Name: Recapitulando a transição de amamentação in vitro usando organóides intestinais fetais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-15T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Aprenda a recapitular a transição de amamentação em organóides intestinais fetais de camundongo por 30 dias. Este modelo in vitro permite estudar mecanismos moleculares da maturação intestinal sem uso excessivo de animais.

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Este estudo foi realizado de acordo com as orientações institucionais para o cuidado e o uso de animais de laboratório estabelecidas pelo Comitê de Ética para experimentação animal da Universidade de Amsterdã em total conformidade com a legislação nacional sobre pesquisa animal na sequência da diretiva europeia 2010/63/UE para o uso de animais para fins científicos (ALC312).
1. Isolamento de organóides intestinais pequenos fetais
<ol><li>Sacrifique os fetos E18-E20 por decapitação com tesoura cirúrgica, de acordo com os regulamentos éticos aprovados.</li>
	<li>Imediatamente após a eutanásia, cuidadosamente aberto o abdômen inferior do feto com tesoura intestinal e remover todo o intestino. NOTA: O isolamento deve ser realizado com intestinos entre E18 e E20 de gestação, a fim de alcançar a transição adequada para desmame e maturação in vitro.</li>
	<li>Com duas pequenas fórceps, estique o intestino. Usando o estômago e o apêndice como guias, corte a parte proximal e distal do intestino delgado. NOTA: Se a dissecação é feita com cuidado, é possível isolar o cólon também. Cortá-lo para além usando o apêndice como guia (Figura 1).</li>
	<li>Faça o intestino aberto longitudinalmente: corrigir o intestino usando uma lâmina de barbear colocada longitudinalmente e puxar o intestino deslizando fórceps (um braço dos fórceps em cada lado da lâmina de barbear) ao longo da lâmina de barbear. Posteriormente, corte o intestino aberto em pedaços de 1 cm.</li>
	<li>Prepare dois tubos de 50 mL com 10 mL de soro soro soro vermelho-fosfato gelado (PBS). Transfira a parte proximal e distal do intestino delgado (e do cólon, se aplicável) separadamente para os tubos. Mantenha os tubos no gelo enquanto disseca os intestinos de ratos adicionais. Colete todas as partes intestinais de uma ninhada juntos no mesmo tubo. NOTA: Uma ninhada tem geralmente 6-10 fetos. Os intestinos de todos os fetos devem ser combinados. Esta quantidade deve ser suficiente para produzir 4-8 poços com organóides, em uma placa de 48 poços, por parte intestinal.</li>
	<li>Prossiga com o isolamento organóide como descrito anteriormente11. Em suma, lavar pedaços intestinais com PBS gelada, incubar com 2 mM etilediaminatetraacetic ácido (EDTA) por 30 minutos a 4 °C, dissociar as criptas do tecido por lavar duramente as peças com gelo frio PBS + 10% soro de vitela fetal (FCS), filtro usando um filtro de célula sral de 70 μm e centrífuga para coletar as criptas em 150 x g para 5 min em ° 4 C.</li>
	<li>Placa 4 a 8 poços com criptas em gel de matriz extracelular, dependendo do tamanho da pelota, em uma placa quente de 48 poços. Use 20 μL de criptas suspensas em gel de matriz extracelular por poço. Deixe o gel de matriz extracelular solidificar em uma incubadora de 37 °C por 10 min. NOTA: Considerando que apenas 40% a 50% das criptas isoladas formam organóides, visam uma densidade de 250 a 300 organóides por poço. Primeiro adicione menos gel de matriz extracelular do que o necessário. Olhe o microscópio depois de platting o primeiro poço para analisar se a densidade das criptas isoladas é ideal. Se necessário, adicione mais gel de matriz extracelular.</li>
	<li>Enquanto isso, prepare o meio ENR: 14 mL do Ácido F-12 (DMEM/F12) 1:1 +++ (complementado com ácido 1x 4-(2-hidroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic (HEPES) 1x, L-glutamina 0,01 M e 0.2U/mL Penicilina/Estreptomicina), 4 mL de mídia condicionada à Noggin, 2 mL de mídia condicionada a Rspondin, 400 μL de suplemento B27 1x, 200 μL do suplemento N2 1x, 50 μL de 1,25 mM n-Acetilcysteine, 20 μL de 0,05 μg/mL Epidermal Growth Factor (EGF). NOTA: Ao cultivar organóides do cólon, suplemento com 50% wnt mídia condicionada.</li>
	<li>Adicione 250 μL de ept médio por poço.</li>
</ol>2. Cultivo de organóides fetais
<ol><li>Mude o meio das culturas 3 vezes por semana. A maturação dos organóides é alcançada após 1 mês de cultura.</li>
	<li>No dia 3 após cada passagem, conte o número de esferóides e organóides usando um microscópio óptico. Quantificar pelo menos 3 poços por condição e todos os organóides presentes em cada poço. NOTA: Número de esferóides reduz com o tempo, enquanto o número de organóides aumenta (Figura 2).</li>
	<li>Passagem dos organóides uma vez por semana por dissociação mecânica, como descrito abaixo.<ol>
<li>Retire o meio e adicione 1 mL de frio gelado Advanced DMEM/F12 1:1 +++. Colete todo o gel de matriz extracelular com organóides em um tubo de 15 mL. Use uma ponta de 200 μL em cima de uma ponta de filtro de 1000 μL e pipeta para cima e para baixo 20 vezes para interromper os organóides.</li>
		<li>Centrífuga a 150 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o supernatant e resuspenda a pelota em 20 μL de gel de matriz extracelular por poço. Normalmente, organóides fetais podem ser expandidos em uma proporção de 1:2.</li>
		<li>Deixe o gel de matriz extracelular solidificar para 5-10 min. Adicione 250 μL de médio de ER por poço.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Análise de maturação no nível de RNA e proteína
<ol><li>Analise a cultura a cada 3 dias após cada passagem, por um período de 1 mês (ou seja, tempo em que a maturação completa é alcançada) (Figura 3). NOTA: A cultura organóide fetal é dinâmica (Filme 1) e para evitar a variação da regeneração normal dos organóides após a interrupção mecânica, é necessário coletar sempre amostras no mesmo dia após a passagem.</li>
	<li>
Isolamento do RNA
	<ol>
<li>Coletar 3 poços de organóides usando 200 μL de rna lise tampão para cada poço complementado com 2 μL de β-mercaptoetanol. Depois de adicionar rna lise buffer+β-mercaptoethanol ao poço, certifique-se de que todos os gel de matriz extracelular com organóides sejam transferidos para um tubo de 1,5 mL livre de RNase.</li>
		<li>Vortex vigorosamente e manter a -80 °C por não mais de 1 mês. Isolar o RNA usando kits de coluna de sílica de sílica disponíveis comercialmente.</li>
		<li>Para aumentar a qualidade do RNA, depois de lavar etapas adicionar 500 μL de 80% EtOH e misture suavemente invertendo a coluna. Centrífuga por 2 min a 11.000 x g para secar a coluna completamente. NOTA: Certifique-se de lavar o interior da tampa do tubo com o EtOH 80% sacudindo o tubo de cabeça para baixo três a cinco vezes para se livrar de todos os vestígios de tiocianato guanidinana.</li>
		<li>Para aumentar o rendimento de RNA, espere 1-2 min depois de aplicar água livre de RNase antes da centrífuga. RNA re-elute aplicando o primeiro eluate flow-through à coluna uma segunda vez. NOTA: A qualidade isolada do RNA é suficiente para uso na análise de expressão em todo o genoma. Verifique se o número de integridade do RNA está acima de 8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolamento de proteínas
	<ol>
<li>Colete 5 poços de organóides usando 250 μL de solução de recuperação de células geladas em um tubo de 15 mL. Incubar por pelo menos 30 min no gelo para dissolver o gel de matriz extracelular (isso reduzirá a contribuição proteica do gel de matriz extracelular).</li>
		<li>Lave com PBS gelada. Adicione 250 μL de buffer de lyse celular e guarde a -80 °C. NOTA: Após a sonorização, as amostras podem ser usadas para detectar a atividade enzimática ou para manchas ocidentais.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Imunomanchas
	<ol>
<li>Colete 2 poços de organóides usando 250 μL de solução de recuperação de células geladas em um tubo de 15 mL. Incubar por pelo menos 30 min no gelo para dissolver o gel matriz extracelular (isso irá reduzir o fundo de coloração). Lave com PBS gelada.</li>
		<li>Corrija os organóides usando 500 μL de 4% de paraformaldegyde (PFA) para 1 h a 4 °C. Lave com PBS gelada. Proceda à imunofluorescência de órgãos inteiros ou à incorporação de parafina, de acordo com os protocolos publicados12. NOTA: Use uma pipeta pasteur de plástico para lidar com os organóides. Isso evitará a interrupção de sua estrutura.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Efeito do fator extrínseco (dexametasona como exemplo) no processo de maturação organóide
<ol><li>No primeiro dia de cultura, adicione 0,01 M dexametasona aos organóides. Incubar os organóides com dexametasona durante todo o mês de cultura, adicionando nova dexametasona cada vez que o meio é alterado.</li>
	<li>Análise da expressão gênica
	<ol>
<li>Isolar o RNA como descrito acima. Sintetizar, ao mesmo tempo, cDNA de todas as amostras a serem comparadas (tratadas e não tratadas). Prossiga com o método qRTPCR preferido.</li>
		<li>Use GeNorm para identificar o dois gene de referência mais estável cada vez que um novo tratamento é usado nos organóides fetais. Use a média geométrica dos dois genes de referência escolhidos para cálculos de expressão relativa. NOTA: Sugestões de genes de referência para testar organóides fetais do rato: Cyclophilin, Gapdh, βactin, 36b4, Hprt, Rpl4, Rpl32, Ppib e Tbp.</li>
		<li>Para investigar como um determinado fator extrínseco afeta a maturação fetal pós-natal do rato, todos os seguintes genes devem ser avaliados.<ol>
<li>Verifique se os marcadores fetais lactase (Lct), synthase argininosucciato 1 (Ass1), Proteína de maturação induzida por linfócito B 1 (Dirigível-1) e receptor de Fc neonatal (FcRn) diminuem na expressão durante as duas primeiras semanas de cultura e estão ausentes para o tempo de cultura restante (Figura 4C). Analise se esse padrão é alterado.</li>
			<li>Verifique se os marcadores adultos sucrase-isomaltase (Sis), arginase 2 (Arg2), trehalase (Treh) e lysozyme (Lyz) aumentam de expressão após duas semanas de cultura (Figura 4D). Analise se esse padrão é alterado pelo fator externo. NOTA: A dexametasona é um fator externo que pode acelerar a maturação dos organóides fetais e pode ser usado como um controle positivo em todos os experimentos destinados a testar outros fatores extrínsecos.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Análise da atividade enzimática
	<ol>
<li>Isolar a proteína, conforme descrito acima. Detectar a atividade de disacarídas intestinais de acordo com protocolos publicados pela Dahlqvist e Messer13,14.</li>
		<li>Prepare 0,625 M de pH-buffer masculino 6.0 (manter por 3 meses a 4 °C). Usando este amortecedor, prepare a lactose de 0,05 M (adicione o sódio p-hidroximercuribenzoato como estabilizador para inibir a atividade da p-galactosidase lisossômica); 0,05 M maltose; 0,05 M de sacarose e 0,05 M trehalose. NOTA: Todas essas soluções podem ser mantidas por 5 dias a 4 °C. Mantenha-se no gelo enquanto prepara ensaio.</li>
		<li>Prepare os padrões de ensaio diluindo a solução de glicose de 5,56 M com água ultrapura para obter soluções com as seguintes concentrações: 0,125 M; 0,1 m; 0,075 M; 0,05 M e 0,025 M. NOTA: solução estável por pelo menos 3 meses a 4 °C.</li>
		<li>Incubar em uma placa de 96 poços para 60 min a 37 °C: - 30 μL de lysate organóide com 30μL de lactose - 30 μL de lysate organóide com 30μL de sacarose - 30 μL de dez vezes lysate organóide diluído com 30 μL de maltose - 30 μL de cinco vezes lysate organóide diluído com 30 μL de trehalase - 30 μL de lysate organóide não diluído com 30 μL de ácido maleíco, como fundo da amostra - 30 μL de cada padrão de glicose - 30 μL de água ultrapura, em branco - 30 μL de controle positivo (otimizar a diluição; o tecido intestinal fetal lysed pode ser usado como controle para a atividade da lactase, enquanto o tecido intestinal adulto lysed pode ser usado como controle para sucrase, maltase e trehalase) NOTA: Diluição de amostras deve ser feita com tampão de lyse celular. Mantenha as amostras e a placa no gelo ao preparar o ensaio.</li>
		<li>Para determinar a quantidade de glicose produzida pelas enzimas presentes no lisato organóide após a incubação com seus respectivos substratos, adicione rapidamente 200 μL de solução de cor PGO e medir a absorção em 450 nm cada 5 min para 30 min em 37 °C. NOTA: Faça a solução pgo-color fresco. Use 10 U/mL glicose-oxidase, 2 U/mL peroxidase e 7,88 mmol/L o-dianisidina em 0.5mol/L Tris-HCl buffer no pH 7.0. A solução deve estar à temperatura ambiente quando adicionada à placa.</li>
		<li>Calcule a atividade de acordo com o padrão de glicose e correto para a quantidade total de proteína (determinada pelo ensaio de ácido bicinchoninic (BCA)). A atividade enzimática deve ser expressa como μM glicose/μg proteína·min-1 (Figura 5B). NOTA: Medir a atividade de arginase usando um kit de ensaio de atividade de arginase comercialmente disponível.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Henning, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+development%3A+coordination+of+feeding%2C+digestion%2C+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Postnatal development: coordination of feeding, digestion, and metabolism.</a> American Journal of Physiology. 241 (3), 199-214 (1981).</li>
<li>Krasinski, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+intestinal+hydrolase+biosynthesis+during+postnatal+development+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of intestinal hydrolase biosynthesis during postnatal development in rats.</a> American Journal of Physiology. 267 (4), 584-594 (1994).</li>
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<li>Navis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+fetal+intestinal+organoids%3A+new+model+to+study+epithelial+maturation+from+suckling+to+weaning%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Mouse fetal intestinal organoids: new model to study epithelial maturation from suckling to weaning.</a> EMBO Reports. 20 (2), (2019).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
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<li>Holscher, H. D., Bode, L., Tappenden, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Milk+Oligosaccharides+Influence+Intestinal+Epithelial+Cell+Maturation+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Gastroenterology+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Human Milk Oligosaccharides Influence Intestinal Epithelial Cell Maturation In Vitro.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 296-301 (2017).</li>
<li>Solomon, N. S., Gartner, H., Oesterreicher, T. J., Henning, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+glucocorticoid-responsiveness+in+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Development of glucocorticoid-responsiveness in mouse intestine.</a> Pediatric Research. 49 (6), 782-788 (2001).</li>
<li>Kedinger, M., Simon, P. M., Raul, F., Grenier, J. F., Haffen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+dexamethasone+on+the+development+of+rat+intestinal+brush+border+enzymes+in+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The effect of dexamethasone on the development of rat intestinal brush border enzymes in organ culture.</a> Developmental Biology. 74 (1), 9-21 (1980).</li>
</ol>

="jove_content">This project was financially supported by Danone Nutricia Reserarch. I.B.R. and R.M.v.E are employees of Danone Nutricia Research.--><html><body>Os autores declaram nada a divulgar.

Este protocolo descreve o cultivo de organóides intestinais fetais tardios por tempo prolongado para imitar a transição de sucção para desmame in vitro. O processo de maturação equivale ao ritmo in vivo e é concluído após um mês na cultura. A análise a jusante desta cultura usando técnicas quantitativas de RNA e proteínas são detalhadas.
Neste protocolo, são utilizadas células intestinais primárias dos embriões de camundongos E18-E20. O estágio de desenvolvimento das células-camundongos primárias usadas para gerar organóides para este protocolo é particularmente importante. O uso de estágio smofpiantes mais precoces resultará na geração de esferóides intestinais que mantêm sua expressão específica do gene fetal durante um período prolongado de tempo com transição limitada para organóides adultos15,16. Somente os esféios do estágio fetal atrasado são capazes em transitar aos organoids adultos in vitro10. Para maximizar a janela de oportunidade no que diz respeito ao impacto de fatores extrínsecos na maturação do intestino, intestinos do estágio fetal tardio são recomendados e não intestinos de filhotes nascidos que foram expostos a micróbios e leite materno. Relata-se que certos metabólitos bacterianos e componentes do leite podem atuar como modificadores do processo de maturação17.
Para obter quantidades suficientes de células para manter a cultura por um mês para estudar toda a maturação desde o nascimento até a idade adulta, ao coletar as amostras para análises a jusante, intestinos de 6-8 embriões devem ser usados como material de partida. É preferível usar embriões do mesmo estágio de desenvolvimento para gerar a cultura. Não recomendamos agrupar diferentes ninhadas, pois pequenas diferenças no estágio de desenvolvimento podem influenciar a expressão dos genes de maturação.
O protocolo descrito aqui é responsável pela geração organóide do intestino delgado proximal e distal para manter características de desenvolvimento de diferentes segmentos do intestino. Como alternativa, o intestino inteiro pode ser usado para investigar a maturação geral em relação à expressão de aumento/diminuição dos marcadores específicos. Neste último caso, menos embriões poderiam ser usados para isolar as células intestinais para iniciar a cultura.
Este protocolo é desenvolvido usando culturas organóides tridimensionais. Como os organóides passam por um crescimento dinâmico na cultura, é importante coletar amostras para análises a jusante ao mesmo tempo após a passagem. Neste protocolo, selecionamos dia 3 após passagem, pois representa o tempo médio entre duas divisões em que organóides contêm botões robustos e pouca ou nenhuma morte celular. Um ponto de tempo alternativo após a passagem pode ser usado, mas deve ser consistente durante todo o experimento. Não recomendamos o cultivo de organóides por mais de 7 dias após uma passagem, pois o aumento das células da morte no lumen organóide pode afetar os resultados.
Em nossos experimentos, usamos a dexametasona como exemplo de um fator extrínseco que é mostrado e melhor estudado na literatura para acelerar a maturação intestinal in vivo9,18. A dexametasona exerce seus efeitos através de rotas genômicas e não genômicas. Por exemplo, no nível da regulação genômica, um aumento precoce dos níveis de Sis mRNA pode ser observado. Em um nível não genômico, observamos alterações na atividade de enzimas digestivas como a trehalase. Ambos estão de acordo com aspectos específicos descritos da dexametasona sobre a ativação do gene sucrase e efeito ativador não genômico sobre as enzimas de beira da escova intestinal observadas in vivo19. O fato de que fatores extrínsecos, como glicocorticoides sintéticos, podem modular certos aspectos da transição de sucção para desmame na cultura organóide, semelhante ao descrito in vivo, estabelece ainda mais os organóides intestinais do rato como um modelo para a investigação de diferentes tipos de moduladores da maturação intestinal.
Mesmo que a maturação morfológica do epitélio intestinal humano seja concluída no útero em estágio gestacional de 22 semanas, a função de barreira intestinal amadurece até a infância em uma estreita relação com o tipo de alimentação, desenvolvimento de microbiota e resposta imune. Devido à disponibilidade limitada de tecidos humanos nessas fases de desenvolvimento, o valor translacional do modelo de urina in vitro reside na possibilidade de telas de alta produtividade de fatores capazes de modular a maturação intestinal, um processo conservado mamíferos amamentando.
É importante ressaltar que, no que diz respeito à ética animal na pesquisa, esse modelo pode contribuir para o refinamento das experiências com animais, pois não inclui intervenções realizadas em animais. O número de animais pode ser ainda mais reduzido, reprojetando questões de pesquisa para um ou dois pontos de cultura que permitirão o teste de vários componentes dentro de uma cultura.

Em muitas espécies de mamíferos, incluindo camundongos e homens, o intestino neonatal tem várias características que são distintas do epitélio intestinal totalmente maduro. Essas características facilitam enterócitos neonatais para digerir e absorver leite, que contém alto teor de gordura e carboidratos baixos, com lactose como o principal carboidrato. A borda da escova das células epiteliainas intestinais neonatais neonatais neonatais expressam a disacarharidase lactase-phlorizin hydrolase (Lct)1 para digerir a lactose de disacarídea leite. Após o período de amamentação, os enterócitos adaptam-se para digerir alimentos sólidos ricos em carboidratos complexos e com pouca gordura. Isto é manifestado por um interruptor na expressão disaccharidase da beira da escova do lactase ao sucrase-isomaltase (Sis) e trehalase (Treh), que pode digerir uns hidratos de carbono mais complexos atuais no alimento contínuo2. Outro interruptor metabólico está relacionado à baixa concentração de arginina no leite. Para prover a necessidade de arginina, enterócitos neonatais expressam a enzima limitante da taxa na biossíntese argininina, synthase argininosucciana-1 (Ass1), para sintetizar arginina3. Em contraste, enterócitos adultos expressam arginase 2 (Arg2), uma enzima capaz de catabolizantes argininas que é abundante em alimentos sólidos. Além disso, o epitélio intestinal neonatal expressa o receptor neonatal fc para imunoglobulinas (FcRn), que media a absorção do IgG materno do leite para a circulação/corrente sanguínea4. A expressão de FcRn declina significativamente durante a transição suckling-to-weaning5. Em camundongos, a maturação das células Paneth ocorre pós-natal, coincidentemente com a formação e maturação de criptas, e é caracterizada pela expressão de peptídeos antimicrobianos lisosome (Lyz) e defensins6.
Todas essas mudanças fazem parte da transição de sucção para desmame, um processo que ocorre gradualmente após o nascimento de um mês de idade em camundongos, quando o epitélio intestinal atinge seu estado adulto maduro. A transição de sucção para desmame é intrinsecamente regulada e desenvolvente situada no tubo intestinal. A proteína de maturação induzida pelo linfocito infócito -1 (Dirigível-1) desempenha um papel fundamental neste processo de maturação intrínseca7. O dirigível-1 é altamente expresso no epitélio neonatal, enquanto sua expressão diminui e é perdida durante a transição de sucção para desmame e, portanto, pode servir como um marcador confiável de epitélio intestinal neonatal. Apesar de ser um processo intrínseco, a transição de sucção para desmame pode ser modulada por fatores externos. Por exemplo, o análogo sintético de cortisol, dexametasona, é conhecido por acelerar a maturação intestinal in vivo8,9.
Modelos in vitro atuais usados para estudar a maturação epitelial intestinal, incluindo a transição de sucção para desmame, utilizam linhas de células epiteliais adultas e/ou organóides adultos que têm características do epitélio intestinal adulto. Recentemente, demonstramos que as células epiteliais intestinais primárias isoladas do intestino fetal tardio amadurecem e recapitulam a transição de amamentação ao crescer in vitro como organóides10. Mostramos ainda que esse processo de maturação intestinal in vitro ocorre no mesmo ritmo que in vivo. Finalmente, usamos dexametasona para acelerar o processo de maturação da mesma forma descrito para estudos in vivo.
Aqui, nós esboçamos um protocolo preciso para a isolação e a cultura de organoids intestinais fetal atrasados do rato. Descrevemos a maneira preferida de coletar amostras para a cultura organóide prolongada e métodos para monitorar a transição de sucção para desmame in vitro. Este protocolo pode ser utilizado para estudos in vitro de maturação epiteliais intestinais e moduladores deste processo e resulta em maior rendimento, maior qualidade e valor translacional dos dados e redução do uso animal.

<table><tbody>Kit avançado de ensaio de atividade <tr>de arginase <td>DMEM / F12 1: 1</td><td>Invitrogen</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK112-1KT</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td></td> Kit de ensaio de proteína BCA <td>100x</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher</td><td>10741395</td><td></td></tr><tr><td>tampão de lise celular</td> Tecnologia <td>de sinalização celular</td><td>9803S</td><td></td></tr><tr><td> Solução de recuperação</td><td>Corning B.V.</td><td></td><td></td>354253</tr><tr><td>Filtro de células 70&micro; M</td><td>BD/VWR</td><td>734-0003</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>10,84,18,250</td><td>EDTA Titriplex III</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8045</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>1,00,98,31,000</td><td></td></tr><tr><td>Solução de glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6918</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050-038</td><td>100x</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td>1M</td></tr><tr><td>Isolado II RNA Mini Kit</td><td>Bioline</td><td>BIO-52073</td><td></td></tr><tr><td>Lactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3625</td><td>a-Lactose monohidratada</td></tr><tr><td>Tampão maleico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0375</td><td>Ácido maleico</td></tr><tr><td>Maltose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5885</td><td>D-(+)-Maltose monohidrato >99%</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning B.V.</td><td>356231</td><td>Fator de Crescimento Reduzido Matriz da Membrana Basal</td></tr><tr><td>Água Millipore</td><td>N.A.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suplemento N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>100x</td></tr><tr><td>n-Acetilcisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Meio condicionado com Noggin</td><td></td> O-dianisidina caseira <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>191248</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Penicilina</td>/estreptomicina caseira <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>0,2 U/mL</td></tr> de <tr><td>preparação enzimática PGO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-7119-10CAP</td><td>cápsulas com Peroxidase/Glicose Oxidase</td></tr><tr><td>p-hidroximercuribenzoato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>55540</td><td></td></tr><tr><td>Meio condicionado com rspondina</td><td>Sacarose caseira</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Trealose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5251</td><td>D-Trealose di-hidratado</td></tr><tr><td>Tris-HCl Buffer</td><td>caseiro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

recapitulando a transição de amamentação in vitro usando organóides intestinais fetais

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

No final do período de amamentação, muitas espécies de mamíferos sofrem grandes mudanças no epitélio intestinal que estão associadas à capacidade de digerir alimentos sólidos. Este processo é denominado transição de amamentação para desmame e resulta na substituição do epitélio neonatal pelo epitélio adulto que anda de mãos dadas com ajustes metabólicos e morfológicos. Essas complexas mudanças no desenvolvimento são o resultado de um programa genético intrínseco às células epiteliais intestinais, mas pode, em certa medida, ser modulada por fatores extrínsecos. Cultura prolongada de células epiteliais intestinais primárias do rato do período fetal tardio, recapitula a transição de amamentação in vitro. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a cultura fetal do organóide intestinal do rato serida melhor para modelar este processo in vitro. Descrevemos vários ensaios úteis projetados para monitorar a mudança de funções intestinais associadas à transição de sucção para desmame ao longo do tempo. Além disso, incluímos um exemplo de um fator extrínseco que é capaz de afetar a transição de sucção para desmame in vivo, como uma representação de modular o momento da transição de sucção para desmame in vitro. Esta abordagem in vitro pode ser usada para estudar mecanismos moleculares da transição de sucção para desmame, bem como moduladores deste processo. É importante ressaltar que, no que diz respeito à ética animal na pesquisa, a substituição dos modelos in vivo por esse modelo in vitro contribui para o refinamento das experiências com animais e, possivelmente, para uma redução no uso de animais para estudar processos de maturação intestinal.

Cultura prolongada de células epiteliais intestinais fetais O protocolo para imitar a transição de sucção para desmame in vitro depende do manuseio correto de organóides fetais durante a cultura prolongada. Intestino proximal e distal isolado de fetos de camundongos E18-E20 são separados conforme apresentado em (Figura 1). Após o isolamento, as células epiteliais são semeadas em cúpulas de gel de matriz extracelular (Figura 2). Toma tipicamente quatro passagens e aproximadamente 28-30 dias da cultura para que os organoids fetal amadureçam ao estado adulto. Durante este tempo, células em vários estágios de maturação podem ser coletadas(Figura 3).
Análise representativa a jusante da transição de sucção para desmame in vitro Para confirmar que organóides fetais isolados são distintamente proximais ou distais, compare o nível de expressão de marcadores proximais Um membro da família de domínio de corte 2 (Onecut2) e proteína de ligação GATA 4 (Gata4) e marcadores distais Proteína de ligação ácido gordo 6 (Fabp6) e Guanylate Cyclase Activator 2A (Guca2a) entre as culturas de organóides proximal e distal (Figura 4A,B). A transição de sucção para desmame in vitro pode ser monitorada por dois conjuntos de genes: fetal (Figura 4C)e marcadores adultos (Figura 4D). Os marcadores fetais devem diminuir gradualmente ao longo da cultura, enquanto a expressão de marcadores adultos deve aumentar gradualmente(Figura 4C,D).
Usando o fator extrínseco como um modificador de sucção-à-desmame transição in vitro Neste protocolo a dexametasona um glicocorticoide sintético, foi usado como um exemplo do fator extrínseco capaz de modificar a transição suckling-to-weaning in vitro. Dados representativos na Figura 5 sugerem que os efeitos dos fatores extrínsecos são os melhores a serem determinados por vários ensaios, uma vez que não necessariamente devem ser genômicos. Por exemplo, no caso da expressão sucrase-isomaltase tanto de RNA quanto de proteína são induzidas com dexametasona(Figura 5A),enquanto a expressão de trehalase só é alterada no nível da proteína. (Figura 5B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60470/60470fig01.jpg"> Figura 1: Isolamento do intestino delgado fetal do rato. (A)Fotografia do intestino fetal dissecado e esticado, incluindo estômago, intestino delgado proximal e distal, apêndice e cólon. A linha preta indica onde o intestino deve ser cortado para dividir o intestino delgado proximal e distal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60470/60470fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60470/60470fig02.jpg"> Figura 2: Imagens microscópicas representativas da cultura organóide fetal proximal e distal no dia 3, dia 17 e dia 28 da cultura. Todas as imagens foram obtidas no dia 3 após a passagem e mostram a diminuição do número de esferóides extras. Barra de escala: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60470/60470fig02large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
Filme 1: Vídeo representativo mostrando a dinâmica da cultura organóide fetal, do dia 4 ao 6 º da cultura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60470/culture_dynamics.avi" target="_blank">Clique aqui para ver este vídeo. (Clique direito para download.)</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60470/60470fig03.jpg"> Figura 3: Representação esquemática da coleta de organóides para análise da maturação intestinal ao longo do tempo. As culturas fetais proximais e distais do organóide devem ser cultivadas por um mês e passadas cada semana. As amostras para análise <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60470/60470fig03large.jpg" target="_blank">de</a> maturação devem ser coletadas 3 dias após o isolamento e a cada 3 dias após cadapassagem.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60470/60470fig04.jpg"> Figura 4: QRTPCRs representativos de marcadores de maturação intestinal em organóides fetais proximais e distais. (A) Os marcadores proximal Onecut2 e Gata4 são expressos principalmente na cultura organóide proximal, enquanto (B) marcadores distais Fabp6 e Guca2a são expressos principalmente na cultura organóide distal. (C) Marcadores fetais Lct, Ass1, Dirigível-1 e FcRn diminuem e (D)marcadores adultos Sis, Arg2, Treh e Lyz aumentam ao longo do tempo em culturas organóides proximais e distais. Barras de erro representam SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60470/60470fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60470/60470fig05.jpg"> Figura 5: A dexametasona do fator externo pode modular a maturação dos organóides fetais. (A)A expressão gênica do marcador fetal Blimp-1 é diminuída no dia 12 de cultura em organóides tratados com dexametasona em comparação com organóides de controle, enquanto tanto a expressão gênica (B) quanto a atividade enzimática (C) do marcador adulto sucrase-isomaltase (Sis) é aumentada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60470/60470fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>

Este protocolo descreve como imitar a transição de amamentação in vitro usando organóides intestinais fetais tardios do rato cultivados por 30 dias.

Recapitulando a transição de amamentação in vitro usando organóides intestinais fetais

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...

Este protocolo descreve uma cultura de células intestinais fetais do camundongo que é a mais adequada para alcançar a maturação para o estágio adulto in vitro. Esta abordagem in vitro pode ser usada para estudar mecanismos moleculares de transição de amamentação para desmamar, bem como os moduladores desse processo e para obter um uso mais eficiente de animais experimentais. É essencial que este modelo in vitro de maturação intestinal use células intestinais primárias a partir do estágio de desenvolvimento tardio, entre os dias 18 e 20 embrionários.Com dois fórceps pequenos, estique o intestino. Usando o estômago e o apêndice como guias, corte as partes proximais e distais do intestino delgado. Usando o apêndice como guia, corte o cólon.Para fazer o intestino abrir longitudinalmente, coloque uma lâmina de barbear longitudinalmente ao longo do intestino e puxe o intestino deslizando fórceps ao longo da lâmina de barbear. Posteriormente, corte o intestino aberto em pedaços de um centímetro. Prepare três tubos de 50 mililitros com dez mililitros de PBS gelado.Transfira as partes proximais e distais do intestino delgado e do cólon separadamente para os tubos. Mantenha os tubos no gelo enquanto disseca os intestinos de ratos adicionais. Junte todas as partes intestinais de uma ninhada no mesmo tubo.Depois de lavar as peças intestinais com PBS gelado, incubar com dois milimães EDTA por 30 minutos. Para dissociar as criptas do tecido, lave parcialmente as peças com PBS gelado e 10% de soro de bezerro e filtre através de um coador de células de 70 mícrons em um novo tubo. Repita a lavagem do tecido duas vezes adicionais e combine a solução filtrada.Centrifugar a solução filtrada contendo as criptas a 150 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius para coletar as criptas como uma pelota. Transfira as criptas para um tubo de 15 mililitros e centrífuga novamente. Para aplacar poços, adicione a quantidade total de gel de matriz extracelular necessário no tubo e dissolva a pelota.Adicione 20 microliters das criptas dissolvidas em cada poço de uma placa quente de 48 poços. Depois de emplacar o primeiro poço, procure sob o microscópio para confirmar a densidade de cerca de 250 a 300 criptas por poço. Coloque a placa em uma incubadora Celsius de 37 graus por dez minutos para deixar o gel de matriz extracelular solidificar.Em seguida, prepare o meio ENR. Adicione 250 microliters do meio ENR em cada poço no gel. Troque o meio três vezes por semana e passagem os organoides uma vez por semana.Durante um mês, a cada três dias após cada passagem, analise a cultura. Três dias após cada passagem, isole o RNA de um poço adicionando 200 microliters de tampão de rna lysis complementados com dois microliters de beta mercaptoetanol ao poço. Em seguida, transfira a amostra do poço para um tubo de 1,5 mililitro sem RNAse.Em nossos experimentos in vitro, usamos a dexamethosona como exemplo de um fator externo que é conhecido por acelerar a maturação intestinal in vivo. Para isolar a proteína, adicione 250 microliters de solução de recuperação de células geladas por poço a cinco poços de organoides e colete todos eles em um tubo de 15 mililitros. Incubar por pelo menos 30 minutos no gelo para dissolver o gel de matriz extracelular.Lave com PBS gelado, adicione 250 microliters de tampão de lise celular e armazene a menos 80 graus Celsius. Para analisar a atividade enzimática, prepare primeiro o tampão 0,625 molar maleic em pH seis e 0,05 molares soluções de lactose, sacarose, maltose e trehalase e armazene-as no gelo. Prepare os padrões de ensaio diluindo a solução de glicose molar 5,56 com água ultra-pura para obter soluções com 5 concentrações diferentes.Em seguida, em uma placa de 96 poços, adicione oito grupos diferentes de lise organoide com seus respectivos substratos, incluindo padrões e controle de acordo com o manuscrito. Incubar por 60 minutos a 37 graus Celsius. Para determinar a quantidade de glicose produzida pelas enzimas presentes no lisato organoide, adicione rapidamente 200 microliters de solução de cor PGO recém-preparada e meça absorvância no espectógrafo a 450 nanômetros a cada cinco minutos por trinta minutos a 37 graus Celsius.Neste protocolo, o intestino proximal e distal foram isolados dos fetos do camundongo E18 a E20. Após o isolamento, as células epiteliais foram semeadas em cúpulas de gel de matriz extracelular. Após aproximadamente 28 a 30 dias de cultura, organoides fetais foram desenvolvidos para o estado adulto maduro.Os marcadores proximais Onecut2 e Gata4 foram expressos principalmente na cultura organoide proximal, enquanto os marcadores distais Fabp6 e Guca2a foram expressos principalmente na cultura organoide distal. Os marcadores fetais lactase, Ass1, Blimp-1 e receptor neonatal Fc diminuíram em sua expressão relativa e marcadores adultos sucrase isomaltase, argenase 2, trehalase e lysozyme aumentaram ao longo do tempo em culturas organoides proximais e distais. Os efeitos dos fatores extrínsecos não devem necessariamente ser genômicos.A expressão genética do marcador fetal Blimp-1 foi diminuída no dia 12 para os organoides tratados com dexametasona em comparação com os organoides de controle. No entanto, tanto a expressão genética quanto a atividade enzimática dos marcadores adultos sucrase isomaltase foram aumentadas. Ao utilizar este protocolo, é importante perceber que apenas organoides de estágio fetal tardio são capazes de transitar para organoides adultos in vitro.O número de seis a dez fetos como ponto de partida dessa cultura pode ser ainda mais reduzido usando todo o intestino para estudar o amadurecimento geral. O valor translacional deste modelo reside na possibilidade de que os efeitos extremos de grupo elevado sejam capazes de modular a maturação intestinal, que é um processo conservado entre mamíferos sugadores.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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