Name: Controlando as velocidades de fluxo de fluidos ativos 3D baseados em microtúbulos usando temperatura (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Aprenda a controlar velocidades de fluxo em fluidos ativos 3D baseados em microtúbulos usando temperatura. Este método permite regulação in situ sem modificar o fluido ativo ou o microscópio.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Plasmid K401-BCCP-H6 foi um presente do Dr. Zvonimir Dogic. Esta pesquisa foi apoiada pelo fundo start-up do Dr. Kun-Ta Wu no Worcester Polytechnic Institute. Agradecemos ao Dr. Zvonimir Dogic pelos protocolos para purificar e rotular a tubulina e sintetizar fluidos ativos. Somos gratos ao Dr. Marc Ridilla por sua experiência em expressão e purificação de proteínas. Agradecemos ao Dr. William Benjamin Roger por nos ajudar na construção do estágio de temperatura controlada. Reconhecemos Brandeis MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) para uso da Unidade de Materiais Biológicos (BMF). Reconhecemos a Royal Society of Chemistry para adaptar os números de Bate et al. em Soft Matter33.

Os autores não têm nada a divulgar.

Controlar a matéria ativa in situ abre a porta para a auto-organização direcionada da matéria ativa4,5,24,28,54. Neste artigo, apresentamos um protocolo para o uso da temperatura para controlar os fluidos ativos in situ baseados em quinesina e MT, com base na característica arrhenius do sistema29,30,<s...

A matéria ativa é diferenciada da matéria passiva convencional devido à sua capacidade de converter energia química em trabalho mecânico. Um material que possui tal capacidade pode consistir em entidades vivas ou não vivas, como bactérias, insetos, coloides, grãos e filamentos citoesqueléticos1,2,3,4,5,7,8,9,10. Essas entidades materiais interagem com seus vizinhos. Em maior escala, eles se auto-organizam em vórtices turbulentos (turbulência ativa) ou fluxos materiais11,12,13,14,15,16,18,19,20. Uma compreensão da auto-organização da matéria ativa levou a várias aplicações em ônibus moleculares, dispositivos ópticos e computação paralela21,22,23. Para trazer aplicativos para o próximo nível requer controle além da auto-organização. Por exemplo, Palacci et al. desenvolveram um coloide hematita encapsulado que se autopropelia apenas quando exposto à luz azul controlada manualmente, o que levou ao surgimento de cristais vivos24. Morin et al. estabeleceram o controle dos coloides quincke rolando usando um campo elétrico externo tunable, resultando em coloidal reunindo-se em uma pista de corrida como canal25. Esses trabalhos anteriores demonstram o papel do controle local nas aplicações e promovem a base de conhecimento da matéria ativa.
Neste artigo, nos concentramos na controlabilidade dos fluidos ativos 3D baseados em quinesina, microtubule (MT). Os fluidos consistem em três componentes principais: MTs, motores moleculares de cinese e depletantes. Os depletantes induzem uma força de esgotamento para agrupar as MTs, que mais tarde são superadas por aglomerados de motores. Estes motores andam ao longo do MTstoward a extremidade mais. Quando um par de MTsis ponte anti-paralelo, os motores correspondentes andar em direções opostas. No entanto, os motores estão ligados em um cluster e são incapazes de se afastar, então eles deslizam cooperativamente pares de MTs (deslizamento de interfilamento, Figura 1A). Estas dinâmicas deslizantes se acumulam, fazendo com que os feixes de MTsto se estendem até atingir seu ponto de instabilidade e quebra (pacotes extensile, Figura 1B)26. Os feixes quebrados são annealed pela força do esgotamento, que estende subseqüentemente outra vez, e a dinâmica repete. Durante o processo de dinâmica de repetição, os movimentos do feixe agitam o líquido próximo, induzindo fluxos que podem ser visualizados pelo doping com traçadores em escala de mícron (Figura 1C). Sanchez et al. e Henkin et al. caracterizaram as velocidades médias dos traçadores, descobrindo que as velocidades eram tunable variando as concentrações de triphosfato de adenosina (ATP), depletantes, clusters motores e MTs19,27. No entanto, essa tunabilidade existia apenas antes da síntese de fluidos ativos. Após a síntese, a tunability foi perdida, e os líquidos auto-organizados em sua própria maneira. Para controlar a atividade do fluido ativo após a síntese, Ross.et al. relatou um método usando a imersão ativada pela luz das proteínas motoras, permitindo que a atividade fluida fosse ajustada e desligasse usando a luz28. Enquanto o controle de luz é conveniente em termos de ativar localmente os fluidos, o método requer redesenhar as estruturas de proteínas motoras, juntamente com a modificação dos caminhos ópticos em um microscópio. Aqui, fornecemos um método fácil de usar para controlar localmente os fluxos de fluidos sem modificação do microscópio, mantendo a estrutura motora intacta.
Nosso método de ajuste local do fluxo de fluido ativo é baseado na lei Arrhenius porque a reação kinesin-MT tem sido relatado para aumentar com a temperatura29,30,31,32. Nossos estudos anteriores mostraram que a dependência de temperatura da velocidade média de um fluxo de fluido ativo seguiu a equação de Arrhenius: v = A exp (-Ea/RT), onde A é um fator pré-exponencial, R é a constante de gás, Ea é a energia de ativação, e T é a temperatura do sistema33. Portanto, a atividade fluida é sensível ao ambiente de temperatura, e a temperatura do sistema precisa ser consistente para estabilizar o desempenho do motor e, consequentemente, a velocidade de fluxo defluido34. Neste artigo, demonstramos o uso da dependência de temperatura do motor para ajustar continuamente as velocidades de fluxo de fluidos ativos, ajustando a temperatura do sistema. Também demonstramos a preparação de uma amostra de fluido ativo, seguida pela montagem da amostra em um estágio de microscópio cuja temperatura é controlada através de software de computador. Aumentar a temperatura de 16 °C para 36 °C acelera as velocidades médias de fluxo de 4 para 8 μm/s. Além disso, a tunabilidade é reversível: aumentar e diminuir repetidamente a temperatura acelera sequencialmente e desacelera o fluxo. O método demonstrado é aplicável a uma ampla gama de sistemas onde as principais reações obedecem à lei Arrhenius, como o ensaio de deslizamento mt29,30,31,32.

<table><tbody><tr><td>(&plusmn;)-Ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238813</td><td>Trolox</td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>metacrilato de 3-(trimetoxissilil)propil, 98%, ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC216550050</td><td></td></tr><tr><td>3,2 mm I.D. Tygon Tubing R-3603</td><td>HACH</td><td>2074038</td><td>Tubos de água</td></tr><tr><td>31,75 mm de diâmetro não revestidos, janela de safira</td><td>Edmund Optics</td><td>43-637</td><td>Disco de safira</td></tr><tr><td>3M 1181 Fita de Cobre - 1/2 IN Largura X 18 YD Comprimento - 2.6 MIL Espessura Total - 27551</td><td>R.S. HUGHES</td><td>054007-27551</td><td>Fita de Cobre</td></tr><tr><td>Ácido Acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Acrilamida (40%/Eletroforese), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1402-1</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5'-trifosfato dipotássico sal hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td>ATP</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Éster Succinimidílico)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A20006</td><td>Corante fluorescente vermelho distante. Alexa 647 pode ser pré-suspenso em dimetilsulfóxido (DMSO) antes de ser misturado com microtúbulos (1.3.3.2.)</td></tr><tr><td>Unidade de Filtro Centrífugo Amicon Ultra-4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>UFC801024</td><td>Tubo de filtro centrífugo. Peso molecular de corte: 10 kDa</td></tr><tr><td>Persulfato de Amônio, 100g, MP Biomedicals</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN802829</td><td>APS</td></tr><tr><td>Ampicilina de Sódio Sal (Pó Cristalino), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760</td><td>Ampicilina</td></tr><tr><td>Antivibração Mesa</td><td>Nikon</td><td>63-7590S</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-E Centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>369001</td><td></td></tr><tr><td>Agente Soldificante de Ágar Bacto, BD Diagnostics</td><td>VWR</td><td>90000-760</td><td>Ágar</td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Alfa Aesar</td><td>A14207</td><td></td></tr><tr><td>Balde-plástico branco - 2 galões</td><td>Balde de água</td><td>Bon</td><td>84-715</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746495</td><td>CaCl2</td></tr><tr><td>Catalase de fígado bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>CFI Plan Apo Lambda 4x Obj</td><td>Nikon</td><td>MRD00045</td><td>4x air objective</td></tr><tr><td>C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift</td><td>Nikon</td><td>96372</td><td>GFP cubo de filtro</td></tr><tr><td>CH-109-1.4-1.5</td><td>TE Technology</td><td>CH-109-1.4-1.5</td><td>Thermoelectric Cooler (TEC)</td></tr><tr><td>Cloranfenicol, 98%, ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Bloco de resfriamento</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Alumínio fresado personalizado</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400</td><td>Bio-Rad</td><td>1610400</td><td>Corante Trifenilmetano</td></tr><tr><td>D-(+)-Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sulfóxido (Certificado ACS), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>DL-1,4-Ditiotreitol, 99%, para bioquímica, ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC165680050</td><td>DTT</td></tr><tr><td>DOWSIL 340 Composto de dissipador de calor</td><td>Dow</td><td>1446622</td><td>pasta térmica</td></tr><tr><td>ÁLCOOL ETÍLICO, 200 PROOF ACS/USP/NF GRAU 5 GALÕES POLY CUBE</td><td>Pharmco by Greenfield Global</td><td>111000200CB05</td><td>Etanol</td></tr><tr><td>Etilenoglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N',N'-ácido tetracético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td>EGTA</td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>798681</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Triptona</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421</td><td>Triptona</td></tr><tr><td>Fisher BioReagents Microbiologia Media Additives: Extrato de Levedura</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422</td><td>Extrato de levedura</td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG Microspheres, Grau de Calibração 3.00 &micro; m</td><td>Polysciences</td><td>18861</td><td>Partículas traçadoras</td></tr><tr><td>Glicose Oxidase de Aspergillus niger</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>GpCpp</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-405L</td><td>Guanosina-5'[ (&alpha;,&beta;)-metileno]trifosfato (GMPCPP)</td></tr><tr><td>GS Power's 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 pés, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable para Carro, Áudio, Home Theater</td><td>Amazon</td><td>B07428NBCW</td><td>Fio de cobre</td></tr><tr><td>Guanosina 5'-trifosfato sal de sódio hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td>GTP</td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z805939</td><td>Detergente</td></tr><tr><td>HEPES Sal de Sódio (Pó Branco), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP410</td><td>NaHEPES</td></tr><tr><td>Máquina liquidificadora de alto desempenho</td><td>AIMORES</td><td>AS-UP1250</td><td>Liquidificador</td></tr><tr><td>His GraviTrap</td><td>GE Healthcare</td><td>11003399</td><td>Gravity Column</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td>Isopropil &beta;-D-1-tiogalactopiranosídeo</td></tr><tr><td>Álcool Isopropílico 99%</td> <td>Pharmco por Greenfield Global</td><td>231000099</td><td>Isopropanol</td></tr><tr><td>JA-10 rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>369687</td><td></td></tr><tr><td>ácido L-glutâmico sal de potássio monohidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td>K-Glutamato</td></tr><tr><td>Lisozima de clara de ovo de galinha</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>MgCl2&bull; </td></tr><tr><td>Sal de sódio</td> 6H2O MES <td>Sigma-Aldrich</td><td>M5057</td><td>Sal de sódio de ácido 2- (N-morfolino) etanossulfônico</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td>Ácido 3- (N-morfolino) propanossulfônico</td></tr><tr><td>MP-3022</td><td>TE Tecnologia</td><td>MP-3022</td><td>Termopar</td></tr><tr><td>N, N, N ', N'-Tetrametiletilenodiamina 99%, ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC138450500</td><td>TEMED</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000c UV-VIS Espectrofotômetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E112352</td><td>Espectrômetro</td></tr><tr><td>Nikon Ti2-E Nikon Microscópio Invertido</td><td>Nikon</td><td>MEA54000</td><td></td></tr><tr><td>Norland Adesivo Óptico 81</td><td>Norland Products</td><td>NOA81</td><td>Cola UV</td></tr><tr><td>Novex Sharp Padrão de Proteína Pré-corada</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC5800</td><td>Escada padrão de proteína</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0335BOX</td><td>SDS gel</td></tr><tr><td>Ultracentrífuga Optima L-90K</td><td>Beckman Coulter</td><td>365672</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm PM996 Wrap, 4" de Largura; 125 Ft/Roll</td> Filme de <td>cera</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06720-40</td></tr><tr><td>Pe 300 ultra Sistema de Iluminação Banda Única, 3mm Controle de Guia de Luz Fonte de alimentação Pod</td><td>Nikon</td><td>PE-300-UT-L-SB-40</td><td>Cool LED Iluminador</td></tr><tr><td>Fluoreto de fenilmetanossulfonil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78830</td><td>PMSF</td></tr><tr><td>Sal monopotássico de ácido fosfoenolpirúvico, 99%</td> <td>BeanTown Chemical</td><td>129745</td><td>PEP</td></tr><tr><td>Pierce Coomassie (Bradford) Kit de ensaio de proteína</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23200</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de protease Pierce Mini comprimidos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32953</td><td></td></tr><tr><td>CACHIMBOS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td>1,4-Piperazinadietanossulfônico</td></tr><tr><td>Ácido Plurônico F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Poli (etilenoglicol)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>81300</td><td>PEG. Peso molecular médio 20.000 Da</td></tr><tr><td>Hidróxido de Potássio (Pellets/ACS Certificado), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-500</td><td>KOH</td></tr><tr><td>PowerEase 300W Fonte de alimentação (115 VAC)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PS0300</td><td>Fonte de alimentação DC da caixa de gel</td></tr><tr><td>PS-12-8.4A</td><td>TE Technology</td><td>PS-12-8.4A</td><td>Fonte de alimentação DC do controlador</td></tr> <tr><td>de temperaturaEnzimas piruvato quinase / lactic desidrogenase do músculo de coelho</td> Bomba de fonte <td>Sigma-Aldrich</td><td>P-0294</td><td>PK / LDH</td></tr><tr><td>Quiet One Lifegard, 296 galões por hora</td><td>Bomba de</td> tanque <td>de</td><td>peixes</td>Amazon B005JWA612</tr><tr><td>Rosetta 2(DE3)pLysS Células competentes - Novagen</td><td>Millipore Sigma</td><td>71403</td><td>Células competentes</td></tr><tr><td>Forno de micro-ondas de bancada Sharp ZSMC0912BS Sharp 900W, 0,9 pés cúbicos, aço inoxidável</td><td>Amazon</td><td>B01MT6JZMR</td><td>Microondas para ferver a água</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (ACS cristalino / certificado), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>SDS</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8282</td><td>NaH2PO4</td></tr><tr><td>Proteína de estreptavidina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21122</td><td></td></tr><tr><td>Sucarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>TC-720</td><td>TE Technology</td><td>TC-720</td><td>Controlador de temperatura</td></tr><tr><td>Tris Base, Grau de Biologia Molecular - CAS 77-86-1 - Calbiochem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>648310</td><td>Tris-HCL</td></tr><tr><td>Tipo 45 Ti rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>339160</td><td></td></tr><tr><td>Tipo 70 Ti rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td>337922</tr><tr><td>Rotor tipo 70.1 Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td>342184</td><td></td></tr><tr><td>VWR Fita de rotulagem de laboratório de uso geral</td><td>VWR</td><td>89097-916</td><td>Fitas de papel</td></tr><tr><td>VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td>Lamínulas de vidro</td></tr><tr><td>VWR Micro slides lisos e foscos, Premium</td><td>VWR</td><td>75799-268</td><td>Slides de vidro</td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EI0001</td><td>Caixa de gel</td></tr><tr><td>ZYLA 5.5 USB3.0 Câmera</td><td>Nikon</td><td>ZYLA5.5-USB3</td><td>Câmera CCD monocromática</td></tr></tbody></table>

controlando as velocidades de fluxo de fluidos ativos 3d baseados em microtúbulos usando temperatura

Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature

Apresentamos um método para usar a temperatura para ajustar as velocidades de fluxo de fluidos ativos tridimensionais (3D) orientados por quineinas, à base de microtúbulos. Este método permite ajustar as velocidades in situ sem a necessidade de fabricar novas amostras para atingir diferentes velocidades desejadas. Além disso, este método permite o controle dinâmico da velocidade. Andar de bicicleta a temperatura leva os fluidos a fluir rápido e lento, periodicamente. Essa controlabilidade é baseada na característica de Arrhenius da reação kinesin-microtubule, demonstrando uma faixa de velocidade de fluxo média controlada de 4-8 μm/s. O método apresentado abrirá a porta para o projeto de dispositivos microfluídicos onde as taxas de fluxo no canal são localmente tunable sem a necessidade de uma válvula.

Preparar os fluidos ativos orientados por quinesinas e MT requer ciinina e MTs. As MTs foram polimerizadas de tubulins rotuladas (etapas 1.3 e 1.4) que foram purificadas dos cérebros bovinos (passo 1.1, Figura 2A),seguidos de reciclagem para aumentar a pureza (passo 1.2, Figura 2B). As proteínas motoras de cinese foram expressas e purificadas de E. coli (passos 2.1 e 2.2, Figura 2B<...

O objetivo deste protocolo é usar a temperatura para controlar as velocidades de fluxo de fluidos ativos tridimensionais. A vantagem deste método não só permite regular as velocidades de fluxo in situ, mas também permite o controle dinâmico, como ajustar periodicamente as velocidades de fluxo para cima e para baixo.

Controlando as velocidades de fluxo de fluidos ativos 3D baseados em microtúbulos usando temperatura

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method ...

A matéria ativa tem sido usada em várias aplicações, como sombras moleculares. Para levar a aplicação ao próximo nível, precisamos desenvolver a capacidade de controlar a questão ativa localmente. Fornecemos um método fácil de usar que não requer modificação do fluido ativo.Nem a necessidade de modificar o caminho óptico do microscópio para alcançar o controle local do fluido ativo. Nosso método pode ser aplicado a uma ampla gama de sistemas onde as principais reações obedecem à lei errônea, como o ensaio de deslizamento de microtúbulos ou sistemas baseados em enzimas. A configuração envolve um sistema de circulação de água.Se ocorrerem vazamentos, a água pode danificar o microscópio. Portanto, antes de adotar nosso protocolo, é importante garantir que o sistema esteja livre de vazamentos. Nosso protocolo requer a montagem da amostra de vidro em um estágio de temperatura.Embora o manuscrito descreva o procedimento de montagem, ele carece de sutilezas mecânicas, como fixar a amostra ao estágio. Demonstrando o procedimento, estarão Teagan Bate, Edward Jarvis e Megan Varney. Teagan e Edward são estudantes de pós-graduação, e Megan é uma estudante de graduação de um laboratório.Para preparar fluidos ativos em um tubo Eppendorf, misture 16 pontos sete microliters de oito miligramas por microtúbulos mililitros com seis pontos sete microliters de um ponto oito aglomerados motores de cinesina micromolar, e um ponto um microliters de 500 mililitros DTT em M2B de alto sal. Microtúbulos de feixe adicionando 11 pontos quatro microliters de sete por cento de peso por peso polietileno glicol. Em seguida, ative os motores de quinase adicionando dois ponteiros de oito microlitadores de 50 mililitros ATP.Mantenha as concentrações da ATP adicionando dois pontos oito microliters de piramato de estoque kinase/lactato desidrogenase, e 13 pontos três microliters de 200 milimônios piruvanato de fosfenol. Reduza o efeito de branqueamento fotográfico adicionando 10 microlitros de 20 milimilhas Trolox, um ponto um microlitros de três pontos cinco miligramas por catalase mililitro, um ponto um microlitros de 20 mililígras por mililitro de glicose oxidase, e um ponto um microliters de 300 miligramas por glicose mililitro. Rastreie o movimento do fluido adicionando um ponto seis microliters de zero ponto zero dois cinco por cento de volume por partículas rastreadoras de volume.Adicione M2B de sal alto para alcançar um volume total de 100 microliters. Em seguida, enxágue um slide de vidro revestido de poliacrilamida e cubra o deslizamento com água DI. Seque os copos com ar pressurizado.Coloque os óculos em uma superfície limpa e plana. Corte um canal de três milímetros de largura no filme de cera. A largura total é da mesma largura que a tampa de vidro desliza a 20 milímetros.Insira a cera entre o deslizamento e o deslizamento da tampa para formar um canal de célula de fluxo para fluido. Adere o vidro ao filme de cera colocando o complexo de cera de vidro em uma placa quente de 80 graus Celsius para derreter a cera. Durante o derretimento, pressione a tampa deslize suavemente com uma ponta de pipeta para aderir uniformemente o filme de cera às superfícies de vidro.Após a adesão, esfrie o complexo de vidro à temperatura ambiente. Carregue prontamente os fluidos ativos preparados para o canal de fluxo com a ponta da pipeta em um ângulo longe da abertura do canal e em contato com a superfície do deslizamento de vidro. Sele o canal com cola UV.Depois de construir uma configuração de controle de temperatura, coloque a amostra de fluido ativo na superfície da safira com o lado do slide entrando em contato com a superfície. Fixar o deslizamento de vidro com fita adesiva. Usando fita adesiva, conecte o ThermoSensor à superfície de deslizamento de tampa.Para montar a configuração em um estágio de microscópio, com o deslizamento de tampa voltado para os objetivos, fixe a configuração com grampos de agulha de estágio de microscópio. Ligue o controlador de temperatura e a bomba do aquário. Siga o guia do fabricante para definir a temperatura-alvo.Habilite o controle de temperatura. E registo os dados de temperatura do ThermoSensor. Imagem a amostra com um intervalo de tempo constante em uma microscopia fluorescente equipada com um cubo de filtro GFP para monitorar as partículas de rastreador rotulados Alexa 488 na mistura ativa.Ajuste o intervalo de tempo para permitir que o deslocamento do rastreador entre os quadros esteja dentro de nove pixels. Para rastreadores de imagem que se movem a 10 micrômetros por segundo, usando um objetivo de quatro vezes, recomenda-se que o intervalo de tempo seja de um a cinco segundos. Salve as imagens como arquivos TIF, nomeie os arquivos com base no número do quadro e armazene-as em uma pasta separada.Para este microtúbulo acionado por cinesina, a temperatura foi controlada a 10, 20, 30 e 40 graus Celsius. A flutuação na temperatura foi de zero ponto um a zero ponto três graus Celsius por quatro horas demonstrando a estabilidade e confiabilidade desta configuração de controle de temperatura. Os rastreadores foram imagens a cada dois segundos, o que as imagens sequenciais permitiram para rastrear trajetórias de rastreadores.As velocidades médias medidas de 20 a 36 graus Celsius, pareciam ser quase tempo independentes de zero a duas horas. Enquanto a 10 e 40 graus Celsius, as velocidades médias deterioraram-se rapidamente causadas pela despolimerização de microtúbulos abaixo de 16 graus Celsius e os aglomerados de cinesina com defeito acima de 36 graus Celsius, respectivamente. Quando as temperaturas do sistema foram alternadas entre 20 e 30 graus Celsius a cada 30 minutos, as velocidades médias dos fluidos ativos não só aceleraram e desaceleraram em conformidade, mas também responderam à mudança de temperatura em 10 segundos.Os fluidos ativos começam a funcionar mal, quando resfriados abaixo de 16 ou aquecidos acima de 36 graus. Então, ao manipular o controlador de temperatura, certifique-se de que a temperatura está entre 16 e 36 graus. A capacidade de sintonizar o fluido ativo localmente, permite direcionar a potência do fluido, como entregar cargas do ponto A ao ponto B ou desenvolver um dispositivo de microfluidez que não exija uma válvula física.A acrilamida usada para revestir vidros é uma neurotoxina que pode absorver através da pele. Use equipamentos de proteção adequados, como luvas, jalecos e óculos de segurança para minimizar o risco.

controlling-flow-speeds-microtubule-based-3d-active-fluids-using

Research

JoVE Journal

Engineering

Engenharia

Neste vídeo, descrevemos a técnica de microscopia de reflexão de interferência (IRM) para visualizar microtúbulos crescendo em uma superfície de lamínula na presença de um tampão adequado. Após a iluminação com luz incidente, a interface capulínula-buffer e a interface tampão-microtúbulo refletem a luz, que se combina para criar um padrão de interferência, permitindo a visualização de microtúbulos como imagens de alto contraste contra um fundo brilhante.

Microscopia de reflexão de interferência para visualização sem rótulos da dinâmica dos microtúbulos

A montagem e o posicionamento do fuso mitótico dependem das forças combinadas geradas pela dinâmica dos microtúbulos, proteínas motoras e reticulantes. Aqui apresentamos nossos métodos recentemente desenvolvidos nos quais o confinamento geométrico de gotículas de emulsão esférica é usado para a reconstituição de baixo para cima de fusos mitóticos básicos.

Reconstituição do Basic mitótico Fusos no esféricas Emulsão Gotas

Aqui nós apresentamos um protocolo para construir uma bomba de seringa pressão controlada para ser usado em aplicações de microfluidic. Esta bomba de seringa é feita de um corpo aditivamente manufacturado, prateleira hardware e eletrônica de código-fonte aberto. O sistema resultante é simples de construir, de baixo custo e proporciona o fluxo de fluido bem regulado para habilitar a pesquisa rápida microfluidic.

Tridimensional de impressão de materiais termoplásticos para criar automatizado bombas de seringa com controle de gabarito para aplicações microfluídicos

Este protocolo é um guia para a implementação de microscopia de reflexão de interferência em um microscópio de fluorescência padrão para imagens sem rótulo, de alto contraste e alta velocidade de microtúbulos usando ensaios de superfícies in vitro.

Implementação de microscopia de reflexão de interferência para imagens sem rótulo e alta velocidade de microtúbulos

Apresentamos um protocolo para a implementação de microscopia de reflexão de interferência e microscopia de reflexão interna-fluorescência para a imagem simultânea de microtúbulos dinâmicos e proteínas fluorescentes rotuladas como microtubulas.

Reflexão de Interferência Simultânea e Microscopia de Fluorescência De Reflexão Interna Total para Microtúbulos Dinâmicos de Imagem e Proteínas Associadas

Este estudo detalha a purificação do KIF1A(1-393LZ), membro da família das cinesinas-3, utilizando o sistema de expressão do Sf9-baculovírus. A análise in vitro de deslizamento de molécula única e multimotor desses motores purificados exibiu propriedades de motilidade robustas comparáveis aos motores do lisado de células de mamíferos. Assim, o sistema Sf9-baculovírus é passível de expressar e purificar a proteína motora de interesse.

Análise de molécula única de motores da família Sf9 superprocessiva superprocessiva cinesina-3

Apresentamos protocolos para ensaios microfluidos de filamento de actina simples, em combinação com microscopia de fluorescência, que permitem monitorar com precisão filamentos de actina individuais em tempo real, expondo-os sequencialmente a diferentes soluções proteicas.

Usando Microfluidos e Microscopia de Fluorescência para Estudar a Dinâmica de Montagem de Filamentos e Pacotes de Actin Único

Este artigo apresenta um protocolo para a formação de conjuntos de microtúbulos na forma de tatoides usando MAP65, um interlinker de microtúbulos à base de plantas, e PEG como um agente de aglomeração.

Auto-montagem de Tactóides microtúbulos

O presente protocolo descreve a cristalização de cristais de gelo microscópicos e hidratos de clatratos em dispositivos microfluídicos, possibilitando a troca líquida ao redor dos cristais formados. Isso fornece possibilidades incomparáveis para examinar o processo de cristalização e os mecanismos de ligação dos inibidores.

Uma abordagem microfluídica para o estudo da cristalização de hidratos de gelo e clatrato

Apresentamos aqui métodos para a preparação de nemática ativa a partir de microtúbulos e motores de cinesina, incluindo a preparação e construção de proteínas e o uso de poços para confinamento nemático ativo.

Formando, Confinando e Observando Nemática Ativa Baseada em Microtúbulos

Este protocolo detalha o projeto e a fabricação de um dispositivo microfluídico adequado para investigar a mecânica do polímero de microtúbulos. A síntese de técnicas de microfabricação, controle de fluxo automatizado e modelagem computacional permite um sistema flexível ideal para sondar o citoesqueleto celular in vitro.

Desenvolvimento de uma abordagem baseada em microfluídica para investigar a mecânica de polímeros de microtúbulos

Aprenda a controlar velocidades de fluxo em fluidos ativos 3D baseados em microtúbulos usando temperatura. Este método permite regulação in situ sem modificar o fluido ativo ou o microscópio.

Controlando as velocidades de fluxo de fluidos ativos 3D baseados em microtúbulos usando temperatura

Explorar mais vídeos