Quantificação de Células Proliferativas e Mortas em Enteróides

Este protocolo é útil para o isolamento enteróide em uma cultura, além de investigar a proliferação celular e a sobrevivência em enteróides. Os cientistas podem aplicar essa técnica aos enteróides de cultura e estudar o efeito de drogas e citocinas inflamatórias em células epiteliais intestinais in vitro. As implicações dessa técnica se estendem à terapia hídrica de doença inflamatória intestinal.

Aplicamos este método para encontrar algumas citocinas terapêuticas. Este método fornece insights sobre a proliferação epitelial intestinal e a sobrevivência; além disso, também pode ser usado em organoides, cultivados em torno de tecidos diferentes do intestino. Para isolar as criptas intestinais e realizar a cultura enteróide, use fórceps teciduais e encontre tesouras de íris para dissecar aproximadamente oito centímetros de íleo de um rato de oito semanas de idade.

Use uma seringa com uma agulha de alimentação de gavage para lavar o íleo com cerca de 40 mililitros de salina fosfato de Dulbecco, depois corte longitudinalmente com uma tesoura e abra o íleo. Corte o íleo em pequenos pedaços e coloque-os em cinco mililitros de DPBS gelado estérei em um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, balance a amostra por cinco minutos no gelo.

Use um controlador de pipeta para aspirar o DPBS e substituí-lo por 10 mililitros de tampão frio. Depois de balançar por 30 minutos no gelo, use o controlador de pipeta para aspirar um tampão e substituir por 10 mililitros de tampão frio dois. Em seguida, agite por dois a três minutos à mão a aproximadamente 80 shakes por minuto.

Depois de tremer, inspecione uma gotícula de vinte litros de buffer dois conteúdos sob um microscópio para garantir que haja criptas com células de Paneth granulares. Filtrar o tampão dois conteúdos com um coador de células estéreis de 70 mícrons e coletar o buffer filtrado em um tubo cônico de 50 mililitros. Pipeta 20 microliters de filtrado no slide para contar as criptas.

Transfira um volume suficiente do buffer filtrado de dois conteúdos para garantir que haja aproximadamente 500 criptas por poço. Gire a 150 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius, e depois aspire cuidadosamente o supernascida. Resuspend as criptas em 50 microliters de matriz de membrana por porão por 500 criptas.

Pipeta para cima e para baixo tomando cuidado para evitar bolhas. Coloque uma gota de 50 microliter de matriz de membrana de porão e mistura de cripta no centro de um poço de uma placa de 24 poços. Incubar por 30 minutos a 37 graus Celsius para polimerizar a matriz de membrana do porão.

Após 30 minutos de polimerização, adicione cuidadosamente 600 microliters de minigut mídia a cada poço. Retorne a placa para a incubadora Celsius de 37 graus, e observe sob um microscópio todos os dias, mudando a mídia a cada dois ou três dias. Para passar os enteróides, coloque a placa de cultura tecidual no gelo, aspire a mídia e adicione um mililitro de DPBS frio a cada poço.

Use uma ponta P1000 para pipeta para cima e para baixo até que não restem pedaços de matriz. Passe a amostra através de uma seringa de insulina de um mililitro e para baixo em um tubo cônico de 15 mililitros. Depois de girar por cinco minutos a 150 vezes G e quatro graus Celsius, use uma pipeta para remover o DPBS.

Suspenda os enteróides em 50 microliters da matriz de membrana do porão por poço. Coloque a placa na incubadora Celsius de 37 graus por 30 minutos para permitir que a matriz de membrana do porão polimerize. Em seguida, sobreponha cada poço com 600 microliters de mídia ENR e devolva a placa para a incubadora.

Cresça enteroids por cinco a sete dias antes de passá-los em uma nova placa de 24 poços usando uma proporção de divisão de um a dois. Adicione 600 microliters de meio ENR para cada poço e, em seguida, incubar os enteróides por quatro a cinco dias na incubadora de 37 graus Celsius. Configure o grupo controle de enteróides não tratados e o grupo experimental de enteróides tratados com cinco nanogramas por mililitro de interleucina-22.

Prepare pelo menos três réplicas para cada grupo. Adicione 600 microliters de meio EdU a cada poço de enteróides, exceto um bem para usar como controle negativo para subtração de fundo. Incubar a placa por duas horas em uma incubadora de 37 graus celsius.

Para colher enteróides da matriz de membrana do porão, use um controlador de pipeta para aspirar o meio EdU e lavar uma vez com DPBS. Em seguida, adicione um mililitro de DPBS. Use uma ponta de pipeta P1000 para pipeta para cima e para baixo até que não permaneçam pedaços sólidos da matriz da membrana do porão.

Transfira a amostra para um tubo de 15 mililitros e gire a 300 vezes G durante cinco minutos antes de descartar o supernasal. Adicione 500 microliters de enzimas de dissociação celular e incubar por 15 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, use uma ponta de pipeta P200 para pipeta para cima e para baixo e quebrar enteroids em células únicas.

Em seguida, adicione três mililitros do Meio Águia Modificada de Dulbecco contendo soro bovino 10% fetal, e pipeta repetidamente com uma ponta de pipeta P1000. Depois de centrifugar a 300 vezes G por cinco minutos, e aspirar o supernante, suspendemos as células em um mililitro de DPBS. Para realizar a fixação e permeabilização das células, primeiro transfira a suspensão celular para um tubo de um ponto cinco mililitros, gire a 300 vezes G por cinco minutos e descarte o supernasce.

Suspendemos as células em um mililitro de 4% de paraformaldeído e fixamos por 15 minutos em temperatura ambiente. Depois de centrifugar a 300 vezes G por cinco minutos, aspire o supernatante com uma ponta de pipeta. Lave as células uma vez com o DPBS e gire novamente para remover o supernatante.

Resuspengue as células com um mililitro de surfactante não iônico de 0,5%, e incuba por 10 minutos em temperatura ambiente antes de lavar as células com DPBS como antes. Para detectar o EdU, adicione 100 microliters de coquetel de reação a cada tubo de 1,5 mililitro. Resuspend as células, e protegendo-as da luz, incubar por 30 minutos em temperatura ambiente.

Depois de centrifugar a 300 vezes G por cinco minutos, aspire suavemente a solução de reação com uma ponta de pipeta Adicione penetrante surfactante 0,5% não iônico a cada tubo para lavar uma vez à temperatura ambiente. Após a centrifugação como antes, suspendemos as células em um mililitro de DPBS. Filtre as células resuspended com um coador de 40 mícrons e colete as células filtradas em um tubo cônico de 15 mililitros.

Realize os fatos na detecção da máquina o mais rápido possível. Selecione o canal e a tensão apropriados para análise de citometria de fluxo. Para a estratégia de gating, desenhe uma trama pseudocolorida FSC-A versus SSC-A e distribua a maioria das células para a faixa visível do mapa de pontos ajustando a tensão.

Selecione a população celular como R1 e exclua os detritos celulares no canto inferior esquerdo. Da população celular R1, estabeleça um gráfico pseudocolor FSC-A versus FSC-H. Defina o portão para selecionar células únicas designadas como R2 e exclua aglomerados de células.

A partir da população celular R2, estabeleça a intensidade de fluorescência versus o enredo do número celular e use o controle negativo para definir o portão. A região do sinal fluorescente é uma região celular positiva designada R3.Compare a razão dessas células positivas da EdU entre os grupos experimental e de controle. Pequenas criptas intestinais foram isoladas e cultivadas como enteróides na matriz de membrana do porão.

Enteroids começaram a formar botões dois dias após o isolamento. No sexto dia, os enteróides tinham muitos botões com muitos detritos no lúmen. Os enteróides estavam prontos para serem aprovados nesta fase.

Os enteróides foram tratados com IL-22 por 3 dias, após o qual o DNA sintético foi rotulado com EdU em vermelho para indicar a proliferação celular. Os enteróides tratados il-22 apresentaram um número aumentado de células positivas da EdU. O IL-22 aumentou as células proliferadoras de 40,1% para 83,5%, conforme analisado pela citometria de fluxo.

O tratamento il-22 também aumentou a morte celular em enteróides indicados pela coloração de iodeto de propídio em vermelho. O IL-22 aumentou as células mortas de 4,9% para 16,2%, conforme analisado pela citometria de fluxo. Durante o progresso do isolamento da cripta é necessário um tremor justo depois de adicionar buffer para garantir que criptas suficientes sejam abaladas.

Aconselhamos inspecionar conteúdos sob microscópio. Após este procedimento, também podemos quantificar os tipos e enteróides epiteliais diferenciados usando específicos Este método ajudará os pesquisadores a investigar a diferenciação epitelial intestinal em enteróides. Após seu desenvolvimento, essa questão abre caminho para pesquisadores do campo da gastroenterologia explorarem as questões desenvolvimentismo ou patológica no corte.