Análise de Moléculas Complexas e Suas Reações em Superfícies por meio da espectrometria de desormetria/desonização induzida por cluster
1 de março de 2020
Os clusters Neutro SO2 de baixa energia cinética (< 0,8 eV/constituinte) são usados para desorba moléculas complexas de superfície, como peptídeos ou lipídios para análise posterior por meio de espectrometria de massa usando um espectrômetro de massa armadilha de íons. Não é necessária preparação especial de amostra, e a observação em tempo real das reações é possível.
A ionização desorpção induzida por clusters SO2 neutros que chamamos de DINeC curto, é um método de ionização de desorpção suave e eficiente. Usamos-na entre outras para espectrometria de massa de biomoléculas, como peptídeos e proteínas. Como DINeC, moléculas de desorção intactas das superfícies da amostra, mudanças químicas sutis nessas moléculas são facilmente detectadas nos espectros de massa.
O processo é ilustrado na simulação a seguir. Os aglomerados de entrada se rompem através do impacto da superfície do aglomerado. O dipeptídeo do isótopo da superfície é dissolvido em um dos fragmentos de aglomerado e desorpado por este processo.
No experimento, o feixe de clusters SO2 é produzido através de expansão supersônica a partir de um bocal pulsado. As moléculas que são dissolvidas e ionizadas durante o impacto da superfície do cluster são transferidas para a armadilha de íons para espectrometria de massa. Espectros de massa típicos só mostram picos nos valores do conjunto mo da molécula intacta.
Demonstrando o procedimento estarão Karolin Bomhardt, e Pascal Schneider, dois doutorandos no meu laboratório. Para amostras padrão, corte os substratos de wafers de silício com espessura de aproximadamente 0,5 a um milímetro em pedaços de um por um centímetro quadrado. Limpe os substratos de silício em um banho de ultrassom de etanol e acetona por 15 minutos cada.
Seque os substratos em um fluxo de gás nitrogênio seco. Em seguida, solte de cinco a 30 microliters da solução amostral no substrato. Dependendo da pressão de vapor do solvente, deixe a amostra secar em condições ambientais ou em um dessecador até que todos os solventes sejam evaporados e uma película seca tenha sido formada.
Considere o esquema de preparação mais simples. Como exemplo, para a investigação da tinta do marcador, basta desenhar um ponto na superfície do substrato. Monte as amostras no suporte da amostra com fita adesiva ou grampos apertados por parafusos.
Além disso, monte uma amostra de referência, como uma mímetro de espessura de Angiotensin II no suporte da amostra. Em seguida, pressione a trava de carga de ventilação para ventilar o sistema de bloqueio de carga. Espere cinco minutos, ou até que a pressão atmosférica tenha sido atingida.
Abra a trava de carga e monte o suporte da amostra. Feche a trava de carga e bombeie a câmara de bloqueio de carga para uma pressão abaixo de duas vezes 10 para o cinco milibarão negativo. Abra a válvula para a câmara DINeC e transfira o suporte da amostra com a haste de transferência para o manipulador principal.
Conecte o suporte da amostra ao manipulador. Retire a haste de transferência e feche a válvula entre a trava de carga e a câmara DINeC. Abra a válvula entre o cilindro de gás e o bocal.
Ajuste a pressão da mistura de dióxido de enxofre e gás hélio no contorno do sistema de mistura de gás para 15 barras. Defina a posição do manipulador à posição da amostra de referência. Para medir espectros de massa cátônica, defina o viés de amostra e grade para mais 40 volts, e mais sete volts, respectivamente.
Para conduzir o bocal pulsado e o espectrômetro de massa da armadilha de íons, coloque o gerador de função externa em dois Hertz. Com o gerador de atraso, defina o atraso de tempo entre o sinal de armadilha clara da armadilha de íons e o sinal de gatilho para o bocal pulsado para cinco milissegundos. No software de controle Bruker, na página Mode da janela principal de diálogo, selecione Resolução Aprimorada para Scan.
Digite M sobre Z 50 a 3000 para intervalo, digite 0,1 milissegundo para tempo de acumulação, digite 10 ciclos para a média e, para polaridade, selecione positivo para a medição de espectros de massa cáfônica e negativo para a medição de espectro aniônico. Uma vez que uma pressão abaixo de três vezes 10 para o seis milibar negativo tenha sido atingida na câmara DINeC, inicie a medição. Defina o valor M sobre Z para a respectiva massa, a fim de seguir o sinal de cromatograma dependente do tempo.
Pressione Operar no software de controle. Comece a gravar as medidas pressionando o botão Gravar. Meça espectro de teste de uma amostra de referência, como Angiotensin II por cerca de 300 segundos.
Otimize a intensidade do sinal pelo ajuste do atraso de tempo entre o sinal de armadilha clara e o sinal que aciona o bocal pulsado. Com o atraso de tempo otimizado, mova o manipulador para a posição da amostra a ser medida. Clique no botão Gravar para adquirir espectros em massa ao longo do período de tempo de interesse.
Após a medição ser concluída, carregue os respectivos dados definidos no programa de Análise de Dados, conforme mostrado aqui para a medição de referência. Selecione o período de tempo de interesse no cromatograma com o botão direito do mouse. O espectro médio é exibido em uma janela separada.
Clique em Exportar como arquivo ASCII para exportar o espectro como um arquivo de dados para processamento posterior em um programa de escolha. O espectro de massa DINeC de uma amostra de Angiotensin II mudou com o tempo à medida que a amostra era aquecida para cerca de 140 graus Celsius. Uma vez que a temperatura atingiu o valor final, o pico da molécula protinada atacada em M sobre Z igualando-se a 1047 caiu e novos picos foram observados.
O processo é resumido nesses três gráficos. Os picos adicionais em M sobre Z igualando 932, 1012 e 1029 foram bem observados. A análise da cinética de reação demonstra que a entidade com M sobre Z igualando 1029 é um intermediário que foi ainda mais decomposto em fragmentos menores à medida que a intensidade primeiro aumentou e depois diminuiu.
As características mais importantes do DINeC são a natureza suave do processo de desorção, a eficiência e a alta sensibilidade da superfície. Todos eles se juntam com os baixos requisitos em relação à preparação da amostra. Assim, o DINeC pode ser aplicado a uma ampla variedade de amostras diferentes, desde materiais de casca orgânica até anúncios de superfície complexos na região da subcamada.
Em todos os casos, informações químicas completas podem ser obtidas em tempo real.
Visão Geral
Este estudo apresenta um novo método de ionização por dessorção usando aglomerados neutros de SO2, denominado DINeC, para análise de espectrometria de massa de biomoléculas. A técnica permite a observação em tempo real de mudanças químicas em peptídeos e proteínas sem extensa preparação da amostra.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Espectrometria de Massa
- Análise Biomolecular
- Química de Superfícies
Fundo
- DINeC é um método de ionização por dessorção suave.
- Permite a análise de moléculas complexas de superfície.
- Monitoramento de reações em tempo real é possível.
- Pequena preparação da amostra é necessária.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar a eficácia do DINeC para espectrometria de massa.
- Analisar mudanças químicas sutis em biomoléculas.
- Fornecer um protocolo detalhado para preparação e medição da amostra.
Métodos Utilizados
- Produção de aglomerados de SO2 via expansão supersônica.
- Dessorção de moléculas através do impacto na superfície do aglomerado.
- Transferência de moléculas ionizadas para um espectrômetro de massa com armadilha de íons.
- Aquisição e análise de dados em tempo real de espectros de massa.
Principais Resultados
- Espectros de massa mostram picos moleculares intactos.
- Novos picos emergem conforme a temperatura aumenta durante a análise.
- Cinética de reação revela formação de espécies intermediárias.
- DINeC demonstra alta sensibilidade e eficiência de superfície.
Conclusões
- DINeC é um método versátil aplicável a várias amostras.
- Fornece informações químicas abrangentes em tempo real.
- Os baixos requisitos de preparação da amostra do método aumentam sua utilidade.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
DINeC enables soft, matrix-free desorption/ionization of complex biomolecules from surfaces, supporting real-time monitoring of chemical modifications without extensive sample preparation. This capability enhances target validation and mechanistic de-risking in early discovery by providing quantitative, fragmentation-free mass spectra of peptides and proteins at sub-monolayer sensitivity. The method’s compatibility with ion trap MSn allows for detailed structural elucidation, improving predictive confidence in lead identification and preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by detecting intact molecular ions and subtle chemical changes in peptides and proteins.
- Operational Value: Supports biological de-risking through soft desorption that preserves labile modifications, reducing false negatives in target engagement studies.
- Predictive Value: Provides quantitative surface coverage data down to 0.1% of a monolayer, aiding in portfolio triage based on target abundance and modification status.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers matrix-free, quantitative mass spectra that enable reliable detection of surface-bound analytes without ionization suppression.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via consistent cluster beam generation and ion trap transfer, minimizing run-to-run variability.
- Scalability: Facilitates platform reuse across diverse sample types, from organic extracts to engineered surfaces, supporting high-throughput screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables real-time observation of surface reactions such as H/D exchange or thermal decomposition, allowing kinetic analysis of biomolecular stability.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by providing continuous chemical information from surface adsorbates to bulk molecules under identical analytical conditions.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports go/no-go criteria by identifying degradation intermediates and reaction pathways that may impact drug candidate stability or efficacy.
Pipeline & Workflow Integration
DINeC integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical assessment, particularly for studies requiring surface-sensitive, real-time monitoring of biomolecular interactions or modifications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by detecting post-translational modifications and ligand-induced conformational changes on surfaces.
- Screening: Enables assay readiness through reproducible desorption of intact molecules, providing quantitative outputs for hit confirmation and structure-activity relationship mapping.
- Analytics: Delivers high-resolution mass spectra and MSn capabilities that allow teams to compare molecular states, modification sites, and fragmentation patterns across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by monitoring time-dependent chemical changes in peptides and proteins under controlled thermal or chemical stress.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable analytical capability across departments, reducing redundant method development and enabling cross-project data consistency.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by preserving molecular integrity and enabling detection of labile species that may be lost in harsher ionization methods.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability via standardized cluster beam parameters and minimal sample handling, reducing technical variance.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by eliminating matrix requirements and enabling direct analysis of native samples, lowering consumable costs and preparation time.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement decisions through real-time kinetic data on surface reactions, supporting early identification of liabilities.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cluster beam generation, ion trap operation, and surface science principles for optimal setup and data interpretation.
- Needs access to a pulsed nozzle system, sulfur dioxide and helium gas handling infrastructure, and a compatible ion trap mass spectrometer with MSn capabilities.
- Demands cross-team standardization of sample mounting, substrate cleaning, and drying protocols to ensure surface homogeneity and reproducible desorption efficiency.
- Involves adaptation considerations when transitioning from model peptides to complex native samples or heterogeneous surfaces, necessitating surface coverage optimization.
- Includes practical limitations such as the need for ultra-high vacuum conditions and potential cluster fragmentation effects at higher impact energies, which must be controlled to maintain soft desorption.
