Plataforma de Microfluidos Digitais baseada em eletrowetting para ensaio imunosorbent automatizado ligado à enzima

Automatizar a ativação de gotículas individuais permite que sequências complexas de uma operação de unidade de laboratório sejam trazidas para um chip. Nossa plataforma microfluidic digital aborda a rápida detecção específica em campo de patógenos de vírus. Este método baseia-se na detecção quantitativa de antígenos específicos usando microfluidos digitais baseados em EWOD em combinação com a imunoprecipitação magnética.

Nesta contribuição, o método é avaliado em amostras contendo várias concentrações de bactérias, esporos, vírus e proteínas. Esse processo é totalmente automatizado, sequencial, escalável e versátil. A sequência e o volume de gotículas podem ser modificados para corresponder aos requisitos de um determinado protocolo.

Afastando totalmente a sensoriamento baseada em anticorpos, a plataforma de microfluidics digitais poderia construir para uma aplicação potencial baseada na biosensagem de aptamer onde as contas magnéticas carregam aptamers específicos para captura e detecção de sequências de nucleotídeos. Ao experimentar essa técnica pela primeira vez, é importante considerar o tipo de surfactante e como ele interage com sua escolha de bioquímica e o revestimento hidrofóbico do polímero. Comece removendo o ímã dos microfluidos digitais ou plataforma DMF e colocando-o no banco.

Coloque uma placa de atuação limpa no estágio rotativo com o cromo voltado para cima, alinhando a placa com o canto superior esquerdo do estágio rebaixado. Aperte a placa de atuação a partir da parte superior usando o painel com os 47 pinos de contato, que irá fixar a placa no lugar e facilitar o alinhamento com os pinos de contato. Em seguida, coloque o calço de 0,5 milímetros e o separador PMMA de dois milímetros no estágio rotativo para fornecer uma lacuna controlada entre as placas de atuação e cobertura.

Para carregar as gotículas nas almofadas de carregamento propostas, aliquot quatro gotículas de 2,5 microliter do buffer de execução para as almofadas denotadas B, A, R e E usando uma gota por almofada. Em seguida, alíquota 2,5 microliters de solução de peróxido de hidrogênio luminol na almofada denotada E. Em seguida, aliquot 2.5 microliters de Neutravidin conjugados ao HRP biotinilado anticorpos secundários e microesferas para as almofadas F, G e I denotaram, respectivamente.

Finalmente, alíquota de 2,5 microliters da amostra desconhecida na almofada denotada C. Coloque a placa de cobertura na superfície da plataforma ao lado da área de recesso redondo e deslize-a lateralmente para o recesso e em cima da placa de atuação. Coloque o ímã permanente em cima da placa de cobertura e fixe-o deslizando as duas travas, em seguida, gire o palco em 180 graus e inspecione-o visualmente para ter certeza de que as gotículas carregadas ainda estão no lugar.

Verifique se a posição de carregamento de cada gotícula corresponde à sequência de atuação programada no software. Posicione a lata de fotodetector na ranhura do estágio rotativo e conecte o cabo. Coloque a tampa sobre a plataforma DMF e inicie a sequência do programa usando a interface de software.

A localização do droplet é registrada através de sensoriamento capacitivo e pode ser observada na interface do usuário. A sequência do programa solicitará mensagens que aparecem na interface para informar o operador que a gotícula luminol está pronta para coletar as contas magnéticas extraídas ou a gotícula de detecção está pronta para ser movida para o local de detecção. Em ambos os casos, a confirmação do operador é necessária para prosseguir.

A intensidade da luz produzida pela reação quemiluminescente é lida pelo fotodetetor e registrada em tempo real. Para operar no modo visual para otimização de protocolos, inicie a sequência do programa usando a interface de software. A atuação automática de gotículas pode ser visualizada no chip para cada uma das etapas críticas de ensaio, como extração magnética das contas, ressuspensão e mistura.

Quando solicitado, monte a lata de fotodetector na fenda do estágio rotativo. Conecte o cabo da lata de fotodetector inserindo os pinos na tomada. Coloque a tampa sobre a plataforma DMF e retome o ensaio.

As gotículas são monitoradas através de sensoriamento capacitivo e podem ser observadas na interface do usuário. Para limpar o equipamento, abra a tampa da plataforma DMF e gire o estágio 180 graus. Desemarar a carcaça do ímã e remova o ímã do estágio rotativo.

Retire o wafer de silício do deslizamento com um par de pinças e enxágue-o com água destilada. Em seguida, seque-o com ar comprimido e coloque-o em uma placa de Petri onde o wafer pode ser armazenado e reutilizado. Use uma micropipette para remover os resíduos líquidos da almofada sem tocar na superfície e limpar a superfície, retirando o líquido da placa de atuação usando papel absorvente.

Para investigar o impacto da tensão de atuação, uma gotícula do buffer foi acionada em várias tensões de atuação e seu movimento foi registrado. Uma correlação entre Vrms e a velocidade média foi demonstrada e um platô de velocidade foi observado após um certo valor de Vrms. A longevidade da placa de atuação foi reduzida quando foram utilizados altos valores para Vrms.

Para a operação da unidade de laboratório de extração, a gotícula contendo as contas suspensas foi levada ao local de separação no meio da zona de mistura. Em seguida, o ímã foi ativado automaticamente para se aproximar do chip e para concentrar as contas. Em seguida, a gota foi movida em direção ao bloco de lixo, deixando as contas.

As operações da unidade de laboratório de extração e mistura no chip EWOD facilitaram um processamento de amostra rápida e reprodutível miniaturizado com detecção consecutiva dos patógenos em 6 a 10 minutos. Os tempos de incubação e concentrações conjugais foram variados para encontrar as condições ideais para o ensaio. Verificou-se que o tempo de incubação de 160 segundos e a concentração conjugada de dois microgramas por mililitro alcançaram a melhor relação sinal-ruído.

Variações no protocolo podem ser introduzidas para alcançar os níveis desejados de automação. O ELISA de oito etapas foi utilizado para detectar diferentes antígenos, como os esporos Bacillus atrophaeus e o bacteriophage MS2. Enquanto isso, o protocolo de 10 passos foi usado para quantificar e.coli.

É importante ter certeza de que as tensões aplicadas, as concentrações de analitos e reagentes são ideais para a ativação das gotículas e separação magnética bem sucedida no chip. Para obter uma medição precisa, a capacidade de ligação de contas deve ser considerada e diluições seriais dos analitos podem ser necessárias. Ao trocar o tipo de anticorpo, pode-se detectar patógenos diferentes daquele relatado na seção de resultados.

O método também pode ser aplicado, por exemplo, para detecção de biomarcadores ou diagnósticos de ponto de atendimento. Além das aplicações já apresentadas, o sistema foi desenvolvido com a detecção em campo de patógenos aéreos em mente. O DMF é uma plataforma ideal para este aplicativo porque o volume de gotículas corresponde à saída de outro sampler que desenvolvemos recentemente.