Name: Design de um stent traqueal biocompatível de droga em camundongos com estenose laringotraquena (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Aprenda a colocação transoral de stents de liberação de fármacos em camundongos com estenose laringotraqueal. Este método minimamente invasivo oferece uma plataforma viável para investigação de terapias locais em modelos pré-clínicos.

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Instituto Nacional de Surdez e Outros Distúrbios de Comunicação dos Institutos Nacionais de Saúde os números de premiação 1K23DC014082 e 1R21DC017225 (Alexander Hillel). Este estudo também foi apoiado financeiramente pela Sociedade Triológica e pelo American College of Surgeons (Alexander Hillel), pela American Medical Association Foundation, Chicago, IL (Madhavi Duvvuri) e por uma bolsa de treinamento T32 NIDCD (Kevin Motz).

NOTA: Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee (MO12M354).
1. Preparação de rapamicina em PLLA-PCL
<ol><li>Prepare dois frascos de vidro (com tampas) de 70:30 soluções de polímero PLLA-PCL (viscosidade inerente 1,3-1,8 DL/G; Tabela de Materiais) soluções, com um frasco contendo 1,0% de rapamicina e o outro sem rapamicina.<ol>
<li>Faça uma rapamicina de 1,0% contendo solução de polímero, adicionando 6 mg de rapamicina a 600 mg de 70:30 PLLA-PCL em um frasco de vidro.</li>
		<li>Para solução de polímero sem rapamicina (controle), adicione apenas 600 mg de 70:30 PLLA-PCL ao frasco de vidro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>uma capa de fumaça, adicione 6 mL de diclorometano a cada frasco de vidro. CUIDADO: Diclorometano é um material corrosivo e apenas pipetas de vidro devem ser usadas. As precauções de segurança apropriadas incluem proteção de olho pessoal e luvas.</li>
	<li>Adicione 120 μL de glicerol a cada frasco de vidro (para solução de glicerol de 2%). NOTA: A adição de glicerol permite maior flexibilidade e diminuição da rigidez na construção do stent.</li>
	<li>Recapitue os frascos de vidro e permita que 70:30 PLLA-PCL com e sem rapamicina se dissolva e homogeneize para 6-12 h. NOTA: Frascos de vidro também podem ser colocados em uma plataforma de agitação rotativa para uma dissolução mais rápida.</li>
</ol>2. Teste de luluna de rapamicina
<ol><li>Pipette 1 mL de 70:30 PLLA-PCL solução contendo 1% rapamicina em uma placa de Petri de vidro. NOTA: Este volume de 70:30 plla-pcl solução contendo 1% rapamicina irá conter 120 μg de rapamicina e representa a quantidade total de rapamicina em cada construção. Volumes e concentrações alternativos podem ser usados.</li>
	<li>Permita 70:30 PLLA-PCL com 1% de rapamicina para endurecer em um disco plano na placa de petri de vidro.</li>
	<li>Uma vez endurecido, coloque o disco em 2 mL de sostelo tampão de fosfato (PBS, pH 7.4) e incubar em uma câmara de 37 °C.</li>
	<li>Coletar e substituir PBS (2 mL) a cada 24 h e usar PBS coletado para análise de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) de conteúdo de rapamicina.</li>
	<li>Use um autosampler e uma coluna HPLC c18 4,6 cm x 250 mm para executar amostras através do injetor de amostra automática, juntamente com diluições em série de rapamicina para criar uma curva padrão calibrada. Executar cada amostra em triplicado. NOTA: Diluições em série de rapamicina a ser testada incluem 10%, 1%, 0,1% e 0,01%.</li>
	<li>Use uma fase móvel de água de grau HPLC e acetônio com volume/volume de 10/90 com uma taxa de fluxo de 2,0 mL/min. Deabsorção definida durante o HPLC para rapamicina a 280 nm. NOTA: A Figura 1 mostra a lubrisão da rapamicina durante um período de 14 dias.</li>
</ol>3. Criação de stents das vias aéreas plla-PCL murine de rapamicina
NOTA: Executar etapas 3.2-3.9 usando materiais estéreis e técnica estéril para evitar a contaminação que influenciaria as aplicações in vivo e in vitro.
<ol><li>Prepare soluções PLLA-PCL contendo rapamicina, conforme descrito na seção 1.</li>
	<li>Usando uma pipeta pasteur de vidro com um balão de borracha, aplique 1 mL de solução PLLA-PCL contendo 1% de rapamicina na cânula venosa de um angiocateter à base de etileno fluorado de 22 G (Mesa de Materiais). Segure o angiocateter em uma mão e use a pipeta de vidro para soltar a solução PLLA-PCL no angiocateter. Gire lentamente o angiocateter para assegurar uma cobertura homogênea do angiocateter com a solução PLLA-PCL. NOTA: No início, a solução PLLA-PCL será fina, mas à medida que o diclorometano evapora durante a aplicação para o angiocateter, a solução se tornará mais viscosa para moldar o angiocateter. Transformar continuamente o angiocateter durante a aplicação é benéfico. Esta etapa deve ser feita lenta e meticulosa mente para garantir a espessura consistente do stent.</li>
	<li>Prop o angiocateter moldado com a ponta do angiocateter voltado para baixo e o punho na borda de uma placa de Petri de vidro para secagem.</li>
	<li>Permitir que os stents sequem por 24 h em um capô a vácuo à temperatura ambiente (Figura 2A).</li>
	<li>Retire a construção do stent do angiocateter subjacente, torça suavemente o cateter subjacente livre e deslizando-o para fora do stent moldado (Figura 2B).</li>
	<li>Verifique o stent circuferentially para quaisquer defeitos que possam ter resultado durante o processo de fundição. Se um defeito no stent fundido estiver presente, descarte-o.</li>
	<li>Apare cada extremidade do stent moldado com tesouras retas finas de modo que as bordas sejam axiais.</li>
	<li>Usando tesouras retas finas, corte segmentos axiais de 3 mm do stent fundido para uso em um modelo de mouse de LTS(Figura 2C). NOTA: Aproximadamente 8 stents podem ser feitos de um angiocateter fundido, com cada stent de 3 mm contendo 120 μg de rapamicina.</li>
	<li>Carregue o stent de 3 mm em um novo cateter venoso de 22 para uso em um modelo de mouse de LTS (Figura 1).</li>
</ol>4. Indução de estenose laringotraheal em camundongos
<ol><li>Antes de realizar estudos in vivo mouse obter aprovação do Animal Care and Use Committee.</li>
	<li>Anestesie um C57BL/6 masculino de 9 semanas de idade, dando uma injeção intraperitoneal de cetamina (80-100 mg/kg) e xilazine (5 a 10 mg/kg). NOTA: Outras cepas de camundongos podem ser substituídas, mas recomenda-se que o peso dos ratos esteja entre 20 e 27 g.</li>
	<li>Randomize camundongos em um grupo experimental (lesão quimiomecânica com colocação de um stent PLLA-PCL contendo rapamicina de 1%) e dois grupos de controle: 1) lesão quimiomecânica com a colocação de um stent PLLA-PCL, 2) lesão quimiomecânica sem a colocação de um stent.</li>
	<li>Coloque um mouse em uma plataforma cirúrgica em uma posição supina. Use um pequeno laço de linha afixada no topo da plataforma para estender a coluna cervical, looping-lo em torno dos incisivos centrais.</li>
	<li>Afixar as mãos e pernas do mouse para a mesa usando pedaços de fita de 2 polegadas. Pitada de pata do rato para garantir que ele teve anestesia adequada.</li>
	<li>O local cirúrgico é então preparado. A pele sobrejacente deve ser removida e a pele deve ser limpa (esfoliação alternada de iodo ou clorexidina com álcool ou desinfetante de pele diluída) três vezes. A área deve ser drapejada e luvas estéreis ser desgastado. Os instrumentos esterilizados devem ser colocados em uma superfície estéril quando não estiverem em uso.</li>
	<li>Faça uma incisão vertical de 1,5 cm no pescoço do rato usando uma tesoura fina de íris curva. Divida o timo sobrejacente e lateralize os dois lobos resultantes para visualizar a traqueia. Divida os músculos sternohyoid e sternothyroid (cinta) sobre o apego superior bilateralmente. NOTA: Todo o complexo laringotracheal deve ser completamente exposto após isso.</li>
	<li>Passe um angiocateter 22 G transoralmente através da laringe na traqueia. Use pequenos fórceps para aplicar pressão sobre a laringe anterior do mouse para auxiliar na colocação correta do angiocateter. Visualize o angiocateter branco através da traqueia para garantir a colocação correta (não esôfago). NOTA: A traqueia do rato é extremamente fina e o angiocateter branco será visualizado através da traqueia translúcida.</li>
	<li>Passe uma escova de arame revestida de bleomicina através do angiocateter inserido.</li>
	<li>Retire lentamente o angiocateter de modo que somente a escova de fio permaneça na traqueia.</li>
	<li>Aplique pressão contrária usando fórceps finos na traqueia para interromper mecanicamente o lumen traqueal com a escova de arame.</li>
	<li>Reinserir o angiocateter na traqueia sobre a escova de arame.</li>
	<li>Retire a escova de arame e reaplicar bleomicina.</li>
	<li>Repita os passos 4,8-4,12 um total de 5x. Aplique bleomicina no pincel entre cada aplicação. NOTA: Validação e descrição deste modelo podem ser encontradas em Hillel et al.8.</li>
	<li>Retire o angiocateter da traqueia do rato. NOTA: Se nenhum stent deve ser colocado, a incisão pode ser fechada com cola de tecido.</li>
</ol>5. Transoral PLLA-PCL colocação stent em camundongos
<ol><li>Carregue um stent fundido de 3 mm em um angiocateter vazio de 22 G(Figura 3A). NOTA: O stent deve descansar 5 mm da ponta do angiocateter.</li>
	<li>Desenhe uma fina linha vertical preta no stent fundido de 3 mm. NOTA: Esta linha permite uma melhor visualização do stent na traqueia.</li>
	<li>Transolrali intuição do rato com o angiocateter que foi pré-carregado com o stent.</li>
	<li>Visualize o stent no angiocateter na traqueia através da incisão transcervical(Figura 3B). NOTA: A traqueia é muito fina, permitindo que o tingelo preto no stent seja visualizado através da traqueia. Use isso para confirmar a colocação correta do traqueia.</li>
	<li>Segure o stent no lugar, segurando a traqueia através da incisão transcervical com fórceps finos.</li>
	<li>Retire o angiocateter transoral, mantendo um aperto no stent com as fórceps finas. NOTA: É extremamente importante não aplicar muita força ao stent para não esmagar o lúmen quando o angiocateter é removido. No entanto, é necessária força suficiente para garantir que o stent não seja removido com o angiocateter. Um sialendoscope de 0,8 mm pode ser usado para visualizar a localização e a colocação do stent na traqueia.</li>
	<li>Feche a incisão transcervical com cola de tecido.</li>
	<li>Permita que cada rato se recupere ao seu nível de atividade original antes de colocá-lo de volta em sua gaiola.</li>
</ol>6. Preparação histológica de amostras
<ol><li>Anestésicos camundongos com anestesia inalada e camundongos sacrificam com deslocamento cervical por protocolo animal após 7, 14 ou 21 dias. NOTA: Com base na crônica do estudo, diferentes intervalos de tempo podem ser usados (por exemplo, 28, 30 dias, etc.).</li>
	<li>Posicione um mouse na plataforma cirúrgica, conforme descrito nos passos 4,4 e 4,5.</li>
	<li>Reabra a incisão do pescoço no mouse usando uma tesoura fina de íris curva.</li>
	<li>Expor a traqueia por passo 4,6.</li>
	<li>Divida a traqueia distal abaixo do nível do stent usando uma tesoura fina de íris curvada.</li>
	<li>Divida a traqueia proximal abaixo da laringe e acima do stent usando uma tesoura fina de íris curva. NOTA: É importante dividir a traqueia distal primeiro para evitar que a traqueia se retraia no tórax.</li>
	<li>Separe a traqueia dividida do esôfago posteriormente e retire a traqueia do mouse. NOTA: Os stents ainda serão mantidos dentro da traqueia do rato.</li>
	<li>Retire o stent da traqueia e conserte em 10% de formalina por 24 h.</li>
	<li>Incorporar espécimes de traqueia de camundongos fixas formais em parafina com o final distal orientado superiormente para que cortes axiais da traqueia possam ser feitos na próxima etapa.</li>
	<li>Corte 5 seções μm da traqueia de camundongo sinfina-encaixada com um microtome. NOTA: Os espécimes devem ser cortados axially a partir da traqueia distal.</li>
	<li>Obter uma seção representativa de 5 μm a cada 250 μm ao longo do comprimento do espécime.</li>
	<li>Complete a mancha de H&E em cada seção representativa.<ol>
<li>Deparaffinize os slides, colocando em xileno 2x por slide por 3 min.</li>
		<li>Coloque os slides em 100% de etanol por 2 min, 95% de etanol para 2 min e 70% de etanol para 2 min para reidratar.</li>
		<li>Lave os slides com água da torneira corrente por 2 min.</li>
		<li>Manchar os slides em hematoxilina para 3-5 min.</li>
		<li>Lave os slides com água da torneira corrente por 5 min.</li>
		<li>Coloque os slides em 1% de álcool ácido por 1 min.</li>
		<li>Lave os slides com água da torneira corrente por 1 min.</li>
		<li>Enxágüe em 0,2% de água de amônia para 30 s.</li>
		<li>Lave os toboáguas na água da torneira corrente por 5 minutos. Mergulhe em 95% de etanol 10x.</li>
		<li>Mancha de eosina, colocando slide em eosin a fagotina por 30 s.</li>
		<li>Desidratar os slides, colocando em 95% de etanol por 5 min, seguido pelo etanol absoluto 2x para 5 min.</li>
		<li>Coloque em xileno 2x por 5 min.</li>
		<li>Monte os slides com médio de montagem à base de xileno.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medir a espessura da propria lamina como descrito em Hillel et al.8.</li>
</ol>7. Biocompatibilidade stent in vivo
<ol><li>Prepare seções de tecido saem dos passos 6,1-6,4. Não retire o stent dessas seções traqueais, a fim de visualizar as mudanças na inflamação em relação à localização do stent dentro do lumen da traqueia.<ol>
<li>Para determinar a resposta aguda do corpo estranho ao stent, observe a atividade do macrófago e da pilha de T usando marcadores CD3 e De F4/80. NOTA: Outros marcadores também podem ser usados para determinar a reação inflamatória aguda ao stent.</li>
		<li>Obtenha 5 seções de corte μm da traqueia embutida de parafina em lâminas hidrofílicas comercialmente disponíveis (Tabela de Materiais). Coloque duas seções em cada slide. NOTA: Estas seções devem ser de uma área da traqueia onde o stent PLLA-PCL foi colocado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque os slides em xileno 2x para 5 min cada.</li>
	<li>Coloque os slides em 100% de etanol 2x para 3 min cada.</li>
	<li>Coloque os slides em 95% de etanol por 1 min.</li>
	<li>Coloque os slides em um rack de coloração histológica para que eles sejam imersos em buffer de recuperação de antígeno(Mesa de Materiais)e, em seguida, coloque em um navio vegetal com água fervente por 20 min.</li>
	<li>Retire as prateleiras de coloração do navio e descarte o buffer de recuperação de antígeno.</li>
	<li>Substitua o buffer por 1 mL de PBS.</li>
	<li>Coloque os slides em uma caixa de coloração molhada por 1 min.</li>
	<li>Descarte o PBS e incubar os slides com o meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) com 10% FBS por 30 min.</li>
	<li>Descarte o DMEM e adicione uma mistura de dois anticorpos primários criados em espécies diferentes. Cubra os slides com filme de parafina e incubar durante a noite em 4 °C em um quarto escuro. NOTA: Neste protocolo coelho anti-CD3 e rato anti-F4/80(Tabela de Materiais)foram utilizados.</li>
	<li>Lave os slides em PBS 3x por 5 min.</li>
	<li>Incubar os slides com anticorpos secundários específicos para as espécies primárias de anticorpos(Tabela de Materiais)diluídos em DMEM com 10% FBS por 0,5 a 1 h à temperatura ambiente no escuro.</li>
	<li>Lave os slides em PBS 3x por 5 min no escuro.</li>
	<li>Monte os slides em coverslips com uma gota de montagem médio com 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Guarde os slides no escuro a 20 °C ou 4 °C.</li>
	<li>Observe os slides manchados em um microscópio confocal de varredura a laser e fotografia.</li>
	<li>Quantificar o número total de células de coloração com DAPI e anticorpos de interesse para comparação com traqueia ilesa.</li>
</ol>8. Análise quantitativa da expressão do gene da traquea do rato
<ol><li>Coletar traqueia de camundongo, como descrito nos passos 6,1-6,7 e remover stent. NOTA: As traqueias de camundongos colhidas podem ser armazenadas em um freezer de -80 °C por até 2 anos.</li>
	<li>Dessecado o tecido traqueador colhido na etapa 8.1 usando tesoura fina e homogeneizar ainda mais usando um homogeneizador de moinho de contas com contas cerâmicas de 1,4 mm(Mesa de Materiais)como parte de um kit de extração de RNA(Tabela de Materiais)comercialmente disponível em colunas. NOTA: Configurações de homogeneizador do moinho de contas = um ciclo de 40 s a 6 m/s.</li>
	<li>Extraia RNA do lysate traqueal usando um kit de extração e purificação baseado em coluna(Tabela de Materiais)seguindo as instruções do fabricante.</li>
	<li>Quantificar rna de cada amostra usando um espectrômetro(Tabela de Materiais). NOTA: A pureza do RNA é avaliada usando a relação 260/230 nm com uma leitura pura da amostra do RNA 2.0.</li>
	<li>Crie DNA complementar a partir de RNA extraído usando transcriptase reversa(Tabela de Materiais)e um termociclo com as seguintes configurações: 5 min a 25 °C (priming), 46 °C para 30 min (transcrição reversa) e, em seguida, 95 °C para 1 min (inativação de transcrição reversa).</li>
	<li>Diluir amostras complementares de DNA com água livre de RNase a uma concentração de 10 a 25 ng/mL para uso em PCR quantitativo em tempo real.</li>
	<li>Misture 1 μL do DNA complementar (10-25 ng/mL) com 10 μL de um mastermix PCR (Tabela de Materiais), 8 μL de ddH2O e 0,5 μL de 10 μM primers para a frente e reversa para o gene de interesse em um poço de uma placa PCR de 96 poços ( Tabelade Materiais). NOTA: O volume total em cada poço deve ser de 20 μL. Cada poço na placa de 96 poços deve conter apenas uma amostra e um gene de interesse.</li>
	<li>Repita os passos 8.1-8.7 para todos os genes de interesse e execute cada amostra para cada gene em triplicado. NOTA: As cartilhas para a frente e reversa específicas do gene(Tabela de Materiais)para colágeno 1, colágeno 3 e o gene de referência β-actina são comumente usadas para investigar marcadores de fibrose.</li>
	<li>Coloque a placa de 96 poços na máquina de PCR quantitativa em tempo real e inicie o seguinte protocolo: desnaturação a 95 °C para 15 s e anneal e se estenda a 60 °C para 60 s por 40 ciclos.</li>
	<li>Normalize o valor limite do ciclo (TC) para detecção de produtos genéticos de cada gene de interesse (GOI) para o valor de TC para o gene de referência β-actin para todas as amostras para obter um ΔCT para cada GOI. Em seguida, compare os valores δct para cada GOI para amostras tratadas e não tratadas para gerar um ΔΔCT. NOTA: O limite de ciclo é o ponto na curva de amplificação quando uma quantidade predeterminada de produto genético está presente (ΔRn). O valor de ΔRn para cada reação deve ser determinado para cada gene do interesse e deve cair na parcela linear da curva da amplificação. NOTA: ΔCT = CT (GOI) - CT (gene de referência); ΔΔCT = ΔCT (tratado) - ΔCT (não tratada).</li>
	<li>Calcule a mudança relativa na expressão gênica entre amostras tratadas e não tratadas como uma expressão de mudança de dobra, calculando 2ΔΔCT.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Os passos mais críticos para construir e usar com sucesso um stent de luta contra drogas in vivo são 1) determinar a relação PLLA-PCL ideal para a taxa de elução de drogas desejável, 2) determinando a concentração adequada de drogas a ser eluted, 3) moldando os stents em torno do angiocateter para uso in vivo, e 4) transolvialmente entregando o stent para os ratos após a indução LTS sem causar obstrução das vias aéreas fatais.
Embora existam vários métodos para o parto de medicamentos usando s...

A estenose laringotraqueatra (LTS) é um estreitamento patológico da traqueia na maioria das vezes devido a lesões iagênicas pós-intubação. A combinação de colonização bacteriana, resposta corporal estranha a uma traqueostomia ou tubo de endotraqueano e fatores específicos do paciente levam a uma resposta inflamatória aberrante. Esta resposta imune desadaptativa leva à deposição de colágeno na traqueia, resultando em estreitamento luminal da traqueia e estenose subseqüente1,2. Como o tratamento atual para esta doença é principalmente cirúrgico, o desenvolvimento de um paradigma de tratamento alternativo medicamente baseado visando as vias inflamatórias e profibrotic aberrantes que levam à deposição excessiva de colágeno tem sido estudada. Rapamicina, que inibe o complexo de sinalização mTOR, tem sido mostrado para ter efeitos imunossupressores, bem como um efeito antifibroblasto robusto. No entanto, quando a rapamicina é administrada sistemicamente, efeitos colaterais comuns (por exemplo, hiperlipidemia, anemia, trombocitoopenia) podem ser pronunciados3. O objetivo da nossa metodologia é desenvolver um veículo para a entrega local de medicamentos praticável para uso nas vias aéreas que diminuiria esses efeitos sistêmicos. Nossas avaliações se concentram em investigar a resposta imune local à construção de entrega de drogas, bem como sua capacidade de inibir a função do fibroblasto e alterar o microambiente imunológico local. Os resultados específicos da doença incluem testes in vivo que avaliam marcadores de fibrose.
Stents biodegradáveis de luta contra drogas têm sido usados em modelos animais de doença em sistemas de múltiplos órgãos, incluindo as vias aéreas4. Para a gestão da estenose das vias aéreas ou colapso, investigações anteriores têm usado silicone revestido de drogas e stents à base de níquel5. Uma construção PLLA-PCL foi escolhida para este método particular por causa de seu perfil de elução de drogas e força mecânica em condições fisiológicas durante um período de 3 semanas, o que foi demonstrado em estudos publicados anteriores6. PLLA-PCL também é um material biocompatível e biodegradável já aprovado pelo FDA4. Stents biocompatíveis que elutam cisplatina e MMC têm sido estudados em grandes modelos animais, como coelhos e cães. No entanto, nesses modelos animais, os stents não foram colocados em um modelo animal de doença e foram implantados transcervicalmente. Este estudo fornece um método original para avaliar um stent droga-eluting biocompatível colocado transorally em um modelo do rato de ferimento da via aérea e de estenose laryngotracheal. Um stent biocompatível que inviabiliza uma droga imunomodulatória localmente e pode ser miniaturizado para estudo em um modelo de urina é valioso para pesquisa pré-clínica translacional. Tentativas anteriores de utilização de stent com outras construções materiais geraram respostas robustas do corpo estranho piorando a inflamação subjacente que distingue lts7. Esta metodologia, a nosso conhecimento, é a primeira de seu tipo para estudar os efeitos imunomodulatórios e antifibrotic de um sistema stent-baseado da entrega da droga em um modelo do murine de LTS. O modelo murine em si oferece várias vantagens para estudar os efeitos de uma droga imunomodulatória na traqueia. Camundongos geneticamente modificados e coortes experimentais de camundongos saudáveis e doentes podem ser estudados, o que pode levar à reprodutibilidade experimental e melhorar a relação custo-eficácia. Além disso, a entrega do stent transoralmente na traqueia do rato imita a entrega clínica de tal stent nos seres humanos, o que destaca ainda mais a vantagem translacional deste método. Finalmente, a relativa facilidade com que o stent PLLA-PCL com a droga pode ser produzida permite modificações para fornecer terapias medicamentosas alternativas destinadas a reduzir a formação de cicatriz na traqueia.

<table><tbody><tr><td><forte>1. Para stent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22-gauge angiocatheter</td><td>Jelco</td><td>4050</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270997-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>56-81-5</td><td>Disponível em outros fornecedores também.</td></tr><tr><td>PDLGA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>739955-5G</td><td></td></tr><tr><td>PLLA-PCL (70: 30)</td><td>Evonik Industries AG</td><td>65053</td><td></td></tr><tr><td>Rapamicina</td><td>LC Laboratories</td><td>R-5000</td><td></td></tr><tr><td>2. Cirurgia animal</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escova de arame</td><td>Mill-Rose Company</td><td>320101</td><td></td></tr><tr><td><forte>3. Para coloração imuno-histoquímica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antigen retrival</td><td>buffer Abcam</td><td>ab93678</td><td>Disponível em outros fornecedores também; pH ácido necessário</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Cell Signaling</td><td>8961S</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965-092</td><td>Disponível em outros fornecedores também.</td></tr><tr><td>FBS (Soro Fetal Bovino)</td><td>MilliporeSigma</td><td>F4135-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-coelho-488</td><td>de cabra Tecnologia Lif</td><td>a11008</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-rato-633 de cabra</td><td>Tecnologia Lif</td><td>a21094</td><td></td></tr><tr><td>Hidrofílico mais</td><td>BSB7028</td><td></td><td></td>de lâminas</tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>100-10023</td><td>Disponível em outros fornecedores também.</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD3 de coelho</td><td>Abcam</td><td>ab5690</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo antiF4/80 de rato</td><td>Biolengend</td><td>123101</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 Meta Microscópio Confocal</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4. Para PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5mm contas de vidro</td><td>OMNI International</td><td>19-645</td><td></td></tr><tr><td>Bead Mill Homoginizer</td><td>OMNI International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene Specific Forward / Reverse Primers</td> Recursos <td>Genômicos Core Facility</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 espectrofotômetro</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Mini kit Green Mastermix</td><td>Life Technologies</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy</td><td>Qiagen</td><td>80404</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Sistema de PCR em Tempo Real</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

design de um stent traqueal biocompatível de droga em camundongos com estenose laringotraquena

Design of a Biocompatible Drug-Eluting Tracheal Stent in Mice with Laryngotracheal Stenosis

A estenose laringotraqueaca (LTS) é um estreitamento patológico da subglotee e traqueia, levando à obstrução extratorácica e significativa falta de ar. Lts resulta de lesão mucosa de um corpo estranho na traqueia, levando a danos nos tecidos e uma resposta inflamatória local que dá errado, levando à deposição de tecido cicatricial patológico. O tratamento para LTS é cirúrgico devido à falta de terapias médicas eficazes. O objetivo deste método é construir um stent biocompatível que pode ser miniaturizado para colocar em camundongos com LTS. Demonstramos que uma construção PLLA-PCL (70% poli-L-lactide e 30% policaprolactona) tinha força biomecânica ideal, era biocompatível, praticável para um stent de colocação in vivo e capaz de combater a droga. Este método fornece um sistema de entrega de drogas para testar vários agentes imunomodulatórios para inibir localmente a inflamação e reduzir a fibrose das vias aéreas. A fabricação dos stents leva de 28 a 30 h e pode ser reproduzida facilmente, permitindo experimentos com grandes coortes. Aqui incorporamos a droga rapamicina dentro do stent para testar sua eficácia na redução da fibrose e deposição de colágeno. Os resultados revelaram que as tendas PLLA-PCL apresentaram liberação confiável de rapamicina, eram mecanicamente estáveis em condições fisiológicas e eram biocompatíveis, induzindo pouca resposta inflamatória na traqueia. Além disso, os stents PLLA-PCL que eluting à rapamicina reduziram a formação de cicatrizes na traqueia in vivo.

A construção biodegradável do stent PLLA-PCL carregada com rapamicina utilizada neste estudo foi capaz de dialoar a rapamicina de forma consistente e previsível em condições fisiológicas (Figura 1). A figura 2 mostra o stent PLLA-PCL lançado em torno de um angiocateter 22 G para uso em um modelo de urina de LTS. Para determinar se os efeitos da elução da rapamicina na traqueia são eficazes na fibrose atenuante, alterações medidas na expressão gênica relacionada ...

A estenose de laringotracura resulta da deposição patológica da cicatriz que estreita crìtica a via aérea do traqueal e falta terapias médicas eficazes. Usando um stent PLLA-PCL (70% poli-L-lactide e 30% policaprolactona) como um sistema local de entrega de drogas, terapias potenciais destinadas a diminuir a proliferação de cicatrizna traqueia podem ser estudadas.

Design de um stent traqueal biocompatível de droga em camundongos com estenose laringotraquena

Laryngotracheal stenosis (LTS) is a pathologic narrowing of the subglottis and trachea leading to extrathoracic obstruction and significant shortness of ...

Este protocolo nos permite investigar stents que elugem de drogas em um pequeno modelo animal de estenose laringotraqueal, permitindo-nos aproveitar animais geneticamente modificados de forma econômica. A colocação transoral do stent das vias aéreas que eluia de drogas poupa os animais de uma incisão aberta na traqueia representando um modelo mais clinicamente relevante de estenose laringotraqueal. Esta técnica facilita a investigação pré-clínica das estratégias locais de entrega de medicamentos para tratar a estenose laringotraqueal.Esta técnica fornece uma plataforma viável e eficaz para a investigação translacional de stents de vias aéreas que eluem drogas em um pequeno modelo animal que pode ser aplicado para investigação futura em modelos animais maiores, bem como aplicação clínica. técnica particularmente a intubação transoral, indução de lesão traqueia, e a etapa de colocação do stent das vias aéreas. A demonstração visual desta cirurgia tecnicamente desafiadora é crítica, pois muitos dos detalhes finos não podem ser totalmente descritos em palavras.Para fazer uma solução de 1%rapamicina contendo polímero, adicione seis miligramas de rapamicina a 600 miligramas de 70-30 PLLA-PCL em um frasco de vidro. Sob um capô de fumaça, adicione seis mililitros de diclorometano ao frasco de rapamicina suplementado e controle e adicione 120 microliters de glicerol a cada frasco. Em seguida, tampe os frascos e deixe a solução PLLA-PCL homogeneizar por seis a 12 horas em temperatura ambiente.Para criar um stent das vias aéreas murinas, utilizando materiais estéreis e técnica, aplique um mililitro de solução PLLA-PCL suplementada de rapamicina na cânula venosa de um angiocateter à base de etileno fluorado de 22 bitolas enquanto retarda a rotação do cateter. Quando toda a solução tiver sido aplicada, apoie o angiocateter moldado com a ponta do angiocateter voltado para baixo e o punho do cateter na borda de uma placa de vidro Petri em uma capa de vácuo. Após 24 horas sob vácuo à temperatura ambiente, torça suavemente e deslize o cateter a partir da construção do stent seco e verifique circunferencialmente o stent quanto a quaisquer defeitos que possam ter resultado durante o processo de fundição.Para ajudar na visualização, é útil desenhar uma linha preta fina pelo comprimento do stent. Corte cada extremidade dos stents fundidos com uma tesoura reta fina para que as bordas sejam axiais e use a tesoura para cortar cada stent em segmentos axial de três milímetros. Em seguida, carregue cada stent de três milímetros em um novo cateter venoso calibre 22.Para indução de estenose laringotraqueal, depois de confirmar a falta de resposta ao dedo do pé, coloque o primeiro mouse em uma plataforma cirúrgica na posição supina e dê um loop de um pequeno pedaço de rosca afixado no topo da plataforma em torno dos incisivos centrais. Fixar os membros na mesa com fita adesiva e fazer uma incisão vertical de 1,5 centímetros no pescoço do mouse. Divida o timo sobrelado e lateralize os dois lóbulos resultantes para visualizar a traqueia.Divida os músculos esternonióides e esternotireóides no apego superior bilateralmente e passe um angiocateter de 22 bitola transorly através da laringe na traqueia. Utilizando pequenas fórceps, aplique pressão na laringe anterior do mouse para auxiliar na colocação correta do cateter. Um angiocateter corretamente colocado pode ser visualizado por sua cor branca através da traqueia.Para induzir a lesão, passe uma escova de arame revestida de Bleomycin através do angiocateter inserido e retire lentamente o cateter para que apenas a escova de arame permaneça dentro da traqueia. Usando fórceps finos, aplique contrapressão na traqueia para interromper mecanicamente o lúmen traqueal com a escova antes de reinserir o cateter na traqueia sobre a escova. Remova a escova de arame e reaplique a Bleomycin antes de inserir e remover a escova mais quatro vezes, como apenas demonstrado.Após a última aplicação de Bleomimicina, remova o cateter da traqueia. Para a colocação transoral de um PLLA-PCL, certifique-se de que uma linha vertical preta fina tenha sido incorporada em cada stent e entubar transorally o mouse com o angiocateter pré-carregado. O stent deve ser visualizado dentro da traqueia através da incisão transcervical.Quando o stent estiver no lugar, use fórceps finos para segurar firmemente, mas suavemente a traqueia através da incisão para manter o stent no lugar e remover o cateter. É fundamental colocar o stent o mais cuidadosamente possível. Muita pressão sobre a traqueia resultará no colapso do stent causando obstrução das vias aéreas e morte ao animal.Feche a incisão com cola tecidual ou suturas cromicas absorvíveis 4-0 usadas aqui e permita que o rato se recupere com monitoramento antes de devolver o animal à gaiola de origem. No ponto final experimental apropriado, coloque o mouse de interesse na posição supina na plataforma cirúrgica e use uma tesoura de íris curva fina para reabrir a incisão. Exponha a traqueia como demonstrado e use a tesoura para dividir a traqueia distal abaixo do nível do stent.Em seguida, divida a traqueia proximal abaixo da laringe e acima do stent e separe a traqueia dividida do esôfago posteriormente. Em seguida, remova o stent da traqueia e fixe a traqueia em 10% de formalina por 24 horas. A construção de stent PLLA-PCL carregado biodegradável utilizada neste estudo é capaz de eluir a rapamicina de forma consistente e previsível em condições fisiológicas.Nesta imagem, o stent biocompatível miniaturizado pode ser observado in situ dentro da traqueia, conforme indicado pelo marcador preto no stent visualizado através da traqueia translúcida do rato. Após 21 dias, o marcador de corante preto pode ser usado para confirmar a manutenção da posição do stent dentro da traqueia. Testes de biocompatibilidade utilizando coloração imunofluorescente para marcadores de inflamação aguda e crônica demonstram que o edifício de stent PLLA-PCL não é imunoreactive, conforme determinado pelo número mínimo de células imunes presentes após a colocação na ausência de lesão.Manipular as vias aéreas de forma delicada e atraumática é fundamental para o sucesso do procedimento. Força excessiva, múltiplas intubações e colapso do stent podem levar à morte de animais. Após o tratamento com stent de eluição de rapamicina, avaliação da sobrevivência, expressão genética via PCR quantitativo em tempo real, imunoensatórios incluindo citometria de fluxo, ELISA e imunohistoquímica podem ser realizados.Como fornece uma plataforma de sucesso para a elução de medicamentos em um modelo de camundongo, esta técnica abre caminho para futuras investigações de terapêuticas aplicadas localmente em estenose laringotraqueal. Diclorometano é um líquido corrosivo. Certifique-se de sempre usar um capô de fumaça, equipamentos de proteção individual e materiais não corrosivos

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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Heterotópico e Transplante ortotópico traqueal em ratos usados ​​como modelos para estudar o desenvolvimento de doenças das vias aéreas obliterante

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Ferromagnético Bare Metal Stent para captura de células endoteliais e Retenção

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