Name: Capturando a resposta de lesão cardíaca de populações de células-alvo através de imagens tridimensionais do coração limpo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Aprenda a rastrear populações celulares em regeneração cardíaca usando microscopia confocal 3D e técnica CLARITY. Este método permite visualizar dinâmicas celulares em corações transparentes após lesão.

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O financiamento para este projeto foi fornecido pela UW School of Medicine and Public Health do Wisconsin Partnership Program (A.I.M.), e um American Heart Association Career Development Award 19CDA34660169 (A.I.M.).

Todos os experimentos foram realizados de acordo com o Guia de Uso e Cuidado de Animais de Laboratório e em conformidade com o Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais na Faculdade de Medicina e Saúde Pública da Universidade de Wisconsin-Madison. Todos os métodos foram realizados em linhas de camundongos do tipo selvagem C57BL/6J (B6) e transgênicas obtidas nos Laboratórios Jackson.
1. Oclusão da Artéria Coronária (Infarto do Miocárdio) Induzida via Ligadura da Artéria Descendente Anterior Esquerda (LAD) em Camundongos Neonatais de 1 dia de idade6
<ol><li>Separe os filhotes neonatais de 1 dia de idade da mãe, colocando-os em uma gaiola limpa junto com parte do material original de ninho.</li>
	<li>Coloque metade da gaiola em uma almofada de aquecimento definida para fogo médio. Os filhotes devem permanecer no lado não aquecido da gaiola, sendo colocados apenas no lado aquecido após a cirurgia.</li>
	<li>Crie uma área cirúrgica estéril um microscópio operacional. Recolher equipamento cirúrgico esterilizado(Tabela 1).</li>
	<li>Anestesiar o filhote via hipotermia: enrole o filhote em gaze para evitar o contato direto da pele com gelo e enterre-o em um leito de gelo por aproximadamente 3-4 min. Verifique a hipotermia dos ratos periodicamente realizando uma pitada de dedo do dedo. Os recém-nascidos toleram bem a hipotermia, no entanto, a exposição prolongada à hipotermia pode resultar em queimaduras de gelo e mortalidade subsequente.</li>
	<li>Uma vez anestesiado, coloque o rato sobre a área cirúrgica na posição supina, prendendo os braços e pernas com fita adesiva. Esterilizar a área cirúrgica do camundongo com uma solução antisséptica.</li>
	<li>Localize a região inferior do tórax e faça uma incisão transversa na pele com uma pequena tesoura dissecante. Para ampliar a visão cirúrgica das costelas, separe a pele do músculo levantando a pele suavemente com um par de pinças de curativo e pressione suavemente contra os músculos intercostais com a pequena tesoura na posição fechada.</li>
	<li>Localize o quarto espaço intercostal (Figura 1A) e faça uma punção pequena e superficial usando fórceps afiados, tomando cuidado para não perfurar nenhum órgão interno. Realize uma dissecção contundente ampliando a área entre os músculos intercostais com pinças de curativo. O posicionamento anatômico adequado da incisão é essencial para o acesso adequado ao coração.</li>
	<li>Guie suavemente o coração para fora da cavidade torácica colocando um dedo e aplicando pressão crescente no lado esquerdo do abdômen enquanto segura o espaço intercostal aberto com pinças de curativo(Figura 1B). Uma vez que o coração esteja fora do peito, remova os fórceps do curativo, alivie a pressão e deixe o coração descansar sobre os músculos intercostais.</li>
	<li>Localize o LAD como a área do coração que tem menos sangue acumulado e está na posição anatômica correta(Figura 1C). O LAD só pode ser visto o microscópio se o coração for acessado dentro de alguns minutos após o início da cirurgia.</li>
	<li>Realizar a ligadura LAD suturando o LAD com uma sutura de 6-0(Figura 1D). Amarre um nó quadrado duas vezes para induzir o infarto do miocárdio(Figura 1E). A profundidade da sutura no miocárdio pode variar, no entanto, o posicionamento anatômico adequado da ligadura LAD é crucial para a reprodutibilidade. Ao ligar o LAD, a sutura deve ser puxada com firme, mas com cuidado para não cortar o LAD. A branqueamento no ápice do coração será vista imediatamente (Figura 1E)</li>
	<li>Deixe o coração escorregar de volta para a cavidade torácica; este processo pode ser suavemente facilitado com pinças de vestir. Suturar as costelas juntamente com o nó de um cirurgião seguido de um nó quadrado, usando fórceps contundentes para levantar o conjunto superior de costelas enquanto passa uma sutura 6-0 através do conjunto superior e inferior de costelas.</li>
	<li>Remova a fita que foi usada para fixar as patas traseiras do filhote.</li>
	<li>Adere a pele junto colocando uma pequena quantidade de cola de pele no abdômen superior. Em seguida, pegue a pele do abdômen inferior com fórceps finos e cubra a região do peito exposta. Limitar a quantidade de cola em excesso que permanece sobre os filhotes, pois isso pode aumentar a probabilidade de rejeição e canibalismo por parte da mãe.</li>
	<li>Facilite imediatamente a recuperação da anestesia colocando o filhote em uma almofada de aquecimento definida para fogo médio. Mude periodicamente a colocação dos recém-nascidos para aquecer uniformemente todas as partes do corpo.</li>
	<li>Deixe o recém-nascido permanecer diretamente na almofada de aquecimento por 10-15 min. Normalmente, o movimento é recuperado dentro de 5 minutos de ser colocado no calor.</li>
	<li>Limpe o sangue residual e cole com uma limpeza de álcool.</li>
	<li>Cubra perfumes estranhos em recém-nascidos esfregando todo o corpo com roupa de cama da gaiola original. Coloque o filhote na gaiola do lado aquecido enquanto outras cirurgias estão sendo realizadas.</li>
	<li>Uma vez que todas as cirurgias são concluídas e os filhotes são quentes e móveis, transfira a ninhada junto com o material original de aninhamento para a gaiola da mãe.</li>
	<li>Monitore os camundongos por 30-60 min após a cirurgia e observe a aceitação da mãe dos filhotes fazendo ninho e/ou preparo.</li>
	<li>Verifique os ratos na manhã seguinte à cirurgia. Se a mãe está angustiada e não aninha os filhotes, considere uma mãe adotiva para os filhotes.</li>
</ol>2. Limpar o coração do rato com CLARIDADE Passiva21,,22,,23
<ol><li>Anestesiar o rato com isoflurano. Execute uma pitada de dedo do dedo para garantir que o mouse esteja totalmente sedado.</li>
	<li>Coloque o mouse sobre uma área cirúrgica limpa na posição supina, prendendo os braços e pernas com fita adesiva.</li>
	<li>Mantenha a sedação de isoflurano no mouse usando um cone do nariz até que o coração seja extraído.</li>
	<li>Abra o peito inferior segurando a pele logo abaixo do processo xifoide com fórceps teciduais e faça uma incisão abrangendo a largura da caixa torácica usando a grande tesoura dissecante.</li>
	<li>Corte ao lado das porções distais da caixa torácica com uma tesoura cirúrgica.</li>
	<li>Exponha o músculo diafragma agarrando o processo xifoide com fórceps teciduais. Desconecte o diafragma usando fórceps curvos.</li>
	<li>Mantendo uma compreensão do processo xifoida, puxe o tecido cranialmente até que o coração batendo esteja acessível.</li>
	<li>Segure o coração na base com fórceps curvados e disseque o coração da cavidade torácica cortando a aorta e a veia cava superior com uma tesoura de iridectomia.</li>
	<li>Enquanto o coração ainda está batendo, coloque o coração em uma placa de Petri cheia de PBS para que o coração bombeie o sangue para dentro enquanto ele continua batendo. O infarto do miocárdio pode ser confirmado verificando se a colocação da sutura está na posição anatômica adequada para a ligadura LAD.</li>
	<li>Aperte suavemente o coração com fórceps para permitir que o coração expulse o sangue residual.</li>
	<li>Transfira o coração do rato para um frasco descartável de concha de vidro de 2,5 mL com 2 mL de PBS. Lave o sangue residual incubando o coração em um agitador por 10 minutos à temperatura ambiente (RT) várias vezes. Altere a solução PBS todas as vezes até que o PBS permaneça limpo.</li>
	<li>Descarte o PBS e encha o frasco com 2 mL de paraformaldeído frio de 4% (PFA). Incubar por 4 horas no RT (Figura 2A).</li>
	<li>Após a incubação, descarte o PFA e o frasco com 2 mL de PBS. Lave o coração em um agitador por 10 min em RT. Repita o passo de lavagem duas vezes, drenando e enchendo o frasco com novo PBS cada vez para lavar completamente o excesso de PFA.</li>
	<li>Descarte o PBS e encha o frasco com 2 mL de 4% de acrilamida e 0,5% de solução VA-044. Incubar durante a noite a 4 °C.</li>
	<li>No dia seguinte, realize a polimerização transferindo o frasco para um bloco de calor fixado a 37 °C por 3 horas.</li>
	<li>Transfira o coração para um novo frasco de concha de vidro e repita o passo 2.12 (ciclo de lavagem PBS).</li>
	<li>Descarte o PBS e encha o frasco com 2 mL de solução de compensação(Tabela 2). Incubar a 37 °C até que o coração esteja limpo. Altere a solução e recarregue com a solução de compensação fresca a cada 2-3 dias. O processo de compensação pode levar até várias semanas(Figura 2B-C). NOTA: Os corações P1 normalmente levam em torno de 3 a 5 dias, enquanto os corações P21 podem levar quase um mês antes que a incubação da Solução de Compensação esteja completa.</li>
	<li>Descarte o PBS e encha o frasco com 2 mL de PBS e repita a etapa 2.12 (ciclo de lavagem PBS). Recarregue o frasco com PBS fresco e incubar durante a noite a 37 °C.</li>
	<li>Se a imunocoloração for realizada, pule as etapas 2.21-2.22 e prossiga para a Seção 3 para a imunocoloração. Se depender exclusivamente de fluorescência endógena, prossiga com as etapas 2.21-2.22 e pule a Seção 3.</li>
	<li>Descarte o PBS e altere a solução para Solução de Correspondência de Índice refrativo (RIMS) (Tabela 3). Incubar durante a noite a 37 °C.</li>
	<li>Após a incubação, o tecido limpo pode ser armazenado na solução RIMS na RT. O tecido pode parecer branco e opaco no centro quando transferido pela primeira vez para o RIMS; o tecido deve ficar transparente após ser incubado em RIMS à temperatura ambiente por várias semanas(Figura 2D).</li>
</ol>3. Opcional: Coloração imuno-histoquímica do coração do rato de montagem integral
<ol><li>Remova o coração limpo da solução RIMS e coloque em um frasco de vidro limpo de 2,5 mL com 2 mL de PBST (PBS com 0,1% Triton-X 100)</li>
	<li>Lave o coração em PBST 3 vezes em um rotador orbital com incubações de 30 min no RT.</li>
	<li>Bloqueie a ligação de anticorpos não específicos ao imersão do coração em 2 mL de 20% de tampão de bloqueio (diluído em PBST) e incubar com rotação por 3 horas em RT. Transfira para 4 °C para colorir com rotação durante a noite. NOTA: O tampão de bloqueio é feito de soro normal que corresponde à espécie em que o anticorpo secundário foi criado.</li>
	<li>Lave o coração em PBST 3 vezes com rotação para incubações de 5 min em RT.</li>
	<li>Mergulhe o coração em anticorpo primário (diluído em 2% de tampão de bloqueio com PBST) e evite a exposição à luz envolvendo o frasco de vidro em papel alumínio. Incubar com rotação durante a noite no RT. NOTA: Deste ponto em diante, a folha de alumínio deve ser continuamente usada para proteger o secundário da exposição à luz ambiente.</li>
	<li>Incubar por mais 24 horas com rotação a 4 °C.</li>
	<li>Após a coloração primária, repita o passo 3.2 (longo ciclo de lavagem pbst) para remover o anticorpo primário desvinculado do tecido. Estenda a lavagem com uma incubação durante a noite com rotação em RT.</li>
	<li>Trabalhando em uma área com iluminação limitada para evitar a exposição à luz de anticorpos secundários, mergulhe o coração em anticorpo secundário (diluído em 2% de tampão de bloqueio com PBST) e incubar com rotação por 3 horas em RT. Transfira para 4 °C para colorir com rotação durante a noite.</li>
	<li>No dia seguinte, repita o passo 3.2 (longo ciclo de lavagem pbst) para remover o anticorpo secundário não ligado.</li>
	<li>Substitua a solução por um tampão de bloqueio de 2% (diluído em PBST). Remova o anticorpo residual desvinculado lavando durante a noite com rotação em RT.</li>
	<li>No dia seguinte, verifique se o excesso de anticorpo secundário foi removido usando microscopia confocal. Amplie a lavagem conforme necessário, substituindo a solução de tampão de bloqueio de 2% diariamente. Proceder uma vez pouco ou nenhum secundário não específico está presente.</li>
	<li>Armazene o coração imunosmacuado em PBS a 4 °C.</li>
	<li>Diretamente antes da microscopia de montagem total, incubar o coração na solução RIMS durante a noite a 37 °C. Estender a incubação por mais 24 horas se o tecido ainda não estiver totalmente limpo.</li>
	<li>Armazene o coração totalmente limpo e imunomanchado em RIMS em RT.</li>
</ol>4. Visualização de populações não-miócitos em 3D com microscopia confocal de fótons único do coração do rato limpo
NOTA: Se os corações do rato forem colhidos embrionáriamente, continue com a seção 4.1. Para os corações de camundongos colhidos no pós-natal, continue com a seção 4.2.
<ol><li>Imagem do coração de rato embrionário limpo<ol>
<li>Preencha o slide de depressão do microscópio com a solução PBS.</li>
		<li>Pegue cuidadosamente o coração limpo com fórceps curvos e coloque o tecido sobre o escorregador.</li>
		<li>Monte o slide com um deslizamento de vidro. O tecido agora pode ser imagem um microscópio confocal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imagem do coração do rato pós-natal limpo<ol>
<li>Preencha metade da câmara do slide de depressão com a solução PBS. Para criar uma câmara grande o suficiente para caber um coração de rato adulto, um slide de depressão de polipropileno impresso em 3D foi feito medida(Figura 4).</li>
		<li>Pegue cuidadosamente o coração limpo com fórceps curvos e coloque o tecido na câmara. Preencha o volume restante da câmara com PBS.</li>
		<li>Encha a câmara com PBS para que a superfície do líquido forme uma cúpula acima do topo da câmara. Monte o slide de cobertura. O tecido agora pode ser imagem um microscópio confocal vertical.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Lazar, E., Sadek, H. A., Bergmann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+renewal+in+the+human+heart%3A+insights+from+the+fall-out%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out.</a> European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).</li>
<li>Kikuchi, K., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+regenerative+capacity+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiac regenerative capacity and mechanisms.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 719-741 (2012).</li>
<li>Habecker, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+neurocardiology%3A+development%2C+and+cellular+and+molecular+adaptations+to+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease.</a> The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).</li>
<li>Savarese, G., Lund, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Public+Health+Burden+of+Heart+Failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiac+Failure+Review%22%5BJournal%5D)">Global Public Health Burden of Heart Failure.</a> Cardiac Failure Review. 3 (1), 7-11 (2017).</li>
<li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+regenerative+potential+of+the+neonatal+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart.</a> Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).</li>
<li>Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+models+for+cardiac+regeneration+in+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice.</a> Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).</li>
<li>Karwowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+infarct+artery+location%2C+acute+total+coronary+occlusion%2C+and+mortality+in+STEMI+and+NSTEMI+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Polish+Archives+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Relationship between infarct artery location, acute total coronary occlusion, and mortality in STEMI and NSTEMI patients.</a> Polish Archives of Internal Medicine. 127 (6), 401-411 (2017).</li>
<li>Lusis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis.</a> Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).</li>
<li>MAGGIC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+survival+of+patients+with+heart+failure+with+preserved+or+reduced+left+ventricular+ejection+fraction%3A+an+individual+patient+data+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis.</a> European Heart Journal. 33 (14), 1750-1757 (2012).</li>
<li>Notari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+local+microenvironment+limits+the+regenerative+potential+of+the+mouse+neonatal+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">The local microenvironment limits the regenerative potential of the mouse neonatal heart.</a> Science Advances. 4 (5), 5553(2018).</li>
<li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neonatal+and+adult+mammalian+heart+regeneration+by+the+miR-15+family%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).</li>
<li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Unique+Collateral+Artery+Development+Program+Promotes+Neonatal+Heart+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Unique Collateral Artery Development Program Promotes Neonatal Heart Regeneration.</a> Cell. 176 (5), 1128-1142 (2019).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+neonatal+cardiac+extracellular+matrix+prevents+widespread+ventricular+remodeling+in+adult+mammals+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomateria%22%5BJournal%5D)">Decellularized neonatal cardiac extracellular matrix prevents widespread ventricular remodeling in adult mammals after myocardial infarction.</a> Acta Biomateria. 87, 140-151 (2019).</li>
<li>Mahmoud, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerves+Regulate+Cardiomyocyte+Proliferation+and+Heart+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Nerves Regulate Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration.</a> Developmental Cell. 34 (4), 387-399 (2015).</li>
<li>Yanai, H., Tanaka, T., Ueno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+lineage+tracing+methods+and+intestinal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Multicolor lineage tracing methods and intestinal tumors.</a> Journal of Gastroenterology. 48 (4), 423-433 (2013).</li>
<li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beginner%27s+guide+to+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A beginner's guide to tissue clearing.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 35-39 (2017).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs.</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li>
<li>Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology%2C+CLARITY%2C+to+intact+solid+organs+including+brain%2C+pancreas%2C+liver%2C+kidney%2C+lung%2C+and+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biol%22%5BJournal%5D)">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Developmental Biol. 14, 48(2014).</li>
<li>Wan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+seven+optical+clearing+methods+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain.</a> Neurophotonics. 5 (3), 035007(2018).</li>
<li>Phillips, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+passive+CLARITY+and+immunofluorescent+labelling+of+multiple+proteins+in+human+cerebellum%3A+understanding+mechanisms+of+neurodegeneration+in+mitochondrial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease.</a> Scientific Reports. 6, 26013(2016).</li>
<li>Blom, J. N., Lu, X., Arnold, P., Feng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+Infarction+in+Neonatal+Mice%2C+A+Model+of+Cardiac+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), e54100(2016).</li>
<li>Sereti, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cardiomyocyte+clonal+expansion+during+mouse+heart+development+and+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury.</a> Nature Communications. 9 (1), 754(2018).</li>
<li>Lepilina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+epicardial+injury+response+supports+progenitor+cell+activity+during+zebrafish+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration.</a> Cell. 127 (3), 607-619 (2006).</li>
<li>Wang, J., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Reservoir+of+Mature+Cavity+Macrophages+that+Can+Rapidly+Invade+Visceral+Organs+to+Affect+Tissue+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Reservoir of Mature Cavity Macrophages that Can Rapidly Invade Visceral Organs to Affect Tissue Repair.</a> Cell. 165 (3), 668-678 (2016).</li>
<li>Vieira, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardiac+lymphatic+system+stimulates+resolution+of+inflammation+following+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The cardiac lymphatic system stimulates resolution of inflammation following myocardial infarction.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3402-3412 (2018).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

As interações celular-celular entre cardiomiócitos e populações não-miócitos são um fator determinante para saber se o coração será submetido a fibrose ou reparação após a lesão. Descobertas têm sido feitas demonstrando que uma variedade de tipos de células, incluindo nervos14, células epicárdicas24, macrófagos peritoneal25, arterioles12,13, e células endoteliais linfáticas2...

O coração tem sido considerado por muito tempo como um órgão pós-mitótico, mas evidências recentes demonstram que a renovação dos cardiomiócitos ocorre no coração humano adulto em cerca de 1% ao ano1. No entanto, essas baixas taxas de rotatividade de cardiomiócitos são insuficientes para repor a perda maciça de tecido que ocorre após a lesão. Um coração que sofreu um infarto do miocárdio perderá cerca de um bilhão de cardiomiócitos, muitas vezes servindo como prelúdio para insuficiência cardíaca e morte cardíaca súbita2,3. Com mais de 26 milhões de pessoas afetadas pela insuficiência cardíaca em todo o mundo, há uma necessidade não atendida de terapêutica que pode reverter os danos infligidos por doenças cardíacas4.
A fim de preencher essa lacuna na terapêutica, os cientistas começaram a investigar mecanismos evolutivamente conservados que sustentam a regeneração endógena após a lesão. Um modelo para estudar a regeneração cardíaca de mamíferos é o camundongo neonatal. Na semana seguinte ao nascimento, os camundongos neonatais têm uma resposta regenerativa robusta após danos cardíacos5. Já demonstramos anteriormente que camundongos neonatais podem regenerar seu coração através da proliferação de cardiomiócitos após uma ressecção apical5. Embora essa técnica possa evocar a regeneração cardíaca nos recém-nascidos, a cirurgia carece de relevância clínica para lesões cardíacas humanas. Para imitar uma lesão humana no modelo de camundongos neonatais, desenvolvemos uma técnica para induzir um infarto do miocárdio através de uma oclusão da artéria coronária6. Esta técnica requer ligadura cirúrgica da artéria descendente anterior esquerda (LAD), responsável por fornecer 40%-50% do sangue para o miocárdio ventricular esquerdo6,7. Assim, a cirurgia resulta em um infarto que impacta uma parcela significativa da parede ventricular esquerda. Este dano ao miocárdio estimulará a proliferação de cardiomiócitos e a regeneração cardíaca em recém-nascidos5.
A cirurgia de oclusão da artéria coronária fornece um método altamente reprodutível e diretamente translacional para descobrir o funcionamento interno da regeneração cardíaca. A cirurgia neonatal faz um paralelo com a aterosclerose da artéria coronária no coração humano, onde o acúmulo de placa dentro das paredes internas das artérias pode causar uma oclusão e posterior infarto do miocárdio8. Devido a um vazio nos tratamentos terapêuticos para pacientes com insuficiência cardíaca, uma oclusão no LAD está associada a taxas de mortalidade que chegam a 26% dentro de um ano após a lesão9, e consequentemente tem sido chamada de "fazedora de viúvas". Os avanços terapêuticos requerem um modelo que reflita com precisão os complexos efeitos fisiológicos e patológicos da lesão cardíaca. Nosso protocolo cirúrgico para lesão cardíaca de camundongos neonatais fornece uma plataforma que permite aos pesquisadores investigar as pistas moleculares e celulares que sinalizam a regeneração cardíaca dos mamíferos após a lesão.
Pesquisas recentes destacam a relação dinâmica entre o ambiente extracelular e a proliferação de cardiomiócitos. Por exemplo, a janela regenerativa pós-natal pode ser estendida diminuindo a rigidez da matriz extracelular ao redor do coração10. Biomateriais da matriz extracelular neonatal também podem promover a regeneração cardíaca em corações de mamíferos adultos após lesão cardíaca11. Também acompanhando a proliferação de cardiomiócitos é uma resposta angiogênica12,13; a formação da artéria colateral única ao coração regenerador do camundongo neonatal mostrou-se essencial para estimular a regeneração cardíaca12. Além disso, nosso laboratório demonstrou que a sinalização nervosa regula a proliferação de cardiomiócitos e a regeneração cardíaca via modulação dos níveis dos fatores de crescimento, bem como a resposta inflamatória após a lesão14. Esses achados enfatizam a necessidade de traçar populações de células não miócitos em resposta a lesões cardíacas. Para atingir esse objetivo, aproveitamos o sistema de recombinação Cre-lox em linhas transgênicas de camundongos para incorporar a expressão constitutiva ou condicional de proteínas fluorescentes de repórteres para rastreamento de linhagem. Além disso, podemos usar métodos avançados para determinar a padronização da expansão clonal com a linha de mouses Rainbow, que se baseia na expressão estocástica dos repórteres fluorescentes de cor multi-cor dependentes do Cre para determinar a expansão clonal das populações de células-alvo15. A utilização de rastreamento de linhagem com a cirurgia de oclusão da artéria coronária neonatal é uma poderosa ferramenta para dissecar os intrincados mecanismos celulares de regeneração cardíaca.
O rastreamento da linhagem de células fluorescentes rotuladas com imagens de órgãos tridimensionais (3D) é difícil de alcançar usando a técnica tradicional de secção e reconstrução – especialmente quando as populações celulares são frágeis, como fibras nervosas ou vasos sanguíneos. Enquanto a imagem direta do órgão por secção óptica pode capturar populações celulares superficiais, estruturas que residem profundamente dentro do tecido permanecem inacessíveis. Para contornar essas barreiras, técnicas de limpeza de tecidos foram desenvolvidas para reduzir a opacidade de tecidos de órgãos inteiros. Recentemente, avanços significativos foram feitos para os métodos de tecido rígido hibridizado de Acrilamida com acrilamida da Clear Lipide- hibridizado de imagem rígida hYdrogel (CLARITY), que limpam o tecido fixo através da extração lipídica16. Medidas também são tomadas para homogeneizar o índice de refração e, posteriormente, reduzir a dispersão de luz durante a imagem17. Um desses métodos é o CLARITY ativo, que acelera a decomposição lipídica usando eletroforese para penetrar o detergente em todo o tecido18. Embora eficaz, este método de limpeza de tecidos requer equipamentos caros e pode causar danos teciduais, tornando a abordagem incompatível com populações celulares frágeis, como os nervos cardíacos19. Assim, utilizamos a abordagem passiva CLARITY, que conta com o calor para facilitar suavemente a penetração de detergentes, auxiliando, portanto, na retenção de estruturas celulares intrincadas20,21.
A CLARIDADE Passiva é tipicamente considerada menos eficiente do que a CLARIDADE ativa18,pois a técnica é frequentemente acompanhada por dois grandes obstáculos: a incapacidade de limpar toda a profundidade do órgão e a extensa quantidade de tempo necessária para limpar tecidos adultos. Nossa abordagem passiva CLARITY supera ambas as barreiras com um processo de limpeza acelerada que é capaz de limpar totalmente o tecido cardíaco neonatal e adulto. Nossa técnica passiva de limpeza de tecidos CLARITY alcançou uma eficiência que permite a visualização de uma variedade de populações de células cardíacas, incluindo populações raras distribuídas por todo o coração adulto. Quando o coração limpo é imagemdo com microscopia confocal, a arquitetura da padronização específica da célula durante o desenvolvimento, doença e regeneração pode ser iluminada.

<table><tbody><tr><td>1-tioglicerol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-0 Prolene Suturas</td><td>Ethicon</td><td>8889H</td><td>Suturas de Polipropileno</td></tr><tr><td>Acrilamida</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido</td><td></td><td></td><td></td>bórico</tr><tr><td>Pinça Curva</td><td>Excelta</td><td>16-050-146</td><td>Meia Curva, Serrilhada, 4 in</td></tr><tr><td>Pinça de Curativo</td><td>Fisherbrand</td><td>13-812-39</td><td>Dissecação, Frasco de Vidro de 4,5 pol.</td></tr><tr><td></td><td>Fisherbrand</td><td>03-339-26A</td><td>Frasco de 12 x 35 mm com Tampa</td></tr><tr><td>Histodenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Gradiente de densidade médio</td></tr><tr><td>Tesoura de Iridectomia</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de Dissecação Grande</td> de 2 mm <td>de Ponta Fisherbrand</td><td>08-951-20</td><td>Reto, 6 pol.</td>Porta-agulhas</tr><tr><td></td><td>Fisherbrand</td><td>08-966</td><td>Mayo-Hegar, 6 pol.</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfato Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinça Afiada</td><td>Sigma-Adrich</td><td>Z168777</td><td>Ponta Fina, Reta, 4.25 in</td></tr><tr><td>Pequena Tesoura de Dissecação</td><td>Walter Stern Inc</td><td>25870-002</td><td>30 mm Cutting Edge</td></tr><tr><td>Azida</td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>Sódio Dodecil Sulfato (SDS)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Tecido Forceps</td><td>Excelta</td><td>16050133</td><td>Tecido Médio, 1X2 Dentes</td></tr><tr><td>VA-044</td><td>Wako Chemicals</td><td></td><td>Iniciador azo solúvel em água</td></tr></tbody></table>

capturando a resposta de lesão cardíaca de populações de células-alvo através de imagens tridimensionais do coração limpo

Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging

As doenças cardiovasculares superam todas as outras causas de morte e são responsáveis por impressionantes 31% das mortes em todo o mundo. Esta doença se manifesta em lesão cardíaca, principalmente na forma de um infarto agudo do miocárdio. Com pouca resiliência após a lesão, o tecido cardíaco outrora saudável será substituído por tecido fibroso, cicatriz não contraído e muitas vezes será um prelúdio para a insuficiência cardíaca. Para identificar novas opções de tratamento na medicina regenerativa, a pesquisa se concentrou em vertebrados com capacidades regenerativas inatas. Um desses organismos modelo é o camundongo neonatal, que responde a lesões cardíacas com regeneração robusta do miocárdio. A fim de induzir uma lesão no camundongo neonatal que é clinicamente relevante, desenvolvemos uma cirurgia para ocluir a artéria descendente anterior esquerda (LAD), espelhando um infarto do miocárdio desencadeado pela aterosclerose no coração humano. Quando combinado com a tecnologia para acompanhar as mudanças tanto dentro de cardiomiócitos quanto de populações não-miócitos, este modelo nos fornece uma plataforma para identificar os mecanismos que orientam a regeneração cardíaca. Obtendo uma visão das mudanças nas populações de células cardíacas após a lesão, uma vez que se baseou fortemente em métodos como secção de tecidos e exame histológico, que são limitados à análise bidimensional e muitas vezes danificam o tecido no processo. Além disso, esses métodos não têm a capacidade de rastrear mudanças nas linhagens celulares, em vez disso, fornecendo apenas um instantâneo da resposta à lesão. Aqui, descrevemos como métodos tecnologicamente avançados em modelos de rastreamento de linhagem, limpeza de órgãos inteiros e microscopia de montagem total tridimensional (3D) podem ser usados para elucidar mecanismos de reparação cardíaca. Com nosso protocolo para cirurgia de infarto do miocárdio neonatal, limpeza de tecidos e imagem de órgão inteiro 3D, as vias complexas que induzem a proliferação de cardiomiócitos podem ser desvendadas, revelando novos alvos terapêuticos para a regeneração cardíaca.

Muitas vezes os dois passos mais desafiadores são guiar o coração para fora da cavidade torácica e ligar o LAD. Para solucionar esses degraus, podem ser feitos ajustes na colocação da punção inicial entre os quartos músculos intercostais; se a perfuração e dissecção contundente estiverem muito próximas do esterno, o coração pode não ser capaz de sair da cavidade torácica(Figura 1A).
Além disso, pode ser necessário aumentar a pressão no abdômen esq...

A proliferação de cardiomiócitos após a lesão é um processo dinâmico que requer uma sinfonia de pistas extracelulares de populações de células não miócitos. Utilizando o rastreamento de linhagem, claridade passiva e técnicas tridimensionais de microscopia confocal de montagem completa, podemos analisar a influência de uma variedade de tipos de células na reparação e regeneração cardíaca.

Capturando a resposta de lesão cardíaca de populações de células-alvo através de imagens tridimensionais do coração limpo

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in ...

A regeneração cardíaca endógena é um processo dinâmico que envolve vários tipos de células trabalhando juntos em conjunto para montar uma resposta regenerativa robusta. Olhar para o tecido regenerador através de imagens 3D do coração limpo em resposta à lesão pode ajudar na reconstrução da dinâmica celular que guia essa resposta regenerativa cardíaca. Nosso protocolo foi projetado especificamente para rastrear células durante o desenvolvimento e regeneração.Não prevemos limitações na aplicação ampla de nossas técnicas de limpeza, coloração e imagem a outros tipos de órgãos. Para a oclusão da artéria coronária induzida pelo LAD, esterilize primeiro a área cirúrgica de um filhote neonatal anesthetizado de um dia de idade com solução antisséptica. Faça uma incisão transversal na região do peito.Para separar a pele do músculo, use um par de fórceps de curativo para levantar a pele cuidadosamente enquanto pressiona suavemente a tesoura contra os músculos intercostais em posição fechada. Localize o quarto espaço intercostal e use pequenos fórceps para fazer uma pequena punção superficial tomando cuidado para evitar os órgãos internos. Usando dissecção contundente e fórceps de curativo, amplie a área entre os músculos intercostais apenas até que um dedo possa ser aplicado no lado esquerdo do abdômen enquanto segura o espaço intercostal aberto com fórceps de curativo para guiar suavemente o coração para fora da cavidade torácica.Uma vez extraído o coração, permita que o coração descanse sobre os músculos intercostais e localize o LAD como a região do coração com menos sangue agrupado. Para induzir o infarto do miocárdio, use uma sutura de 6-0 para amarrar um nó quadrado firmemente ao redor do vaso duas vezes sem cortar a artéria. Blanching no ápice deve ser observado imediatamente.É importante permanecer consistente na colocação da sutura ao longo do LAD para um tamanho de infarto semelhante. Isso é melhor conseguido acessando o coração rapidamente enquanto o sangue ainda está fluindo através das artérias. Quando a sutura for colocada, deixe o coração escorregar de volta para a cavidade torácica.Sutura as costelas junto com um cirurgião e um nó quadrado usando fórceps sem cortes para levantar o conjunto superior de costelas enquanto passa uma sutura de 6-0 através do conjunto superior e inferior das costelas. Aplique um pequeno volume de cola de pele no abdômen superior e use fórceps finos para posicionar a pele do abdômen inferior sobre a região do peito exposta. Em seguida, coloque o filhote em uma almofada de aquecimento e realize a ligadura no próximo animal.Quando todas as cirurgias tiverem sido realizadas, devolva os filhotes quentes e móveis para a gaiola da mãe. Para a clareza passiva do tecido cardíaco colhido, 21 dias após a confirmação da falta de resposta ao aperto do dedo do pé, coloque o rato em uma área cirúrgica limpa na posição supina e fixe os membros com fita adesiva. Usando fórceps teciduais, segure a pele logo abaixo do processo xifoide e faça uma incisão abrangendo a largura da caixa torácica.Corte ao lado das porções distais da caixa torácica e use os fórceps para levantar o processo xifoide para expor o diafragma. Retire o diafragma com fórceps curvos e puxe o tecido cranialmente até que o coração pulsante esteja acessível. Use as fórceps curvas para agarrar o coração na base e use uma tesoura de iridectomia para cortar a aorta e a veia cava superior.Coloque o coração batendo em uma placa de Petri de PBS para que o coração bombeie qualquer sangue retido. O infarto do miocárdio pode ser confirmado por uma colocação anatômica correta da ligadura LAD. Quando o coração parar de bater, aperte suavemente o órgão com fórceps para expulsar o sangue residual e transferir o espécime para um frasco descartável de 2,5 mililitros de vidro contendo dois mililitros de PBS.Coloque o frasco em um agitador por pelo menos 30 minutos à temperatura ambiente mudando a solução PBS a cada 10 minutos até que a solução permaneça livre de sangue. Quando o PBS estiver claro, substitua o PBS por dois mililitros de paraformaldeído frio de 4% para uma incubação de quatro horas à temperatura ambiente, seguido por três lavagens de 10 minutos no shaker com dois mililitros de PBS fresco por lavagem. Após a última lavagem, encha o frasco com dois mililitros de 4% de acrilamida suplementados com solução 0,5%VA-044 para uma incubação noturna a quatro graus Celsius.No dia seguinte, coloque o frasco em um bloco de calor de 37 graus Celsius por três horas. No final da polimerização, transfira o coração para um novo frasco de concha de vidro e lave o tecido cardíaco em dois mililitros de PBS frescos 10 minutos de cada vez refrescando o PBS no final de cada incubação. Quando o PBS estiver limpo, substitua o tampão de lavagem por dois mililitros de solução de compensação.Incubar o espécime a 37 graus Celsius por várias semanas até que o coração esteja claro, refrescando a solução de compensação a cada dois ou três dias. Quando o órgão estiver limpo, lave o espécime com PBS no shaker como demonstrado antes de encher o frasco com PBS fresco para uma incubação de 24 horas a 37 graus Celsius. No dia seguinte, substitua o PBS por RIMS para uma incubação de 24 horas a 37 graus Celsius.No final da incubação, o tecido é totalmente limpo. O tecido deve ficar transparente depois de várias semanas. Para a imagem do coração do rato pós-natal limpo após a indução do infarto do miocárdio, preencha metade de uma câmara de um slide de depressão personalizado com PBS e use fórceps curvos para transferir cuidadosamente o coração limpo para a câmara.Encha o volume restante da câmara com PBS. Em seguida, encha a câmara com PBS até que a superfície do líquido forme uma cúpula acima do topo da câmara e monte a lâmina de cobertura antes de imaginar o tecido por microscopia confocal de acordo com os protocolos de imagem padrão. Se a punção e dissecção contundente estiverem muito próximas ao esterno, o coração pode não ser capaz de sair da cavidade torácica.Se o coração não sair facilmente da cavidade, aplique pressão no abdômen esquerdo para facilitar o processo. Complicações podem ocorrer por descansar o coração nos músculos intercostais. Por isso, é importante manter a dissecação contundente a um tamanho mínimo em uma orientação horizontal para permitir uma visualização clara e acessibilidade do LAD.Observe que uma ligadura superficial terá menos espaço para ajuste na colocação final da sutura e que a sutura em torno do LAD deve ser realizada com movimentos estáveis controlados. No final da etapa de compensação, todo o coração deve ser consistentemente opaco sem descoloração no centro. Após alguns dias na solução RIMS à temperatura ambiente, o coração deve ser completamente limpo e alguma expansão tecidual pode ser observada.Como observado pela expressão proteica tdTomato repórter, os nervos cardíacos são principalmente superficiais com algumas populações residentes na camada epicárida. É importante ressaltar que a confirmação da expressão proteica repórter é preservada após passar pelo protocolo de clareza, como demonstrado. Limpar e fotografar o coração 3D fornece perspectiva para a localização e morfologia das populações de células cardíacas.Isso nos permite identificar novos aspectos na padronização celular e interações célula-célula.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Adulto miócitos cardíacos são células primárias que podem ser isoladas de corações de animais e cultivados por vários dias. Dentro deste período a cultura de transferência de gene adenoviral podem ser usadas para expressar biossensores geneticamente codificado (GEBS) ou proteínas de fusão fluorescente. Ambas as abordagens permitem investigações celular por meio de microscopia confocal.

Isolamento e manipulação genética de adultos miócitos cardíacos for Imaging Confocal

Descrevemos um protocolo para obter imagens volumétricas de células marcadas com proteínas fluorescentes profundamente dentro de corações embrionários e pós-natais intactos. Utilizando métodos de limpeza de tecido em combinação com coloração de montagem inteira, células marcadas com proteína fluorescente única dentro de um coração embrionário ou pós-natal podem ser visualizadas com clareza e precisão.

Imagiologia Cleared embrionário e pós-natal Corações na resolução de célula única

Este protocolo descreve um novo método para a comparação 3D do tecido do miocárdio todo-coração com a RM. Este é concebido para a avaliação precisa de injecções intramiocárdicos na zona de fronteira do enfarte de um modelo suíno crónica de enfarte do miocárdio.

Análise Tecidos do Miocárdio Whole-coração 3D

Este estudo utiliza uma técnica de microscopia (LSFM) de fluorescência de luz-folha de iluminação dupla face combinada com compensação óptica para estudar o coração murino.

Microscopia de fluorescência de luz-folha para o estudo do coração murino

Aqui, descrevemos uma metodologia fácil de usar para gerar matrizes microtissue cardíacas auto-montadas em 3D compostas de cardiomiócitos pluripotentes pluripotentes induzidos pelo homem, cardiomiócitos, fibroblastos cardíacos e células endoteliais. Esta técnica de necessidade de células fáceis de usar e baixas para gerar microtissues cardíacas pode ser implementada para modelagem de doenças e estágios iniciais do desenvolvimento de medicamentos.

Fabricação de matrizes microtissue cardíacas 3D usando Cardiomiócitos derivados do iPSC humano, fibroblastos cardíacos e células endoteliais

Um método refinado de limpeza tecidual foi desenvolvido e aplicado ao coração do rato adulto. Este método foi projetado para limpar tecido cardíaco denso e autofluorescente, mantendo a fluorescência do fibroblasto rotulada atribuída a uma estratégia de repórter genético.

Clareza refinada baseada em clareza para organização de fibroblasto tridimensional em corações de rato saudáveis e feridos

Relatamos um método para reconstrução mesoscópica de todo o coração do rato, combinando novos avanços na transformação e coloração de tecidos com o desenvolvimento de um microscópio de folha de luz digitalizado axialmente.

Imagem óptica mesoscópica do coração de todo o rato

O protocolo utiliza microscopia avançada de folha de luz junto com métodos adaptados de limpeza de tecidos para investigar estruturas cardíacas intrincadas em corações de roedores, com grande potencial para a compreensão da morfogênese e remodelação cardíaca.

Imagem de folha de luz para revelar estrutura cardíaca em corações de roedores

A reconstrução tridimensional (3D) do dano cardíaco no infarto agudo do miocárdio reperfundido (repIAM) permite a quantificação fiel e a co-localização dos padrões associados que afetam a doença. Aqui, uma abordagem de imagem guiada por folha de luz automatizável é fornecida para medição contemporânea de danos cardíacos, área de risco e resposta de células imunes.

Análise 3D Simultânea de Dano Cardíaco e Resposta Imune em Infarto Agudo do Miocárdio Reperfundido Usando Microscopia de Fluorescência de Folha de Luz

O atual ensaio 2,3,5-Trifeniltetrazólio (TTC) introduz um protocolo refinado de coloração TTC que permite a análise de lesão do miocárdio em resolução microscópica, produzindo imagens de alta qualidade que permitem uma avaliação precisa e confiável do tamanho do infarto e da viabilidade do cardiomiócito em nível celular.

Um ensaio microscópico de cloreto 2,3,5-trifeniltetrazólio para análise precisa e confiável da lesão miocárdica

Aprenda a rastrear populações celulares em regeneração cardíaca usando microscopia confocal 3D e técnica CLARITY. Este método permite visualizar dinâmicas celulares em corações transparentes após lesão.

Capturando a resposta de lesão cardíaca de populações de células-alvo através de imagens tridimensionais do coração limpo

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