Um modelo de cultura de matriz-adipócito extracelular humano para estudar crosstalk metabólico de matriz e células
7 de novembro de 2019
Descrevemos um sistema de cultura in vitro de matriz extracelular em 3D que permite a dissecação dos papéis da matriz e dos adipócitos em contribuir para o fenótipo metabólico do tecido adiposo.
Nosso protocolo demonstra que o ECM pode promover a diferenciação adipogênica na ausência de mediadores adipogênicos clássicos e é o primeiro a demonstrar a regulação específica da doença do metabolismo celular pelo ECM. Nossa técnica fornece uma ferramenta para dissecar os papéis do ECM e adipócitos no metabolismo tecidual adiposo e permite o estudo do papel do ECM na regulação da homeostase tecidual. Em comparação com a cultura celular 2D padrão, nosso modelo 3D permite um exame mais robusto e dissecção de conversa cruzada entre adipócitos e ECM tecidual no contexto do diabetes tipo 2.
Recomendamos começar com amostras menores para medir o quão bem é celularizado. Tenha em mente que há variabilidade interpata em como as células crescem bem e quão bem o tecido se descelulariza. É importante observar o tecido antes e depois de cada passo para garantir que o tecido esteja se descelularizado e entender possíveis diferenças entre as amostras.
Após a obtenção de tecido adiposo visceral ou IVA da cirurgia, prepare-o para armazenamento adicionando 5-10 gramas do tecido a 15-25 mililitros de solução tampão congelante em um tubo cônico de 50 mililitros. Mergulhe completamente a amostra e armazene-a a menos 80 graus Celsius até a descelularização. Para o isolamento pré-iadipócito, coloque dois gramas de uma amostra fresca de IVA intacto em 20 mililitros de solução tipo II de colagem, em seguida, insira uma tesoura estéril no tubo e pique completamente o tecido.
Uma vez picado a um chorume fino, incuba-o na solução de colagemnase a 37 graus Celsius em um agitador orbital por 60 minutos. Após a incubação, filtre o resultante digerido através de uma malha de nylon de 100 micrômetros em um tubo cônico fresco de 50 mililitros. O digerido deve ser um líquido amarelo-laranja com viscosidade moderada e uma pequena quantidade de fios residuais de tecido não digerido.
Centrifugar a amostra a 270 vezes g por 10 minutos, remover o supernasal e resuspensar a pelota celular em dois mililitros de solução 1X RBC com uma pipeta. Incubar a solução por um minuto a 25 graus Celsius, depois adicionar 10 mililitros de 15% FBS DMEM F12 e centrifuá-la a 270 vezes g por 10 minutos. Para preparar o ECM, congele/descongele a amostra de IVA previamente congelada a 37 graus Celsius, incubando-a em um banho de água pré-aquecido por 20 minutos com agitação manual suave periódica.
Uma vez descongelado, transfira o tecido de volta para menos 80 graus Celsius por 20 minutos e repita o processo de congelamento/degelo três vezes terminando com o descongelamento. Use fórceps estéreis para transferir a amostra do IVA para um tubo cônico fresco de 50 mililitros contendo 15-25 mililitros de solução enzimática 1 certificando-se de que a amostra está totalmente imersa. Em seguida, incuba-lo durante a noite a 37 graus Celsius enquanto treme a 130 RPM.
No dia seguinte, lave a amostra três vezes com 15-25 mililitros de solução tampão de lavagem, derramando a solução após cada lavagem. Transfira a amostra para um tubo fresco de 50 mililitros com 15-25 mililitros de solução enzimática 2 e incuba-a durante a noite. Repita as lavagens com a solução de tampão de lavagem e transfira a amostra para um tubo fresco contendo 15-25 mililitros de solução de extração de solvente polar.
Incubar a amostra durante a noite enquanto treme. Após a incubação com a solução de solvente polar, é importante examinar a amostra para remoção lipídica. Se a maioria do lipídio não for removida, pode ser necessário repetir esta etapa.
Pode-se usar um tempo de incubação mais curto. Após a incubação, transfira a amostra para um tubo fresco contendo 15-25 mililitros de solução tampão de lavagem e lave a amostra três vezes no shaker. Em seguida, lave a amostra três vezes com solução de 70% de etanol, derramando o etanol após cada lavagem.
Lave a amostra uma vez com a solução de armazenamento e use fórceps estéreis para transferir para um tubo fresco contendo 15-25 mililitros de solução de armazenamento, certificando-se de imergi-la completamente. A amostra pode então ser armazenada a quatro graus Celsius por até um mês. O isopropanol e o etanol são inflamáveis e devem estar em temperatura ambiente e descartados em resíduos inflamáveis.
Qualquer resíduo humano deve ser descartado separadamente dos resíduos de risco biológico usuais. Transfira os fragmentos de ECM armazenados para poços individuais de uma placa de 24 poços com fórceps estéreis adicionando quantos fragmentos necessários para os ensaios planejados a jusante. Lave-os três vezes com 500 microlitadores de 70% de etanol em um agitador orbital, depois reidrate-os lavando-os três vezes com PBS.
Use uma tesoura estéril para cortar o ECM em fragmentos de 100 miligramas. Coloque cada fragmento em um poço de uma placa de 24 poços e incubar a placa a 25 graus Celsius por 15 minutos para permitir que o excesso de PBS extrude dos fragmentos. Em seguida, remova cuidadosamente qualquer pbs restante dos poços com uma pipeta.
Semente cada fragmento com 20 microliters de suspensão celular pré-apócito, pipetando as células diretamente para o ECM. Coloque a ponta da pipeta no ECM e expulse-a suavemente para o centro da matriz certificando-se de que a suspensão da célula não transborda e acabe na parte inferior do poço. Se a suspensão da célula transbordar do ECM, remova a ponta da pipeta daquele local e insira-a em outro lugar do ECM.
Após a semeadura celular, incubar o ECM por 40 minutos a 37 graus Celsius. Encha cada poço com 500 microliters de mídia de crescimento para cobrir os fragmentos de ECM semeados. Cultura as células a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono por 72 horas.
Após 72 horas, aspire cuidadosamente a mídia de crescimento sem perturbar o fragmento ECM. Adicione 500 microliters de mídia de diferenciação e cultura as células por 14 dias mudando a mídia a cada dois ou três dias. Verifique se há diferenciação usando microscopia leve.
As células acumularão lipídios, tornarão marrom-amarelo na cor e se tornarão mais esféricas à medida que se diferenciam. A preparação do tecido adiposo ECM, a semeadura com pré-adipócitos e a diferenciação in vitro em adipócitos maduros foram monitoradas com microscopia eletrônica de varredura que revelou a descelularização do ECM e posterior recapitulação de lipídio contendo adipócitos após a ressecação e diferenciação. A imunohistoquímica específica do ECM descelularizado mostrou manutenção da micro arquitetura de colágeno, enquanto a coloração de óleo vermelho-O de construções 3D ECM-adipócitos mostrou lipídio contendo adipócitos.
Os adipócitos diferenciados no ECM foram rastreados para genes adipogênicos utilizando PCR quantitativo em tempo real que demonstrou que esses genes são regulados nas células diferenciadas em relação a preadipócitos indiferenciados cultivados em ECM. A diferença total nos níveis de transcrição é mostrada. Quatro combinações de ECM e adipócitos de sujeitos diabéticos e não diabéticos foram submetidas a fenotipagem metabólica.
A absorção de glicose prejudicada na função lipolítica foi descoberta em construções a partir de tecidos diabéticos. É importante ressaltar que o ECM não diabético resgata a absorção de glicose estimulada pela insulina e a capacidade lipolítica em adipócitos diabéticos. A contaminação dos preadipócitos isolados, do tecido descelularizado e do ECM reseeded não é incomum.
A esterilidade deve ser mantida diligentemente em todo o protocolo.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um sistema de cultura tridimensional de adipócitos humanos em matriz extracelular que permite a exploração das interações entre a matriz e os adipócitos no metabolismo do tecido adiposo. O sistema foi projetado para aprimorar a compreensão da diferenciação adipogênica e da regulação do metabolismo celular pela MEC.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Biologia Celular
- Metabolismo
- Pesquisa em Tecido Adiposo
Contexto
- A matriz extracelular (ECM) desempenha um papel crucial na homeostase tecidual.
- Os adipócitos são reguladores-chave dos processos metabólicos no tecido adiposo.
- Os cultivos tradicionais em 2D não imitam adequadamente o ambiente in vivo.
- O diabetes tipo 2 está associado a alterações no metabolismo do tecido adiposo.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um sistema de cultura 3D para estudar as interações entre adipócitos e a MEC.
- Investigar o papel da MEC na diferenciação adipogênica.
- Explorar a regulação específica da metabolismo em doenças pela MEC.
Métodos Utilizados
- Criação de um modelo de cultura 3D de adipócitos humanos com matriz extracelular.
- Avaliação da diferenciação adipogênica na ausência de mediadores clássicos.
- Avaliação da regulação do metabolismo celular pela matriz extracelular.
- Comparação dos resultados da cultura 3D com culturas celulares 2D padrão.
Resultados Principais
- A MEC promove a diferenciação adipogênica independentemente dos mediadores tradicionais.
- Foi observada variabilidade significativa entre pacientes no crescimento celular e na descelularização do tecido.
- O modelo 3D permite um exame robusto das interações entre adipócitos e a MEC.
- Obtiveram-se insights sobre o papel da MEC na homeostase do tecido adiposo.
Conclusões
- O sistema de cultura 3D desenvolvido é uma ferramenta valiosa para o estudo do metabolismo do tecido adiposo.
- Compreender a influência da MEC sobre os adipócitos pode contribuir para a pesquisa sobre diabetes.
- São necessários estudos adicionais para explorar as implicações da variabilidade entre pacientes.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este modelo de cultura 3D de adipócitos em matriz extracelular humana preenche uma lacuna crítica na pesquisa de tecido adiposo, permitindo a análise mecanicista da comunicação metabólica entre matriz e células em um sistema humano relevante para doenças. Ele oferece valor preditivo para a validação de alvos em doenças metabólicas, demonstrando como a composição da matriz extracelular influencia diretamente a função dos adipócitos e a resposta à insulina. A plataforma permite a redução de riscos pré-clínicos ao possibilitar a comparação direta dos efeitos de matrizes extracelulares de indivíduos diabéticos e não diabéticos sobre o metabolismo celular, auxiliando em decisões de avanço ou interrupção no desenvolvimento de terapias para obesidade e diabetes tipo 2.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar a regulação mediada pela MEC da diferenciação adipogênica, independente dos mediadores clássicos da adipogênese.
- Valor Científico: Apoia a validação funcional de alvos ao demonstrar a comunicação cruzada específica da doença entre a MEC e os adipócitos em tecido adiposo humano.
- Valor Científico: Facilita a redução de riscos mecanicistas ao isolar variáveis da MEC para avaliar seu impacto direto no metabolismo celular e no acúmulo de lipídios.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera construtos tridimensionais metabolicamente ativos, adequados para avaliação quantitativa da captação de glicose e função lipolítica.
- Valor Operacional: Fornece uma plataforma padronizada e reprodutível para comparação de fontes de MEC entre fenótipos de pacientes.
- Valor Operacional: Permite o preparo escalonável de ensaios utilizando fragmentos de MEC descelularizados semeados com pré-adipócitos em formatos de placas de múltiplos poços.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mantém as características do MEC derivado de pacientes e dos adipócitos, aumentando a relevância translacional para abordagens de medicina de precisão.
- Valor Científico: Permite o estudo do papel do MEC na regulação da homeostase do tecido adiposo, associando alterações da matriz ao fenótipo metabólico.
- Valor Operacional: Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco mediante a identificação de componentes do MEC que restauram a captação de glicose estimulada por insulina em adipócitos diabéticos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O modelo se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a avaliação pré-clínica, especialmente para programas de doenças metabólicas em que a disfunção do tecido adiposo é um fator patofisiológico chave.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre o papel da MEC na diferenciação de adipócitos e na função metabólica por meio de leituras de expressão gênica e fenotípicas.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos, como acúmulo de lipídios (Oil Red-O), expressão gênica (qPCR) e função metabólica (captação de glicose, lipólise), para comparação de compostos ou condições.
- Análises: Permite a comparação paralela de quatro combinações de MEC-adipócitos (MEC diabética/não diabética com adipócitos diabéticos/não diabéticos) para reduzir os riscos em hipóteses mecanicistas.
- Pesquisa Translacional: Utiliza tecido adiposo visceral humano para manter um contexto biológico relevante à doença, desde a descoberta até a validação pré-clínica.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para o estudo das interações entre MEC e células em diversos depósitos adiposos e condições metabólicas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao revelar a regulação metabólica mediada pela MEC que não é capturada em culturas em 2D.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio de fluxos de trabalho padronizados de descelularização, ressemeadura e diferenciação.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir a identificação precoce de terapêuticas moduladoras da MEC com atividade específica para a doença.
- Impacto no Portfólio: Orienta a priorização ajustada ao risco de alvos com base na capacidade da MEC de reverter a disfunção de adipócitos diabéticos.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em manipulação de tecidos, digestão enzimática e técnicas estéreis de cultivo celular.
- Depende do acesso a tecido adiposo visceral humano e à infraestrutura associada para processamento (congelamento, centrifugação, agitação).
- Necessita padronização entre equipes para gerenciar a variabilidade entre pacientes na descelularização da matriz extracelular e no crescimento celular.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o modelo a diferentes depósitos adiposos ou tipos celulares além dos adipócitos.
- É limitado pela necessidade de manutenção meticulosa da esterilidade e monitoramento cuidadoso da remoção de lipídios durante a preparação da matriz extracelular.
