. A sensibilidade e a usabilidade dos embriões da linha foram testadas em vários compostos estrogênicos, bem como em amostras ambientais.

Todos os experimentos em animais vivos foram realizados de acordo com a Lei húngara de Bem-Estar Animal e todos os estudos foram concluídos antes que os animais chegassem à fase de alimentação gratuita. Encha os tanques de acasalamento com água do sistema e configure os peixes para acasalar antes de colher ovos. Coloque peixes machos e fêmeas no tanque, e separe-os com a ajuda de um divisor.

Remova o divisor dos tanques enquanto a luz se acende na manhã seguinte. Verifique os tanques de acasalamento em busca de ovos a cada 15 a 20 minutos. Colher todos os embriões usando um coador de chá, ou densamente tecido, malha fina, e combiná-los em uma grande placa de Petri com tampão E3, ou água clara do sistema.

Coloque os embriões nas incubadoras a 25,5 graus Celsius. Uma a uma hora e meia depois, remova e descarte ovos não fertilizados ou inadequadamente divididos com uma pipeta de transferência de plástico sob um microscópio dissecando. Coloque os embriões selecionados nos vasos de tratamento, por exemplo, em placas de Petri ou placas de cultura tecidual, que já foram rotuladas e preenchidas com diferentes concentrações da substância de ensaio.

Incubar os embriões a 25,5 graus Celsius até o final do experimento. Atualize a solução de teste se for necessário para manter a concentração do tratamento. Tenha cuidado ao alterar a solução de teste, a fim de evitar danificar os embriões.

Prepare 4% de methoseladose com ms 222 de antemão. Coloque as larvas de cinco dias de idade em uma placa de Petri de cinco centímetros por grupo de tratamento com uma pipeta plástica. Remova a solução de tratamento das larvas com uma pipeta plástica e encha a placa de Petri com dois mililitros de solução anestésico ms 222.

Encha cada quadrado de uma placa petri de 10 centímetros especialmente projetada com 4% de metoseladose ms 222. Transfira as larvas anestesiadas para mehoseladose com um pouco de água em uma das duas praças. Do primeiro quadrado, transfira as larvas para o segundo quadrado.

No segundo quadrado, gire e oriente larvas para o lado esquerdo e pressione-as suavemente até o fundo do com uma ponta de pipeta de microcarregador cortada até dois centímetros. Para avaliar o sinal do repórter expresso, imagem os embriões na mesma visão e configurações. Coloque a placa de Petri no palco do microscópio.

Concentre-se no fígado do embrião e capture uma imagem de campo brilhante usando o software associado. Mude o microscópio para o filtro mCherry e tire uma imagem florescente do fígado sob luz fluorescente usando o software associado. Repita os dois passos anteriores até capturar todos os embriões do experimento.

Abra o ImageJ e, em seguida, carregue a imagem fluorescente para ser analisada arrastando e soltando a imagem ou clicando em File Open. Clique em Imagem, Cor, Canais Divididos para dividir a imagem feita pelo filtro florescent de acordo com o gráfico de cores RGB. Trabalhe com o espectro de imagem do canal vermelho.

Feche os outros canais. Designe uma área elíptica de tamanho semelhante na imagem, para que sinais completos não interfiram na avaliação. Usando as ferramentas ovais, desenhe uma elipse sobre a área hepática destacada da forma mais precisa possível.

Se o sinal estiver fraco, use imagens microspicais leves, o par de campo brilhante da imagem fluorescente, para determinar a localização do fígado. Clique em Analisar, Medir, para determinar a força do sinal e o tamanho da área efetivada. O valor de densidade integrada é calculado automaticamente pela coluna de software no gráfico.

Continue a análise repetindo as etapas anteriores até analisar todas as imagens de fluorescência de todos os embriões do grupo de tratamento. Salve os dados e, em seguida, analise os valores de densidade integrada. No experimento, embriões sensíveis ao estrogênio da linha de zebrafish biomarcadores foram tratados com concentrações de 0,5 e oito micromoles de alfa e beta-Zearalenol, ou ZOL, para fertilização até os cinco dias de idade.

Investigamos se os sinais florescente aparecem no fígado do peixe no final do experimento devido às substâncias, e se há diferenças na estrogenicidade das duas substâncias. Os resultados foram avaliados com base em imagens fluorescentes e valores de densidade integrada. No caso do alfa-ZOL, na maior concentração de teste, todos os indivíduos morreram.

Então, neste caso, o sinal fluorescente não pôde ser examinado. Em concentrações mais baixas, um forte sinal fluorescente pode ser observado no fígado do embrião. Sem diferença significativa na força do sinal fluorescente e tamanho das áreas iluminadas.

Também não houve diferença significativa entre os valores de densidade integrada e os tratamentos. Não houve mortalidade durante o tratamento com beta-ZOL. A substância induziu a atividade transgênica em todas as concentrações de tratamento.

O aumento da intensidade do sinal fluorescente e o tamanho da área iluminada podem ser observados nas imagens de fluorescência à medida que a concentração aumenta. Examinando os valores integrados do beta-ZOL, essa mudança também pode ser descoberta. O valor médio de densidade integrada quase dobra entre as concentrações de tratamento mais baixas e as mais altas.

No entanto, no caso do beta-ZOL, não encontramos diferença significativa entre os valores de densidade integrada das concentrações individuais. Examinando os valores de densidade integrados obtidos a partir das mesmas concentrações de tratamento das duas substâncias, pode-se dizer que o alfa-ZOL deu maiores médias de densidade integrada em cada caso em relação ao beta-ZOL, o que é consistente com as diferenças entre a força do sinal observada em imagens fluorescentes. Isso se diferenças com concentrações significativas.

O uso de bioindicadores para efeitos de estrogênio vem se espalhando em estudos toxicológicos. Várias linhas transgênicas que mostram efeitos de estrogênio também foram produzidas a partir de zebrafish, dos quais vtg:1mCherry foi usado em nossos estudos. O método descrito aqui ilustra um possível protocolo para o teste de embriões desta linha, a fim de permitir a detecção in vivo da atividade de estrogênio em caso de agentes puros.

É importante mencionar que, no caso dos embriões, a expressão do transgene, similarmente à produção de vitellogenina endógena, mostra uma grande dispersão, e as diferenças na sensibilidade individual devem ser levadas em conta ao projetar experimentos. Um aspecto importante na determinação das concentrações de tratamento é que as células dos embriões, incluindo as células hepáticas, podem ser danificadas por concentrações mais elevadas de substâncias altamente tóxicas, o que pode levar a um declínio na indução de vitellogenina. Portanto, os testes devem ser realizados em concentrações abaixo de L-C 10.

Este protocolo pode ser alterado em muitos pontos de acordo com os pontos finais do teste planejado, e para as amostras que serão testadas. Pode ser completado com outros métodos de teste, por exemplo, métodos moleculares. Assim, esperamos que o uso da linha vtg:1mCherry apareça como um modelo de testes de estrogenicidade e também possa ser um modelo para métodos padronizados de teste.