Medição quantitativa de proteínas sintetizadas intrathecally em camundongos

Este protocolo permite que csf e coleta de sangue na correção quantitativa dos níveis de proteína CSF para medir em uma síntese de proteínas ocal em modelos de camundongos de distúrbios neurológicos. Este procedimento fornece uma linha de base, contra a qual a origem fisiopatológica das proteínas CSF de interesse, e a estabilidade e a significância funcional do CSF sanguíneo favorecem a integridade. A análise da síntese de proteínas interteca e da integridade da barreira pode ser aplicada a outros modelos animais e estudos humanos.

Por exemplo, para verificar se há doenças do sistema nervoso central. A coleta de volumes significativos de CSF limpo pode ser tecnicamente desafiadora em camundongos, por isso é aconselhável praticar a técnica até que grandes volumes de amostra não contaminada possam ser obtidos. Demonstrando os procedimentos estará Micheal Linzey, estudante de pós-graduação do programa de medicina experimental e molecular em Dartmouth, em nosso novo grupo de pesquisa em imunologia.

Para coleta de soro através de sangramento orbital retrô. Depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal em um rato anesthetizado superior a 15 gramas, segure a pele solta atrás das orelhas com o polegar e o dedo indicador da mão não dominante, e use o dedo indicador para retirar a pele acima dos olhos. Usando o polegar para retirar a pele abaixo dos olhos, coloque a ponta de uma pipeta Pasteur, mantida em um ângulo de aproximadamente 45 graus, na órbita ocular sob o globo ocular, direcionada para o meio da órbita ocular, enquanto gira a pipeta entre os dedos.

Em seguida, aplique pressão breve e suave e solte para permitir que o sangue entre na pipeta. Quando a amostra de sangue tiver sido coletada, remova suavemente o capilar sem ferir o olho, e transfira o sangue para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Depois de fechar a pálpebra, aplique pressão leve com gaze para evitar maior sangramento.

Deixe o sangue coagular por 30 a 60 minutos à temperatura ambiente antes de girar a amostra por centrifugação. Usando uma técnica de pipeta limpa, colete o soro separado em um novo frasco de 500 microliter, e congele imediatamente o soro a 80 graus Celsius. Após confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal, remova uma grande área de cabelo suficiente para permitir a coleta do fluido espinhal cerebral imediatamente na extremidade caudal do crânio do rato anestesiado.

Coloque o mouse em uma posição propensa em um dispositivo estereotaxico em condições estéreis e estalou a cabeça com barras de ouvido. Co swab o local cirúrgico com diacetato de 30% de clorexidina, e faça uma incisão de pele sagital inferior à occiput para expor os músculos sobrepostos à cisterna magna. Usando fórceps, disseque o tecido e os músculos subcutâneos e use micro retráteis para segurar os músculos para expor a camada meningeal dura mater sobre a cisterna magna.

Lave suavemente o tecido com PBS estéril para remover qualquer possível contaminação sanguínea, e use um cotonete estéril para borrar o dura mater seco. O posicionamento da punção inicial na cisterna magna é essencial para a obtenção de CSF abundante e não contaminado. Usando uma agulha de calibre 30, puna suavemente a membrana que cobre a cisterna magna, e insira rapidamente e suavemente um pequeno tubo capilar de vidro na punção.

Quando cinco a 12 microliters de CSF tiverem sido coletados, remova cuidadosamente o tubo da membrana e use um pedaço de tubo de polietileno para conectar o tubo a uma seringa de três mililitros. Injete o CSF coletado em um tubo de 500 microliteres rotulado no gelo, e use uma agulha descartável e variadas suturas de polidioxanona para fechar a incisão. Limpe a área de qualquer sangue ou tecido seco, e coloque o rato em uma gaiola limpa e quente com monitoramento até a recumbência total.

Colete o CSF por centrifugação, e inspecione visualmente a pelota e sobrenize-a para qualquer sinal de contaminação sanguínea. Em seguida, usando a técnica de pipeta limpa, transfira o supernato contendo CSF em um novo tubo de 200 microliter, e dilua o CSF em uma proporção de um a três com PBS para armazenamento imediato a 80 graus Celsius. Para coleta de soro por punção cardíaca, imediatamente após a coleta de CSF, como apenas demonstrado, coloque o rato na posição supina.

Cotonete a pele abdominal com 70% de álcool. Use uma tesoura para abrir a cavidade torácica, expondo o coração, e inserir uma agulha de calibre 25 presa a uma seringa de 3 mililitros no ventrículo esquerdo. Em seguida, aplique suavemente pressão negativa no êmbolo da seringa, retirando a agulha depois que o sangue tiver sido coletado.

Deprimir o êmbolo para ejetar o sangue coletado em um frasco de 1,5 mililitro. Agora, deixe o sangue coagular por 30 a 60 minutos em temperatura ambiente antes de separar o soro por centrifugação. Em seguida, usando uma técnica de pipeta limpa, transfira o soro para um novo frasco de 500 microliter rotulado para armazenamento imediato a 80 graus Celsius.

Para quantificar as proteínas-alvo e o albumen em amostras de soro e CSF combinadas, use um ensaio padrão de quantificação de proteínas, utilizando proteínas padrão referenciadas para preparar uma curva padrão para cada proteína de interesse. Após a análise, exporte os dados brutos para um programa de grafização de software apropriado, e gráfico a intensidade de fluorescência do sinal de detecção versus as concentrações de proteína padrão para criar uma curva padrão para cada proteína de interesse. Em seguida, use as curvas padrão para calcular as concentrações de cada analito de interesse nas amostras.

Finalmente, use as concentrações de albumen e analitos de destino para calcular valores Q e índice intratecal. Os níveis reais de IgG totais são significativamente aumentados no CSF de dois modelos de roedores testados de esclerose múltipla, em comparação com a idade correspondente aos controles falsos correspondentes. Os camundongos R-EAE mostram valores quocientes de albumen significativamente aprimorados, indicando uma maior permeabilidade da barreira cerebral sanguínea nesses camundongos.

Não versáticamente, não existem diferenças no quociente de albumen entre TMEV-IDD e ratos falsos, corroborando descobertas anteriores de uma barreira intacta em ratos TMEV-IDD. Além disso, em animais TMEV-IDD, valores significativamente mais elevados do índice IgG e, portanto, a produção de IgG intrathecal são observadas. O cálculo de um índice proteico facilita a identificação de novos biomarcadores proteicos úteis para diagnóstico precoce, previsão de desfechos e monitoramento de cursos de doenças para doenças neuroinflamatórias e neurodegenerativas.