Name: Quantificação de Células Proliferativas e Mortas em Enteróides (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Aprenda a quantificar células proliferativas e mortas em enteroides de ileo de camundongo usando citometria de fluxo. Este método permite avaliar efeitos de drogas e citocinas em células epiteliais intestinais.

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Este trabalho é apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (31971062, 31900326 e 31601022), Fundação de CiênciaNatural da Província de Jiangsu (BK20190043, BK20180838), Fundo de Pesquisa do Laboratório Estadual-Chave de Biotecnologia Farmacêutica, Universidade de Nanjing (KF-GN-202004). A Fundação de CiênciaNatural das Instituições de Ensino Superior de Jiangsu da China (19KJB320003), o Programa de Subsistência e Tecnologia da cidade de Suzhou (SYS2019030) e o Programa de Inovação em Pesquisa para Graduados Universitários da Província de Jiangsu (KYCX19-1981) . Este trabalho também é apoiado pela Tang Scholar da Universidade de Soochow.

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Cambridge-Suda Genomic Resource Center (CAM-SU) na Universidade Soochow.
1. Isolamento organoide intestinal e cultura
<ol><li>Isolamento das criptas intestinais e da cultura enteróide<ol>
<li>Eutanize um rato selvagem de 8 semanas com inalação de CO2. Use fórceps de tecido e tesouras de íris finas para dissecar aproximadamente 8 cm de ileum.</li>
		<li>Saia usando uma seringa com agulha de alimentação de gavage com cerca de 40 mL de soro soro tampão de fesfato frio (DPBS), em seguida, corte longitudamente com tesouras e abra o íleum.</li>
		<li>Corte o ileum em pequenas peças (0,5-1,0 cm). Coloque as peças em 5 mL de DPBS frios estéreis em um tubo cônico de 15 mL, em seguida, rocha por 5 min no gelo.</li>
		<li>Use um controlador pipette para aspirar o DPBS e substituí-lo por 10 mL de tampão frio 1 (2 mM EDTA em DPBS). Pedra por 30 min no gelo.</li>
		<li>Use o controlador pipette para aspirar buffer 1 e substitua por 10 mL de tampão frio 2 (54,9 mM D-sorbitol, sacarose de 43,4 mM em DPBS). Agite por 2-3 min à mão (~80 shakes/min).</li>
		<li>Pegue uma gota de 20 μL de conteúdo buffer 2 depois de tremer e inspecione um microscópio.</li>
		<li>Filtrar o conteúdo buffer 2 com um filtro de célula estéril de 70 μm e, em seguida, coletar o buffer filtrado com um tubo cônico de 50 mL.</li>
		<li>Pipette 20 μL de filtragem no slide para contar as criptas. Transfira um volume suficiente de buffer 2 da etapa 1.1.7 para garantir que existam ~500 criptas/bem.</li>
		<li>Gire para baixo a 150 x g por 10 min a 4 °C. Uma vez que a fiação é concluída, cuidadosamente aspirar o supernatant.</li>
		<li>Suspenda as criptas em 50 μL de matriz de membrana do porão (por exemplo, Matrigel) por 500 criptas, pipette para cima e para baixo (tendo o cuidado de evitar bolhas), em seguida, coloque uma gota de 50 μL de matriz de membrana do porão/mistura de cripta no centro de um poço em uma placa de poço de 24. Incubar por 30 min a 37 °C para polimerizar a matriz de membrana do porão.</li>
		<li>Após 30 minutos de polimerização, adicione cuidadosamente 600 μL de mídia minigut (avançado o meio águia modificado de Dulbecco [DMEM]/F12, 2 mM L-alanine-L-glutamina, caneta/estreptococo [100 unidades/mL], 10 mM Hepes, Suplemento N2 [1:100], suplemento B27 [1:50] com fator de crescimento epidérmico [EGF; 50 ng/mL], Noggin [100 ng/mL], R-spondin [500 ng/mL], e Y27632 [10 μM]) para cada poço, em seguida, devolver a placa para a 37 °C/ incubadora C. Observe um microscópio todos os dias, e mude a mídia a cada 2-3 dias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Passaging enteróide NOTA: Para culturas longas, os enteróides devem ser divididos aproximadamente a cada semana.<ol>
<li>Para passar os enteróides, coloque a placa de cultura do tecido no gelo. Aspirar a mídia e adicionar 1 mL de DPBS frio a cada poço. Use uma ponta P1000 para pipette para cima e para baixo até que não restem pedaços sólidos de matriz de membrana do porão.</li>
		<li>Passe para cima e para baixo uma vez através de uma seringa de insulina de 1 mL (27 G) e em um tubo cônico de 15 mL. Gire para baixo por 5 min a 150 x g a 4 °C.</li>
		<li>Use pipeta para remover DPBS. Resuspender em 50 μL de matriz de membrana do porão/bem.</li>
		<li>Coloque a placa em uma incubadora de 37 °C por 30 min para permitir que a matriz de membrana do porão seja polimerizado. Sobreponha cada poço com 600 μL de mídia ENR (mídia de minigut, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL Noggin, 500 ng/mL R-spondin), em seguida, devolva a placa para a incubadora.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Análise de Citometria de Fluxo de Células EdU-positivas em Enteróides
NOTA: A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho para análise de citometria de fluxo de células EdU-positivas em enteróides.
<ol><li>Incubação de enteróides com EdU<ol>
<li>Cresça enteróides da etapa 1.2.4 por 5 a 7 dias. Passagem enteróides em uma nova placa de poço 24 em uma proporção de divisão de 1:2. Adicione 600 μL de meio ENR a cada poço. Incubar enteróides por 4-5 dias em uma incubadora de 37 °C.</li>
		<li>Defina o grupo controle (enteróides não tratados) e o grupo experimental (enteróides tratados com interleucina de 5 ng/mL 22 [IL-22]). Prepare pelo menos três réplicas para cada grupo.</li>
		<li>Adicione EdU ao meio ENR para preparar o meio EdU com uma concentração de 50 μM. Adicione 600 μL de edu médio a cada poço e incuba por 2 h em uma incubadora de 37 °C. Estabeleça um poço de enteróides sem tratamento de UEd como um controle negativo para subtração de fundo.</li>
	</ol></li>
	<li>Colheita de enteróides da matriz de membrana do porão<ol>
<li>Use um controlador pipette para aspirar o meio EdU e lave 1x com DPBS. Adicione 1 mL de DPBS.</li>
		<li>Use ponta de pipeta P1000 e pipeta para cima e para baixo até que não restem pedaços sólidos de matriz de membrana do porão. Transfira para um tubo de 15 mL e gire para baixo a 300 x g por 5 min. Descarte o supernatante.</li>
		<li>Adicione 500 μL de enzimas de dissociação celular(Tabela de Materiais)e incuba por 15 min a 37 °C. Use ponta de pipeta P200 e pipeta para cima e para baixo para quebrar enteróides em células únicas.</li>
		<li>Adicione 3 mL de meio DMEM contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) e repetidamente pipette com uma ponta de pipette P1000.</li>
		<li>Gire para baixo a 300 x g por 5 min e aspirar o meio supernatante. Resuspender as células com 1 mL de DPBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Fixação e permeabilização das células<ol>
<li>Transfira a suspensão celular para um tubo de 1,5 mL, gire para baixo a 300 x g por 5 min e descarte o supernatante.</li>
		<li>Resuspender as células com 1 mL de 4% paraformaldeído (PFA), fixar por 15 min à temperatura ambiente (RT) e girar para baixo a 300 x g por 5 min. Aspirar o supernatante com uma ponta de pipeta, lavar 1x com DPBS, e girar para baixo para remover o supernatante.</li>
		<li>Resuspenda as células com 1 mL de 0,5% de surfactante nonionic. Incubar por 10 min na RT.</li>
		<li>Gire para baixo a 300 x g por 5 min e aspirar o supernatant. Lave 1x com DPBS e gire para baixo para remover o supernatante.</li>
	</ol></li>
	<li>Detecção de EdU<ol>
<li>Prepare soluções de estoque para cada componente com antecedência: 1) solução de trabalho do azide Alexa Fluor, 2) solução de trabalho do buffer de reação 1x EdU e 3) solução de estoque de 10x de aditivo tampão EdU.</li>
		<li>Prepare 1x aditivo tampão EdU diluindo a solução 10x 1:10 em água desionizada. Prepare esta solução de novo.</li>
		<li>Prepare o coquetel de reação de acordo com a Tabela 1. NOTA: Adicione os ingredientes na ordem listada na tabela. Use o coquetel de reação dentro de 15 minutos de preparação.</li>
		<li>Adicione 100 μL de coquetéis de reação a cada tubo de 1,5 mL. Resuspender as células, proteger da luz, incubar por 30 min na RT.</li>
		<li>Centrífuga a 300 x g por 5 min e aspirar a solução de reação com ponta de pipeta suavemente.</li>
		<li>Adicione 0,5% de penetrante surfactante nonionic a cada tubo para lavar 1x na RT. Centrifuge a 300 x g por 5 min, aspirar o supernatante com ponta de pipeette suavemente, e resuspender as células em 1 mL de DPBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise das células por citometria de fluxo<ol>
<li>Filtre as células resuspensas com um filtro de 40 μm e, em seguida, colete as células filtradas com um tubo cônico de 15 mL. Realize a detecção de facs na máquina o mais rápido possível. NOTA: Se as condições forem limitadas, as amostras manchadas de células devem ser armazenadas no escuro a 4 °C e testadas em até 3 dias.</li>
		<li>Selecione o canal apropriado (de acordo com o tipo de Azide Alexa Fluor no kit EdU; aqui, canal vermelho) e tensão (aqui, ~150-350 V) para análise de citometria de fluxo.</li>
		<li>Estratégia gating<ol>
<li>Desenhe um gráfico pseudocolor FSC-A (eixo x) vs. SSC-A (eixo y) e distribua a maioria das células para a faixa visível do mapa de pontos ajustando a tensão. Selecione a população celular (R1) e exclua os detritos celulares no canto inferior esquerdo.</li>
			<li>A partir da população celular R1, estabeleça um FSC-A (eixo x) vs. FSC-H (eixo y) pseudocolor, e definir o portão para selecionar células únicas (R2) para excluir aglomerados celulares.</li>
			<li>A partir da população celular R2, estabeleça a intensidade da fluorescência (eixo x) vs. enredo de número de celular (eixo y) e use o controle negativo para definir o portão. A região do sinal fluorescente é uma região celular positiva (R3). Compare a proporção de células EdU-positivas (R3) entre os grupos experimentais e de controle.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. Análise de Citometria de Fluxo de Células PI-positivas em Enteróides
NOTA: A figura 2 mostra o fluxo de trabalho para análise de citometria de fluxo de células PI-positivas em enteróides.
<ol><li>Incubação de células enteróides com PI<ol>
<li>Cresça enteróides da etapa 1.2.4 por 5 a 7 dias. Passagem enteróides em uma nova placa de poço 24 em uma proporção de divisão de 1:2. Adicione 600 μL de meio ENR a cada poço. Incubar enteróides por 4-5 dias em uma incubadora de 37 °C.</li>
		<li>Defina o grupo controle (não tratado) e o grupo experimental (tratado IL-22), usando pelo menos três réplicas para cada grupo.</li>
		<li>Adicione PI ao meio ENR para preparar o meio PI com uma concentração de 3 μM.</li>
		<li>Adicione 600 μL de pi médio a cada poço e incuba por 30 min em uma incubadora de 37 °C. Estabeleça um poço de enteróides sem tratamento de PI como um controle negativo para subtração de fundo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Colher enteróides da matriz de membrana do porão seguindo as etapas 2.2.1-2.2.5.</li>
	<li>Análise das células por citometria de fluxo<ol>
<li>Filtre as células resuspensas com um filtro de 40 μm e colete as células filtradas com um tubo cônico de 15 mL.</li>
		<li>Realize a detecção de facs na máquina o mais rápido possível. NOTA: Se as condições forem limitadas, as amostras manchadas de células devem ser armazenadas no escuro a 4 °C e testadas em até 3 dias.</li>
		<li>Selecione o canal apropriado (aqui, canal vermelho) e tensão (aqui, ~150-350 V) para análise de citometria de fluxo.</li>
		<li>Use a mesma estratégia de gating descrita na seção 2.5.3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+epithelial+barrier%3A+a+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target.</a> Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).</li>
<li>Buckley, A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Biology+of+Tight+Junction+Barrier+Regulation+and+Mucosal+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).</li>
<li>Gehart, H., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tales+from+the+crypt%3A+new+insights+into+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells.</a> Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).</li>
<li>Vancamelbeke, M., Vermeire, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+barrier%3A+a+fundamental+role+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease.</a> Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).</li>
<li>Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+Intestinal+Epithelial+Cell+RIPK+Pathways+Promotes+Chronic+Inflammation+in+the+IBD+Gut%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1094(2019).</li>
<li>Li, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+and+In+Vivo+Approaches+to+Determine+Intestinal+Epithelial+Cell+Permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57032(2018).</li>
<li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).</li>
<li>Graham, W. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+MLCK1+diversion+reverses+barrier+loss+to+restore+mucosal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis.</a> Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).</li>
<li>Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+Networks+in+the+Pathophysiology+of+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease.</a> Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).</li>
<li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+22+Expands+Transit-Amplifying+Cells+While+Depleting+Lgr5+Stem+Cells+via+Inhibition+of+Wnt+and+Notch+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo detalha as etapas necessárias para a cultura de enteróides in vitro e quantificação de células EdU e PI-positivas nos enteróides por citometria de fluxo. Há várias vantagens dessa estratégia. Primeiro, a rotulagem EdU é usada para detectar células proliferadoras em enteróides. Em comparação com o ensaio tradicional da BrdU, o método de rotulagem EdU é mais rápido, mais sensível e mais preciso. EdU é muito semelhante à timina (T), que substitui a timina na síntese de DNA durante a divisão celular. Em compar...

Uma função fundamental das células epiteliais intestinais é proteger a entrada de conteúdos luminários como bactérias patogênicas e toxinas1,2. Para realizar tal função, as células-tronco intestinais proliferam e se diferenciam continuamente em uma variedade de células epiteliais, incluindo enterócitos e células secretas, que formam uma barreira formando conexões apertadas3. A rápida renovação das células epiteliais intestinais requer coordenação rigorosa da proliferação celular, diferenciação celular e morte celular4,5. A redução da proliferação celular ou a morte celular excessiva leva a danos epiteliais e a função de barreira comprometida1,6. A disfunção da barreira intestinal tem sido associada a doenças inflamatórias intestinais7,8.
Um método para cultivar criptas intestinais foi desenvolvido anteriormente. Usando essa técnica, as criptas de camundongos isolados crescem em organoides intestinais (enteróides), que possuem criptosas como estruturas e contêm toda a linhagem celular epitelial intestinal9,10. 5-Etilnyl-2'-deoxyuridina (EdU) é um analógico de timmidina capaz de substituir a timina (T) no DNA que está passando por replicação durante a proliferação celular. As células proliferativas podem ser rotuladas de forma rápida e precisa pela coloração de EdU. Propidium iodeto (PI) é um análogo de brometo de etídio que libera fluorescência vermelha após inserção em DNA de dupla cadeia. Pi detecta especificamente células mortas, uma vez que só passa pela membrana celular danificada.
Neste protocolo, primeiro descrevemos como isolar criptas do intestino delgado murina e depois cultimá-las como enteróides in vitro. Descrevemos então como analisar as células proliferativas e mortas em enteróides por incorporação e citometria de fluxo da EdU e PI.

<table><tbody><tr><td>Tubo de centrífuga de 15 ml</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>agulha de gavagem de 22 G</td><td>VWR</td><td>20068-608</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 poços</td><td>Nunc</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células estéreis de 40 mm</td><td>BD 352340</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 50 ml</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células estéreis de 70 mm</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Citômetro de foco acústico avançado DMEM / F-12</td><td>GIBCO</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT</td><td>Invitrogen</td><td>A24863</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplemento</td><td>GIBCO</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> 1 <td>2 mM EDTA em DPBS</td></tr><tr><td>Buffer 2</td><td></td><td></td><td>54,9 mM D-sorbitol, 43,4 mM de sacarose em camundongos</td></tr> <tr><td></td><td>DPBS C57 / B6Instituto de Pesquisa Biomédica de Nanjing da Universidade</td><td></td><td></td>de Nanjing</tr><tr><td>Enzimas de dissociação celular (TrypLE)</td><td>Life technologies</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Kit de imagem</td><td>Life tecnologias</td><td>C10639</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de CO2</td><td>Panasonic</td><td>MCO-18AC</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO</td><td></td><td></td></tr> 14190144 <tr><td>D-sorbitol</td><td>BBI</td><td>SB0491</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BBI</td><td>EB0185</td><td></td></tr><tr><td>ENR media</td><td></td><td></td><td>Minigut, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de Íris Fina</td><td>Tansoole</td><td>2037454</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de Fluorescência</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Suplemento</td><td>GIBCO</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Soro de Cabra</td><td>Life technologies</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>HDMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30243.01B</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Minigut media</td><td></td><td></td><td>DMEM/F12 avançado, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 unidades/ml), 10 mM Hepes, suplemento N2 (1:100), suplemento B27 (1:50)</td></tr><tr><td>Suplemento N2</td><td>R& D</td><td>AR009</td><td></td></tr><tr><td>Surfactante não iônico (Triton X)</td> <td>BBI</td><td>TB0198-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de operação (12,5 cm)</td> <td>Tansoole</td><td>2025785</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td> <td>sigma</td><td>158127-500g</td><td></td></tr><tr><td>Penn /</td><td>Strep Invitrogen</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de contraste de fase</td><td>Nikon</td><td>TS1000</td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de propídio</td><td>Sigma</td><td>P4170-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinante EGF</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>Recombinante Mouse Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Recombinante Mouse R-Spondin 1</td><td>R& D</td><td>3474-RS-050</td><td></td></tr><tr><td>Murino Recombinante IL-22</td><td>PeproTech</td><td>210-22-10</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>BBI</td><td>SB0498</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps de Tecido</td><td>Tansoole</td><td>2026704</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 2HC1</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificação de células proliferativas e mortas em enteróides

Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids

O epitélio intestinal atua como uma barreira que impede a entrada de conteúdo luminal, como microbiota patogênica e toxinas, de entrar no resto do corpo. A função da barreira epitelial requer a integridade das células epiteliais intestinais. Enquanto a proliferação de células epiteliais mantém uma camada contínua de células que forma uma barreira, danos epiteliais levam à disfunção da barreira. Como resultado, o conteúdo luminal pode atravessar a barreira intestinal através de uma via irrestrita. A disfunção da barreira intestinal tem sido associada a muitas doenças intestinais, como doença inflamatória intestinal. As criptas intestinais de camundongos isolados podem ser cultivadas e mantidas como estruturas semelhantes a criptografia, que são chamadas de organoides intestinais ou "enteróides". Os enteróides são ideais para estudar a proliferação e a morte celular de células epiteliais intestinais in vitro. Neste protocolo, descrevemos um método simples para quantificar o número de células proliferativas e mortas em enteróides cultivados. 5-etilôndeus-2'-desoxuridina (EdU) e iodeto de propídio são usados para rotular células proliferantes e mortas em enteróides, e a proporção de proliferação e células mortas são então analisadas por citometria de fluxo. Esta é uma ferramenta útil para testar os efeitos do tratamento medicamentoso na proliferação de células epiteliais intestinais e na sobrevivência celular.

Pequenas criptas intestinais foram isoladas e cultivadas como enteróides na matriz de membrana do porão. Os enteróides começaram a formar brotos 2 dias após o isolamento. No 6º dia, os enteróides tinham muitos botões com muitos detritos (células mortas) no lúmen. Os enteróides estavam prontos para serem passagens nesta fase (Figura 3).
Inúmeros estudos têm demonstrado que citocinas inflamatórias são essenciais para a manutenção da homeostase epitelial intestinal. ...

O protocolo apresentado utiliza citometria de fluxo para quantificar o número de células proliferantes e mortas em enteróides de camundongos cultivados. Este método é útil para avaliar os efeitos do tratamento medicamentoso sobre a proliferação organoide e a sobrevivência.

Quantificação de Células Proliferativas e Mortas em Enteróides

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. ...

Este protocolo é útil para o isolamento enteróide em uma cultura, além de investigar a proliferação celular e a sobrevivência em enteróides. Os cientistas podem aplicar essa técnica aos enteróides de cultura e estudar o efeito de drogas e citocinas inflamatórias em células epiteliais intestinais in vitro. As implicações dessa técnica se estendem à terapia hídrica de doença inflamatória intestinal.Aplicamos este método para encontrar algumas citocinas terapêuticas. Este método fornece insights sobre a proliferação epitelial intestinal e a sobrevivência; além disso, também pode ser usado em organoides, cultivados em torno de tecidos diferentes do intestino. Para isolar as criptas intestinais e realizar a cultura enteróide, use fórceps teciduais e encontre tesouras de íris para dissecar aproximadamente oito centímetros de íleo de um rato de oito semanas de idade.Use uma seringa com uma agulha de alimentação de gavage para lavar o íleo com cerca de 40 mililitros de salina fosfato de Dulbecco, depois corte longitudinalmente com uma tesoura e abra o íleo. Corte o íleo em pequenos pedaços e coloque-os em cinco mililitros de DPBS gelado estérei em um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, balance a amostra por cinco minutos no gelo.Use um controlador de pipeta para aspirar o DPBS e substituí-lo por 10 mililitros de tampão frio. Depois de balançar por 30 minutos no gelo, use o controlador de pipeta para aspirar um tampão e substituir por 10 mililitros de tampão frio dois. Em seguida, agite por dois a três minutos à mão a aproximadamente 80 shakes por minuto.Depois de tremer, inspecione uma gotícula de vinte litros de buffer dois conteúdos sob um microscópio para garantir que haja criptas com células de Paneth granulares. Filtrar o tampão dois conteúdos com um coador de células estéreis de 70 mícrons e coletar o buffer filtrado em um tubo cônico de 50 mililitros. Pipeta 20 microliters de filtrado no slide para contar as criptas.Transfira um volume suficiente do buffer filtrado de dois conteúdos para garantir que haja aproximadamente 500 criptas por poço. Gire a 150 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius, e depois aspire cuidadosamente o supernascida. Resuspend as criptas em 50 microliters de matriz de membrana por porão por 500 criptas.Pipeta para cima e para baixo tomando cuidado para evitar bolhas. Coloque uma gota de 50 microliter de matriz de membrana de porão e mistura de cripta no centro de um poço de uma placa de 24 poços. Incubar por 30 minutos a 37 graus Celsius para polimerizar a matriz de membrana do porão.Após 30 minutos de polimerização, adicione cuidadosamente 600 microliters de minigut mídia a cada poço. Retorne a placa para a incubadora Celsius de 37 graus, e observe sob um microscópio todos os dias, mudando a mídia a cada dois ou três dias. Para passar os enteróides, coloque a placa de cultura tecidual no gelo, aspire a mídia e adicione um mililitro de DPBS frio a cada poço.Use uma ponta P1000 para pipeta para cima e para baixo até que não restem pedaços de matriz. Passe a amostra através de uma seringa de insulina de um mililitro e para baixo em um tubo cônico de 15 mililitros. Depois de girar por cinco minutos a 150 vezes G e quatro graus Celsius, use uma pipeta para remover o DPBS.Suspenda os enteróides em 50 microliters da matriz de membrana do porão por poço. Coloque a placa na incubadora Celsius de 37 graus por 30 minutos para permitir que a matriz de membrana do porão polimerize. Em seguida, sobreponha cada poço com 600 microliters de mídia ENR e devolva a placa para a incubadora.Cresça enteroids por cinco a sete dias antes de passá-los em uma nova placa de 24 poços usando uma proporção de divisão de um a dois. Adicione 600 microliters de meio ENR para cada poço e, em seguida, incubar os enteróides por quatro a cinco dias na incubadora de 37 graus Celsius. Configure o grupo controle de enteróides não tratados e o grupo experimental de enteróides tratados com cinco nanogramas por mililitro de interleucina-22.Prepare pelo menos três réplicas para cada grupo. Adicione 600 microliters de meio EdU a cada poço de enteróides, exceto um bem para usar como controle negativo para subtração de fundo. Incubar a placa por duas horas em uma incubadora de 37 graus celsius.Para colher enteróides da matriz de membrana do porão, use um controlador de pipeta para aspirar o meio EdU e lavar uma vez com DPBS. Em seguida, adicione um mililitro de DPBS. Use uma ponta de pipeta P1000 para pipeta para cima e para baixo até que não permaneçam pedaços sólidos da matriz da membrana do porão.Transfira a amostra para um tubo de 15 mililitros e gire a 300 vezes G durante cinco minutos antes de descartar o supernasal. Adicione 500 microliters de enzimas de dissociação celular e incubar por 15 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, use uma ponta de pipeta P200 para pipeta para cima e para baixo e quebrar enteroids em células únicas.Em seguida, adicione três mililitros do Meio Águia Modificada de Dulbecco contendo soro bovino 10% fetal, e pipeta repetidamente com uma ponta de pipeta P1000. Depois de centrifugar a 300 vezes G por cinco minutos, e aspirar o supernante, suspendemos as células em um mililitro de DPBS. Para realizar a fixação e permeabilização das células, primeiro transfira a suspensão celular para um tubo de um ponto cinco mililitros, gire a 300 vezes G por cinco minutos e descarte o supernasce.Suspendemos as células em um mililitro de 4% de paraformaldeído e fixamos por 15 minutos em temperatura ambiente. Depois de centrifugar a 300 vezes G por cinco minutos, aspire o supernatante com uma ponta de pipeta. Lave as células uma vez com o DPBS e gire novamente para remover o supernatante.Resuspengue as células com um mililitro de surfactante não iônico de 0,5%, e incuba por 10 minutos em temperatura ambiente antes de lavar as células com DPBS como antes. Para detectar o EdU, adicione 100 microliters de coquetel de reação a cada tubo de 1,5 mililitro. Resuspend as células, e protegendo-as da luz, incubar por 30 minutos em temperatura ambiente.Depois de centrifugar a 300 vezes G por cinco minutos, aspire suavemente a solução de reação com uma ponta de pipeta Adicione penetrante surfactante 0,5% não iônico a cada tubo para lavar uma vez à temperatura ambiente. Após a centrifugação como antes, suspendemos as células em um mililitro de DPBS. Filtre as células resuspended com um coador de 40 mícrons e colete as células filtradas em um tubo cônico de 15 mililitros.Realize os fatos na detecção da máquina o mais rápido possível. Selecione o canal e a tensão apropriados para análise de citometria de fluxo. Para a estratégia de gating, desenhe uma trama pseudocolorida FSC-A versus SSC-A e distribua a maioria das células para a faixa visível do mapa de pontos ajustando a tensão.Selecione a população celular como R1 e exclua os detritos celulares no canto inferior esquerdo. Da população celular R1, estabeleça um gráfico pseudocolor FSC-A versus FSC-H. Defina o portão para selecionar células únicas designadas como R2 e exclua aglomerados de células.A partir da população celular R2, estabeleça a intensidade de fluorescência versus o enredo do número celular e use o controle negativo para definir o portão. A região do sinal fluorescente é uma região celular positiva designada R3.Compare a razão dessas células positivas da EdU entre os grupos experimental e de controle. Pequenas criptas intestinais foram isoladas e cultivadas como enteróides na matriz de membrana do porão.Enteroids começaram a formar botões dois dias após o isolamento. No sexto dia, os enteróides tinham muitos botões com muitos detritos no lúmen. Os enteróides estavam prontos para serem aprovados nesta fase.Os enteróides foram tratados com IL-22 por 3 dias, após o qual o DNA sintético foi rotulado com EdU em vermelho para indicar a proliferação celular. Os enteróides tratados il-22 apresentaram um número aumentado de células positivas da EdU. O IL-22 aumentou as células proliferadoras de 40,1% para 83,5%, conforme analisado pela citometria de fluxo.O tratamento il-22 também aumentou a morte celular em enteróides indicados pela coloração de iodeto de propídio em vermelho. O IL-22 aumentou as células mortas de 4,9% para 16,2%, conforme analisado pela citometria de fluxo. Durante o progresso do isolamento da cripta é necessário um tremor justo depois de adicionar buffer para garantir que criptas suficientes sejam abaladas.Aconselhamos inspecionar conteúdos sob microscópio. Após este procedimento, também podemos quantificar os tipos e enteróides epiteliais diferenciados usando específicos Este método ajudará os pesquisadores a investigar a diferenciação epitelial intestinal em enteróides. Após seu desenvolvimento, essa questão abre caminho para pesquisadores do campo da gastroenterologia explorarem as questões desenvolvimentismo ou patológica no corte.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Descrevemos um método para estabelecer enteróides humanos a partir de criptas do intestino delgado e colonóides a partir de criptas do cólon coletadas de tecido cirúrgico e biópsias. Neste artigo metodológico, apresentamos as modalidades de cultura que são essenciais para o crescimento e manutenção bem-sucedidos de enteróides e colonóides humanos.

Estabelecimento de epiteliais humanas Enteroids e Colonoids de tecido inteiro e biópsia

Enteroids estão emergindo como um novo modelo no estudo de doenças humanas. O protocolo descreve como simular um modelo enteroid de humano enterocolite necrosante usando lipopolissacarídeo (LPS) tratamento do enteroids gerados a partir de tecido neonatal. Enteroids coletados demonstram alterações inflamatórias parecido com aqueles vistos em enterocolite necrosante humana.

Um novo modelo Enteroid epitelial humana de enterocolite necrosante

Este protocolo descreve a geração de spheroids paciente-derivados, e a análise a jusante que inclui a quantificação da proliferação, do teste da citotoxicidade, da citometria do fluxo, da coloração da imunofluorescência e da imagem latente confocal, a fim avaliar a medicina potencial dos candidatos como terapêutica antineoplásica. Este protocolo suporta a medicina da precisão com identificação de drogas específicas para cada paciente e estágio da doença.

Spheroids 3D derivados do paciente fisiológico para a seleção antineoplástica da droga para alvejar pilhas de haste do cancro

Este protocolo descreve um modelo de enterocolite necrosante a apical (NEC)-in-a-dish utilizando pequenos enteróides intestinais com polaridade invertida, permitindo o acesso à superfície apical. Fornecemos um protocolo de coloração imunofluorescente para detectar interrupção epitelial relacionada à NEC e um método para determinar a viabilidade de enteróides apical-out submetidos ao protocolo NEC-in-a-dish.

In vitro Modelo enteróide apical-out de enterocolite necrotizante

Este protocolo detalha o estabelecimento de enteróides, um modelo intestinal tridimensional, a partir do tecido intestinal fetal. Imagens imunofluorescentes de biomarcadores epiteliais foram utilizadas para caracterização do modelo. A exposição apical de lipopolissacarídeos, uma endotoxina bacteriana, utilizando a técnica de microinjeção induziu a permeabilidade epitelial de forma dose-dependente medida pelo vazamento de dextrano fluorescente.

Testando a permeabilidade epitelial em enteroides derivados de tecido fetal

Este protocolo descreve um modelo in vitro de enterocolite necrosante (ECN), que pode ser usado para estudos mecanísticos da patogênese da doença. Apresenta um chip microfluídico semeado com enteróides intestinais derivados do intestino neonatal humano, células endoteliais e o microbioma intestinal de um neonato com ECN grave.

Modelo Microfluídico de Enterocolite Necrosante Incorporando Enteróides Intestinais Neonatais Humanos e um Microbioma Disbiótico

Os enteróides estão emergindo como um novo modelo para o estudo da fisiologia e fisiopatologia tecidual, desenvolvimento de drogas e medicina regenerativa. Aqui, descrevemos um sistema de cultura 2D derivado de enteróides de células primárias bovinas que permite o co-cultivo com tipos de células teciduais relevantes. Este modelo oferece uma vantagem translacional para a modelagem de pesquisa gastrointestinal.

Geração de um Sistema de Cultura Bidimensional Monocamada Derivada de Enteróides Bovinos Primários para Aplicações em Pesquisa Biomédica Translacional

Este protocolo descreve um método simples e econômico para investigar e quantificar a morte celular em organoides colônicos humanos em resposta a perturbações citotóxicas, como citocinas. A abordagem emprega um corante de morte celular fluorescente (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), microscopia de fluorescência ao vivo e software de análise de imagem de código aberto para quantificar as respostas de um único organoide a estímulos citotóxicos.

Quantificação da morte celular induzida por citocinas em organoides colônicos humanos usando microscopia de fluorescência ao vivo

Este estudo descreve um protocolo para gerar monocamadas 2D de organoides suínos derivados dos intestinos delgado e grosso. O crescimento dessas monocamadas é marcado pelo aumento dos valores de TEER, indicando integridade epitelial robusta. Além disso, essas monocamadas exibem respostas secretoras fisiológicas em experimentos de câmara de Ussing após a aplicação de forscolina.

Organoides intestinais suínos bidimensionais refletindo as propriedades fisiológicas do intestino nativo

Aqui, descrevemos um protocolo para gerar organoides intestinais apicais a partir de culturas organoides incorporadas à matriz padrão. Ele também descreve a incorporação subsequente de EdU em células de proliferação ativa e a quantificação semiautomática de células EdU-positivas.

Geração de organoides intestinais apicais e avaliação da taxa de proliferação de organoides usando marcação EdU

Aprenda a quantificar células proliferativas e mortas em enteroides de ileo de camundongo usando citometria de fluxo. Este método permite avaliar efeitos de drogas e citocinas em células epiteliais intestinais.

Quantificação de Células Proliferativas e Mortas em Enteróides

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