Name: Hibridização em Embriões de Zebrafish e Ensaio de Formação de Tubos em iPSC-CEs para estudar o papel da endoglina no desenvolvimento vascular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Aprenda hibridização in situ em embriões de zebrafish e ensaio de formação de tubos em células endoteliais derivadas de iPSC para estudar o papel da endoglina na formação vascular.

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Este trabalho foi apoiado por subsídios do Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento de Células-Tronco da China e pesquisa translacional [número de subvenção 2016YFA0102300 (para Jun Yang)];a Nature Science Foundation of China [número de subvenção 81870051, 81670054 (para Jun Yang)]; o CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) [número de subvenção 2016-I2M-4-003 (para Jun Yang)]; o PUMC Youth Found e o Fundamental Research Funds for the Central Universities [número de subvenção 2017310013 (para Fang Zhou)].

Todos os experimentos em animais descritos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina da Universidade de Zhejiang.
1. Hibridização total in situ
<ol><li>Criação e reprodução da linha zebrafish<ol>
<li>Alimente e levante todos os zebrafish adultos a 26-28 °C em um sistema de aquicultura recirculante com 14 h de ciclo escuro de luz/10h para cada dia. Use linhas de zebrafish AB (tipo selvagem) para os seguintes procedimentos.</li>
		<li>Coloque uma camada de pedras no fundo da caixa de reprodução como um abrigo para ovos. Peixe parental em grupo na proporção de 2:1 (ou seja, duas fêmeas e um macho) em cada caixa. Deixe a fêmea desovar por 1 dia. No final da desova, remova os peixes-mãe imediatamente para evitar que eles comam os ovos.</li>
		<li>Injete o 2 ng de morfolnos e 500 pg de mRNA em embriões de estágio de uma célula usando o sistema de injeção Femto Jet sob um microscópio (sequência endoglin-MOs: 5'-GATGAACTCAACACTCGTGTCTGAT-3'; 5-mispair control MOs sequência: 5'-AAACAGACCACATCCCTCTC-3').</li>
		<li>Incubar as zigotes em água do mar ácido a 27 °C por aproximadamente 48 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Coleta e fixação de embriões de zebrafish<ol>
<li>Use uma pipeta de transferência plástica para coletar 20-40 embriões de zebrafish da água do sistema circulante (pH = 5,0) em um tubo de 1,5 mL quando eles são descorrioados e atingem um período específico de desenvolvimento. Adicione 1 mL de solução PFA de 4% recém-preparada à temperatura ambiente (RT). NOTA: O período em que o embrião escolhido baseia-se no propósito do experimento. A Tabela 1 mostra o tempo de fixação necessário para diferentes períodos embrionários.</li>
		<li>Remova a solução de fixação, lave embriões com solução tamponada com fosfato com Tween-20 (PBST, diluir 1 mL de Interpol em 1000 mL de solução PBS) 3x por 5 min cada na RT.</li>
		<li>Desidratar os embriões através da incubação em uma série de 25%, 50% e 75% de metanol (diluído em PBST) por 5 min cada. Transfira embriões para 100% metanol por 5 min e substitua por metanol fresco. Armazene os embriões a -20 °C durante a noite ou mais.</li>
	</ol></li>
	<li>Hidratação e digestão<ol>
<li>Hidrate os embriões preservados em 100% de metanol usando uma peneira com malha de nylon na parte inferior para lavar sequencialmente embriões nos poços de 12 placas de poço com uma série de 75%, 50% e 25% de metanol (diluído em PBST) por 5 min cada. Lave os embriões com PBST 3x por 5 min cada na RT.</li>
		<li>Adicione 50 μL de proteinase K (10 mg/mL) no tubo com embriões e siga o tempo de digestão na Tabela 2 em RT.</li>
		<li>Remova a proteína K e lave os embriões com PBST 3x por 5 min cada na RT.</li>
	</ol></li>
	<li>Hibridização da sonda e pós-fixação<ol>
<li>Coloque as sondas projetadas de acordo com as sequências de mRNA de cada gene em um sistema hibridizatina de 40 °C até que o precipitado seja dissolvido, que devem levar ~10 min. Misture as sondas-alvo de por exemplo (XM_007116,7) e dois genes adicionais importantes envolvem na formação progenitora endotheial do mesoderm (aqui, aplnr [NM_001075105.1] e nrp1a [NM_001040326.1]) em um tubo de 1,5 mL a uma proporção de 50:1:1.</li>
		<li>Adicione 50-100 μL de sondas alvo mistas em cada tubo com embriões e, em seguida, incubar durante a noite a 40 °C. NOTA: As sondas pré-misturadas devem ser pré-aquecidas a 40 °C e resfriadas para RT antes de usar.</li>
		<li>Prepare uma solução de citrato de sódio salino de 0,2x com Tween-20 (SSCT): dissolva 175,3 g de NaCl e 88 g de citrato de sódio em 1 L de dH2O para obter uma solução SSC de 20x. Em seguida, diluir a solução 1:100 em dH2O para obter uma solução 0,2 x SSCT. Diluir Tween-20 1:1000 na solução SSCT 0.2x.</li>
		<li>Transfira as sondas recicladas para um novo tubo. Lave os embriões em 0,2x solução SSCT 3x por 15 min cada na RT. As sondas recicladas podem ser reutilizadas 5x-10x.</li>
		<li>Use 4% de paraformaldeído (PFA) para fixar os embriões por 30 minutos na RT. Lave os embriões em 0,2x solução SSCT 3x por 15 min cada na RT. NOTA: O trabalho de Gross-Thebing et al. sugere um período pós-fixação de 10 min14,mas o valor real deve ser ajustado em conformidade. Aqui, testamos 10 min após a fixação 3x, e a sensibilidade da morte da DAB é significativamente influenciada. Após a investigação, certifique-se de que 0,5-1.0h de fixação é a condição ideal (um período de fixação mais curto não pode produzir um sinal claro do RNA alvo, e a extensão adequada do tempo de fixação ajuda a fortalecer o sinal e fornecer menos ruído de fundo).</li>
	</ol></li>
	<li>Hibridização do amplificador e da sonda de etiquetas sequenciais<ol>
<li>Remova a solução SSCT e substitua por 50 μL de Amp 1. Deixe os embriões se instalarem no Amp 1 a 40 °C por 30 min. Em seguida, lave os embriões em 0,2x solução SSCT 3x por 15 minutos cada na RT.</li>
		<li>Remova a solução SSCT e adicione 50 μL de Amp 2. Deixe os embriões se estabelecerem a 40 °C por 15 minutos. Em seguida, lave os embriões em 0,2x solução SSCT 3x por 15 minutos cada na RT.</li>
		<li>Remova a solução SSCT, adicione 50 μL de Amp 3 e toque levemente no tubo. Em seguida, incubar os embriões a 40 °C por 30 min. Lave os embriões em 0,2x solução SSCT 3x por 15 min cada na RT.</li>
		<li>Remova a solução SSCT, adicione 50 μL de Amp 4 dropwise e toque cuidadosamente no tubo. Em seguida, incubar os embriões a 40 °C por 15 min. Lave os embriões em 0,2x SSCT 3x por 15 min cada na RT.</li>
	</ol></li>
	<li>Contratensão e microscopia<ol>
<li>Remova a solução SSCT e adicione 50 μL de DAPI a cada tubo. Incubar os embriões durante a noite a 4 °C.</li>
		<li>Lave os embriões com PBST e prepare-os para imagem usando uma solução de 1% de baixo ponto de fusão (LMP) (1 g de LMP dissolvida em 100 mL de dH2O) em uma placa de Petri cheia de PBST.</li>
		<li>Use um kit de substrato de peroxidase DAB para manchar a amostra. Adicione os reagentes de cor A, B e C (50 μL cada) a 1 mL de água destilada e misture bem para obter um fluido de trabalho DAB completo. Adicione o fluido ao espécime e cubra por 10 minutos.</li>
		<li>Lave o espécime cuidadosamente com PBST após a coloração.</li>
		<li>Use um microscópio óptico com uma função fotográfica para a imagem das amostras. NOTA: Se tirar imagens posteriormente, os tubos devem ser embrulhados em papel alumínio e armazenados a 4 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Ensaio de formação de tubos
NOTA: Os ECs eng mutante e wildtype (controle) foram diferenciados dos iPSCs derivados de um paciente HHT (aqui, paciente do sexo feminino de 62 anos com epistaxis recorrentes desde 22 anos de idade, sangramento gastrointestinal, malformações arteriovenosas pulmonares, portadora de mutação missense eng na posição c.88T>C de exon 2) e um doador saudável (sem mutação eng), que foram fornecidos pelo Peking Union Medical College Hospital com aprovação do comitê de ética de pesquisa da faculdade.
<ol><li>Controle e culturas celulares HHT iPSC<ol>
<li>Adicione um certo volume de matriz de membrana de porão (por exemplo, Matrigel) a uma placa de cultura de 6 poços para cobrir o fundo do poço e incubar as placas por 1h a 37 °C. NOTA: Quando usar pela primeira vez a matriz de membrana do porão armazenada a -20 °C, incubar no gelo ou em uma geladeira de 4 °C sem gelo até descongelar. Em seguida, diluir às 1:100 em DMEM/F12, em seguida, distribua o diluente em tubos de 200 μL contendo 100 μL cada. Armazene os tubos a -20 °C e evite o congelamento e o descongelamento repetidos. Ao adicionar a matriz de membrana diluída do porão, não crie bolhas. Depois de adicionar a matriz de membrana diluída do porão, aperte a placa de 6 poços suavemente à mão para que ela cubra uniformemente o fundo.</li>
		<li>Após o revestimento da placa, remova a solução de matriz de membrana do porão usada dos poços. Em seguida, adicione 2 mL de mTeSR1 médio em cada poço, e emplaque os iPSCs colhidos da última passagem em aproximadamente 1 x 106 por poço.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Geração e expansão de CES a partir de iPSCs<ol>
<li>Após aproximadamente 4 dias de cultura iPSC, troque o meio de cultura com o meio BEL complementado com activin A (25 ng/mL), BMP4 (30 ng/mL), VEGF165 (50 ng/mL) e CHIR99021 (1,5 μM). Cresça as células por 3 dias para gerar células de mesoderme.</li>
		<li>Substitua o meio descrito na etapa 2.2.1 por meio BEL suplementado com VEGF (50 ng/mL) e SB431542 (10 μM) por 4 dias para expandir as CEs vasculares. Trate as células com o mesmo meio e cultura por mais 3-4 dias.</li>
		<li>Use as dinabeads CD31-dynabeads para purificar as CEs vasculares maduras: consulte as instruções do kit CD31-dynabeads, que liga o anticorpo CD31 humano com contas magnéticas para combinar moléculas CD31 expressas em CEs, em seguida, coletar as células CD31 positivas por tampão de eluição. Manter e expandir os CEs purificados em meio EC-SFM contendo VEGF165 (30 ng/mL), bFGF (30 ng/mL) e FBS (1%).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Emplacando células endoteliais em placas revestidas de Matrigel e microscopia<ol>
<li>Adicione 10 μL de matriz de membrana por poço para revestir as placas de angiogênese (ver Tabela de Materiais) e incubar a 30 min a 37 °C.</li>
		<li>Colher células endoteliais depois de verificar os marcadores endoteliais CD31 e VE-cadherin com coloração de imunofluorescência e resuspensá-las no meio de crescimento endotelial 2 por pipetação repetidamente. Adicione 50 μL de suspensão celular (2 x 105 células/mL) por bem na matriz solidificada e incuba as células por 3-5 h a 37 °C. NOTA: Antes do experimento de formação do tubo, os marcadores endoteliais devem ser verificados para ter certeza do fenótipo adequado das células endoteliais funcionais. 1 x 104 células por poço é um número ideal para a formação de tubos. Muitas ou poucas células não são propícias à formação de tubos. Adicione células do lado do prato e não toque na matriz de membrana do porão. Use microscópio leve em campo de alta ampliação para verificar as células e tirar fotos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resultados quantitativos da formação de tubos<ol>
<li>Observe os resultados com um microscópio de alta resolução e tire fotos de pelo menos 10 áreas para cada grupo obter estatísticas confiáveis de dados.</li>
		<li>Examine a formação do tubo endotelial: estime a extensão da formação do tubo inspecionando o comprimento geral do tubo, o número do tubo e os pontos do ramo. Avalie e conte o número e o comprimento das filiais usando o software ImageJ.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Jin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoglin+prevents+vascular+malformation+by+regulating+flow-induced+cell+migration+and+specification+through+VEGFR2+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endoglin prevents vascular malformation by regulating flow-induced cell migration and specification through VEGFR2 signalling.</a> Nature Cell Biology. 19 (6), 639-652 (2017).</li>
<li>Sugden, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoglin+controls+blood+vessel+diameter+through+endothelial+cell+shape+changes+in+response+to+haemodynamic+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endoglin controls blood vessel diameter through endothelial cell shape changes in response to haemodynamic cues.</a> Nature Cell Biology. 19 (6), 653-665 (2017).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoglin+is+a+conserved+regulator+of+vasculogenesis+in+zebrafish+-+implications+for+hereditary+haemorrhagic+telangiectasia%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Endoglin is a conserved regulator of vasculogenesis in zebrafish - implications for hereditary haemorrhagic telangiectasia.</a> Bioscience Reports. 39 (5), (2019).</li>
<li>Lawera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+soluble+endoglin+in+BMP9+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Role of soluble endoglin in BMP9 signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (36), 17800-17808 (2019).</li>
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<li>Gomez-Puerto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+contributes+to+BMP+type+2+receptor+degradation+and+development+of+pulmonary+arterial+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Autophagy contributes to BMP type 2 receptor degradation and development of pulmonary arterial hypertension.</a> The Journal of Pathology. 249 (3), 356-367 (2019).</li>
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<li>Xiao, C., Gao, L., Hou, Y., Xu, C., Xiong, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin-remodelling+factor+Brg1+regulates+myocardial+proliferation+and+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish.</a> Nature Communications. 7, 13787(2016).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo aplicou uma melhor plataforma de análise de RNA in situ in situ para ensaios de formação de zebrafish e tubos em iPSC-CEs derivados de um paciente HHT. O método ISH tradicional requer um ciclo experimental mais longo com etapas experimentais extras. O protocolo possui algumas melhorias importantes, o uso de sondas independentes duplas Z e iPSCs derivados de um paciente com HHT que foram aplicados em ensaios WISH e formação de tubos, respectivamente. Esses refinamentos são cruciais para aumentar a sensibili...

Uma única mutação no eng (CD105) foi relatada em pacientes com HHT. A mutação leva ao aumento da proliferação da CE e à redução do alongamento da CE mediada pelo fluxo1,,2. Também foi relatado anteriormente que a deficiência de ENG reduz a expressão de marcadores endoteliais (ou seja, kdrl, cdh5, hey2) em zebrafish3. Endoglin, expressa principalmente em células endoteliais, é uma glicoproteína transmembrana e funciona como um co-receptor para transformar o fator de crescimento β (TGF-β) membros da família. Ele direciona a ligação BMP9 na superfície celular para regular o gene a jusante, incluindo a expressão Id1, para induzir a diferenciação de células-tronco em relação aos CE4. Assim, o gene eng desempenha papéis importantes na vasculogênese e na doença vascular humana5,6. Examinamos anteriormente os efeitos da derrubada de endoglin na formação de vasos em embriões de zebrafish, seguido pela análise de CEs derivados de iPSCs adquiridos de um paciente com HHT com uma mutação eng 7. Este protocolo demonstra os efeitos da deficiência de ENG na expressão do marcador progenitor endotelial e na formação de tubos, que é um método quantificável para medir angiogênese in vitro.
Para estudar a expressão espacial e temporal, o WISH é empregado para detectar a expressão genética in vivo8. A hibridização in situ (ISH) é um método de uso de sondas rotuladas com sequências complementares de ácidos nucleicos-alvo (DNA ou mRNA) para detectar e visualizar híbridos de ácido nucleico alvo em uma amostra fixa. O processo amplifica sinais de expressão genética in vivo e é usado para detectar a expressão de genes por microscopia. A WISH tem sido amplamente utilizada em vários animais modelo, especialmente em zebrafish9. Também é usado para adquirir os seguintes dados: 1) padrões de expressão espacial/temporal genética, que fornecem informações sobre a função e classificação genética; e 2) marcadores genéticos expressos especificamente que são usados em drogas de alta produtividade ou triagem mutante10.
As sondas cromogênicas são facilmente degradadas com o cromossomo tradicional in situ hibridização (CISH), o que resulta em alto ruído de fundo e sinais inespecíficos11,12. O método WISH usa duas sondas Z duplas independentes, que são projetadas para hibridizar para atingir sequências de RNA. Cada sonda contém uma sequência de 18-25 complementar ao RNA alvo e uma sequência de cauda base de 14 (conceitualizada como Z). As sondas-alvo são usadas em um par (duplo Z). As duas sequências de cauda juntas formam um local de hibridização de 28 bases para o pré-amplificador, que contém 20 locais de ligação para o amplificador. O amplificador, por sua vez, contém 20 sites de vinculação para a sonda de etiqueta e pode teoricamente render até 8.000 etiquetas para cada sequência de RNA de destino.
Esta tecnologia avançada facilita a amplificação simultânea de sinal e a supressão de fundo para alcançar a visualização de molécula única, preservando a morfologia tecidual13. Outra modificação dos métodos WISH baseia-se em pesquisas anteriores14, incluindo fixação extra e coloração da DAB. Desde aqui está um protocolo WISH melhorado que pode funcionar mesmo que o RNA alvo seja parcialmente diminuído ou degradado. As vantagens incluem que ele pode ser concluído em 24 horas sem condições livres de RNase. Os sinais também podem ser detectados simultaneamente através de vários canais de vários alvos, e os resultados são consistentes e compatíveis com resultados de diferentes plataformas de automação de alto rendimento.
Os resultados de modelos animais não refletem o mesmo fenômeno que ocorre em humanos. A ENG contém dois pares de cisteínas conservadas, C30-C207 e C53-C182, que formam pontes de dissulfeto em regiões órfãs. Para estudar melhor o papel do eng em pacientes com HHT, ensaios de formação de tubos com iPSCs derivados de pacientes com HHT têm sido realizados em células sem/com mutações eng (Cys30Arg, C30R)15. Depois que Kubota et al. relataram pela primeira vez o experimento de formação detubos 16,o ensaio foi desenvolvido de várias maneiras. Tem sido usado para identificar fatores angiogênicos ou antiangiogênicos, definir as vias de sinalização na angiogênese e identificar genes que regulam a angiogênese17.
Antes da disponibilidade de iPSC-CE derivados do paciente, os pesquisadores usavam eCs principalmente cultos para estudar angiogense16. No entanto, para as células endoteliais, é um desafio técnico transduir genes exógenos com um vírus, devido ao número de passagem limitado que as CEs podem sofrer. Isso porque não há material celular suficiente para ser coletado de vasos humanos, seja de cirurgia ou doadores aprovados. Com a invenção da técnica de geração iPSC por Shinya Yamanaka, os CEs humanos derivados de iPSCs podem ser usados de forma confiável em experimentos in vitro, como relatado anteriormente18.
O uso de CEs transduzidas viralmente com números e passagens limitadas pode ser suficiente para estudos de sinalização, mas para estudos funcionais, é melhor gerar linhas de células-tronco pluripotentes mutantes, (iPSCs ou hESCs alvo CRISPER/Cas9), em seguida, diferenciá-los em CEs para estudos de angiogênese que usam ensaios de formação de tubos19. A formação de tubos pode ser usada para avaliar a função das células endoteliais que carregam mutações. Este protocolo também descreve a formação de tubos em uma placa de angiogênese de μ-slide, que é um método fácil, econômico e reprodutível.
O protocolo abaixo fornece um método confiável e sistêmico para estudar o papel de genes específicos na formação vascular, juntamente com detalhes para o padrão de expressão in vivo e quantificação funcional in vitro para modelagem de doenças humanas.

<table><tbody><tr><td>&micro;-Slide Angiogenesis</td><td>ibidi</td><td>81506</td><td>Ampère de cultura de células</td></tr><tr><td>1-FL</td><td>ACD</td><td>SDS</td> 320852 <td>Amplificador de amplificação de sinal</td></tr><tr><td>2-FL</td><td>ACD</td><td>SDS</td> 320853 <td>Amplificador de amplificação de sinal</td></tr><tr><td>3-FL</td><td>ACD</td><td>SDS</td> 320854 <td>Amplificação de sinal</td></tr><tr><td>4 Alt B-FL</td><td>ACD</td><td>SDS</td> 320856 <td>Amplificação de sinal</td></tr><tr><td>Corning Matrigel Matrix</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Matrigel com fator de crescimento reduzido</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td>Água livre de RNAase</td></tr><tr><td>Endotelial Humano-SFM</td><td>Thermofisher</td><td>11111044</td><td>Cultura</td></tr><tr><td>de células Paraformaldeído</td><td>Sigma</td><td>30525-89-4</td><td>Embriões fixos</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma</td><td>30525-89-4</td><td>Células fixas</td></tr><tr><td>Protease K</td><td>ACD</td><td>SDS</td> 322337 <td>Digerir</td></tr><tr><td>tecido Citrato de sódio</td><td>Sigma</td><td>6132-04-3</td><td>Solução SSCT: Tampão de lavagem</td></tr><tr><td>VEGF-165</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78073</td><td>Fator de crescimento</td></tr></tbody></table>

hibridização em embriões de zebrafish e ensaio de formação de tubos em ipsc-ces para estudar o papel da endoglina no desenvolvimento vascular

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

O desenvolvimento vascular é determinado pela expressão sequencial de genes específicos, que podem ser estudados realizando ensaios de hibridização in situ em zebrafish durante diferentes estágios de desenvolvimento. Para investigar o papel da endoglin(eng) na formação de vasos durante o desenvolvimento da telangiectasia hemorrágica hereditária (HHT), o knockdown direcionado mediado por morfina de eng em zebrafish é usado para estudar sua expressão temporal e funções associadas. Aqui, a hibridização de RNA in situ (WISH) é empregada para a análise de eng e seus genes a jusante em embriões de zebrafish. Além disso, os ensaios de formação de tubos são realizados em células endoteliais induzidas pelo paciente HHT (iPSC-ECs; com mutações eng). Um sistema específico de amplificação de sinal usando toda a quantidade In Situ Hybridization – WISH fornece maior resolução e resultados de fundo mais baixos em comparação com os métodos tradicionais. Para obter um sinal melhor, o tempo de pós-fixação é ajustado para 30 minutos após a hibridização da sonda. Como a coloração da fluorescência não é sensível em embriões de zebrafish, ela é substituída por coloração diaminobezidina (DAB) aqui. Neste protocolo, as linhas iPSC derivadas do paciente HHT contendo uma mutação eng são diferenciadas em células endoteliais. Depois de revestir uma placa com matriz de membrana de porão por 30 min a 37 °C, os iPSC-CE são semeados como monocamadas em poços e mantidos a 37 °C por 3h. Em seguida, o comprimento do tubo e o número de ramos são calculados usando imagens microscópicas. Assim, com este protocolo WISH melhorado, mostra-se que a expressão eng reduzida afeta a formação de progenitores endoteliais em embriões de zebrafish. Isso é confirmado ainda por ensaios de formação de tubos utilizando iPSC-CEs derivados de um paciente com HHT. Esses ensaios confirmam o papel do eng no desenvolvimento vascular precoce.

A hibridização total do situ baseia-se em um princípio semelhante à transferência de energia de ressonância fluorescência. Ele foi projetado para melhorar a sensibilidade e a especificidade no ISH de zebrafish, bem como amplificar sinais específicos de alvo sem afetar o sinal de fundo.
Em embriões de zebrafish de 24 hpf, a endoglina é altamente expressa na veia cardeal posterior (PCV), vasos intersegmentais (ISVs) e ilh...

Apresentado aqui é um protocolo para análise de hibridização de RNA in situ in situ em zebrafish e ensaio de formação de tubos em células endoteliais derivadas de células-tronco derivadas do paciente para estudar o papel da endoglina na formação vascular.

Hibridização em Embriões de Zebrafish e Ensaio de Formação de Tubos em iPSC-CEs para estudar o papel da endoglina no desenvolvimento vascular

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

A hibridização completa, in situ, WISH, proporciona uma alta resolução e um baixo resultado de fundo em comparação com os métodos tradicionais. Além disso, as placas de u-slide melhoram o foco na mesma distância focal usando menos WISH pode ser aplicado a embriões de camundongos, embriões de Drosophila e outros tecidos difíceis de manusear. O ensaio de formação do tubo pode ser aplicado a células-tronco células andrógenas diferenciadas.O WISH facilita a compreensão do significado funcional da correção da mutação. A pessoa que vai demonstrar o procedimento é Yong Wang, um assistente de pesquisa do meu laboratório. Trabalhando sob um microscópio, use o sistema FemtoJet para injetar dois nanogramas de Morpholinos e 500 picogramas de MRNA em embriões unicelulares.Pratique a microinjeção de Morpholinos muitas vezes até que você possa injetá-lo nas células com sucesso e manter a integridade dos ovos. Incubar as zigotos até que sejam descorrioadas e alcancem o estado de desenvolvimento que corresponde ao experimento pretendido. Como descrito na mesa um do manuscrito.Em seguida, use uma pipeta de plástico para transferir 20 a 40 embriões para um tubo de 1,5 mililitro. Adicione um mililitro

whole-mount-situ-hybridization-zebrafish-embryos-tube-formation-assay

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Montar toda a hibridização in situ é uma das técnicas mais utilizadas em biologia do desenvolvimento. Aqui, apresentamos uma alta resolução de dupla fluorescentes em protocolo de hibridização in situ para analisar o padrão de expressão precisa de um único gene e para determinar a sobreposição dos domínios de expressão dos dois genes. Incluímos uma propidium iodeto nuclear contra-coloração para destacar a organização do tecido.

Zebrafish Whole Mount Alta Resolução Duplo Fluorescente In Situ Hibridização

Imagem do desenvolvimento vascular cerebral em zebrafish larval é descrito. Técnicas para facilitar a imagens 3D e modificar o desenvolvimento vascular cerebral utilizando tratamentos químicos também são fornecidos.

Imagem e Reconstrução 3D de Estruturas cerebrovasculares em Embryonic Zebrafish

O peixe-zebra, um pequeno peixe tropical, tornou-se um modelo popular para estudar a função do gene durante o desenvolvimento de vertebrados e doença. A expressão espacial e temporal dos genes alvo pode ser determinada...

Alta resolução Monte Whole<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização dentro embriões Zebrafish para estudar a expressão gênica e função

Processos de desenvolvimento, tais como a proliferação, a modelagem, diferenciação, e a orientação do axónio pode ser facilmente modelada na medula espinal do peixe-zebra. Neste artigo, nós descrevemos um procedimento de montagem para os embriões de peixe-zebra, que otimiza a visualização destes eventos.

Dissecção e montagem lateral de embriões Zebrafish: Análise de Desenvolvimento da Medula Espinhal

O embrião de peixe-zebra é um excelente modelo para investigação em biologia do desenvolvimento. Durante a embriogênese, peixe-zebra desenvolver com uma massa de gema, que apresenta desafios tridimensionais para observação de amostras e análise. Este protocolo descreve como criar bidimensionais planas montagem preparações de toda montagem in situ (desejo) manchadas espécimes embrião de peixe-zebra.

Monte Preparação Plano de observação e análise de amostras de embriões Zebrafish manchado por inteiro Monte<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridização

Técnicas são descritas a imunocoloração fosfo-epitopos em embriões de peixe-zebra inteiros e em seguida, realizar duas cores localização confocal fluorescente em estruturas celulares tão pequenos quanto cílios. As técnicas de fixação e de imagem pode definir a localização e cinética da aparência ou a activação de proteínas específicas.

Imunocoloração fosfo-epitopos em ciliadas Órgãos da Whole Mount embriões Zebrafish

Este protocolo demonstra um método baseado em fluorescência para visualizar a vasculatura e quantificar sua complexidade em Xenopus tropicalis . Os vasos sanguíneos podem ser visualizados minutos após a injecção de um corante fluorescente no coração batendo de um embrião após manipulações genéticas e / ou farmacológicas para estudar o desenvolvimento cardiovascular in vivo .

Visualização e Análise Quantitativa da Angiogênese Embrionária<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Desenvolvimento de cílios é vital para a organogênese adequada. Este protocolo descreve um método otimizado para rotular e Visualizar células ciliadas do zebrafish.

Visualização de células Multiciliated no Zebrafish através de um protocolo combinado de toda montagem fluorescente In Situ da hibridação e imunofluorescência

Aqui, apresentamos um método simples para dosar o tronco e progenitoras células hematopoiéticas (HSPCs) no zebrafish embrionária. HSPCs de zebrafish dissociado são banhados em metilcelulose com fatores de apoio, diferenciando-se em sangue maduro. Isto permite a detecção de sangue defeitos e permite para ser facilmente conduzida de despistagem de drogas.

Desenvolvimento de um ensaio In Vitro para dosar o Progenitor e Hematopoietic Stem Cells (HSPCs) no desenvolvimento de embriões de peixe-zebra

Este artigo descreve um método para montar embriões frágeis do zebrafish para a microscopia confocal prolongada do tempo-lapso. Este método de baixo custo é fácil de executar usando pratos regulares de microscopia com fundo de vidro para imagens em qualquer microscópio invertido. A montagem é realizada em camadas de agarose em diferentes concentrações.

Um método de montagem em camadas para a microscopia confocal de lapso de tempo prolongado de embriões zebrafish inteiros

Aqui, apresentamos um protocolo para detecção de proteínas mediadas por anticorpos fluorescentes em preparações inteiras de embriões e larvas de zebrafish.

Imunohistoquímica do Monte Inteiro em Embriões e Larvas de Zebrafish

Aprenda hibridização in situ em embriões de zebrafish e ensaio de formação de tubos em células endoteliais derivadas de iPSC para estudar o papel da endoglina na formação vascular.

Hibridização em Embriões de Zebrafish e Ensaio de Formação de Tubos em iPSC-CEs para estudar o papel da endoglina no desenvolvimento vascular (Vídeo) | JoVE Journal

Hibridização em Embriões de Zebrafish e Ensaio de Formação de Tubos em iPSC-CEs para estudar o papel da endoglina no desenvolvimento vascular

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