Integração de abordagens de bioinformática e validações experimentais para entender o papel da sinalização de notch no câncer de ovário
January 12th, 2020
A bioinformática é uma maneira útil de processar conjuntos de dados em larga escala. Através da implementação de abordagens de bioinformática, os pesquisadores podem obter aplicações perspicazes e de forma eficiente e de forma rápida. Este artigo demonstra a utilização da bioinformática na pesquisa do câncer de ovário. Ele também valida com sucesso os achados de bioinformática através da experimentação.
Bioinformática é uma maneira útil de extrair informações de conjuntos de dados. A experimentação é igualmente importante para validação. Combinamos ambas as abordagens para investigar o papel da sinalização de entalhe no câncer de ovário.
A principal vantagem dessa técnica é que os pesquisadores podem utilizar as informações das bases de dados de bioinformática para planejar sua direção de pesquisa antes de realizar um experimento. Com dados bioinforáticos acumulados de doenças humanas, os cientistas não estão mais vendados. A experimentação pode ser realizada para validar achados específicos, o que pode levar a terapias melhoradas ou diagnóstico de doenças.
Para analisar meta-A a associação de um gene de interesse com um tipo específico de câncer, crie uma conta com um endereço de e-mail afiliado ao acadêmico para acessar o banco de dados PRECOG e digite o endereço de e-mail e senha associados à conta no terminal de login. Clique em Exibir detalhes e insira o gene de interesse na barra de pesquisa. Em seguida, use a barra de rolagem para obter a pontuação Z de sobrevivência para o tipo específico de câncer de interesse.
Para investigar a associação entre os níveis de expressão genética e os estágios de câncer de ovário, navegue até a página web do CSIOVDB e insira o nome do gene de interesse na barra de pesquisa. Em seguida, clique na guia Sobrevivência. Para avaliar os dados de expressão genética em diferentes tecidos diversos, normais e tumorais, navegue até o portal GENT e clique na guia Pesquisar.
Na seção palavra-chave, selecione o símbolo genético para os termos do menu suspenso, insira o símbolo do gene do gene de interesse e selecione Tecido para a opção tipo. Clique no botão Pesquisar. Gráficos sumários da expressão genética em tecidos normais e tumorais de diferentes tipos de câncer, baseados nas plataformas U133A e U122 Plus 2 serão exibidos.
Em seguida, clique no link De Download de Dados de Resultados para acessar as informações detalhadas sobre os valores de expressão genética, tipos de tecido e fontes de dados. Para procurar alterações genéticas e redes de sinalização, abra a página web do portal do CBIO e use a consulta na página de entrada, clique nos órgãos ou tecidos de interesse na seção Selecionar estudos, selecione o estudo particular de interesse e clique em Consulta por Gene. Na seção Select Genomic Profiles, selecione as mutações, alterações de número de cópias putativas da opção GISTIC ou de expressão mRNA.
Selecione os dados correspondentes no menu Selecionar nomeia paciente/caso e insira os símbolos de gene de destino na caixa de consulta de Enter Genes. Clique no botão Enviar consulta e abra a guia Rede para recuperar a rede genética desejada. Em seguida, clique na guia Arquivo e selecione Salvar Como Imagem PNG para download de imagens de rede.
Para criar moscas com NICD ou NICD e superexpressão de mam, prepare os estoques de moscas apropriados e aplique a técnica de segmentação de expressão genética temporal e regional para controlar a expressão genética espacial, de acordo com os protocolos padrão. Levante as moscas a 18 graus Celsius até a idade adulta, antes de mudar para 29 graus Celsius com levedura por 48 horas. No final da incubação de 29 graus Celsius, adicione três mililitros de PBS a um prato de coleta de embriões, e anestesia a cultura da mosca com uma almofada de dióxido de carbono.
Use um microscópio dissecando para identificar uma mosca fêmea anestesiada, e use um par de fórceps dissecando para pegar cuidadosamente o tórax inferior da mosca. Submergir a mosca na PBS dentro do prato de coleta de embriões, e use um segundo par de fórceps para beliscar o abdômen inferior, puxando suavemente para liberar os órgãos internos. Localize e desprende o par de ovários do corpo da mosca, e quebre a baanha muscular, localizada na extremidade posterior dos ovários, para separar os ovários.
Em seguida, coloque os ovários isolados em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro, contendo 500 microliters de PBS no gelo. Quando todos os ovários tiverem sido coletados, substitua o PBS por 500 microlitres de 4% de formaldeído e coloque o tubo em um nutador por 10 minutos. Ao final da incubação, descarte o fixador e lave os ovários com três enxaguas de 15 minutos em um mililitro de PBT por lavagem.
Após a última lavagem, rotule os ovários com 150 microliters de 10 microgramas por DAPI mililitro por mililitro por 10-15 minutos no nutador. No final da incubação, lave os ovários uma vez por 10 minutos com um mililitro de PBT, seguido por duas lavagens de 10 minutos em PBS. Após a segunda lavagem, remova todos, exceto os últimos 300 microliters da PBS, e use uma ponta de pipeta de 200 microliteres para triterar os ovários várias vezes para liberar as câmaras de ovos.
Em seguida, sedimentar suavemente o tecido ovariano através de um giro rápido em um microcentrifuuge, e remover o máximo de PBS possível sem perturbar a pelota de ovário. Usando uma ponta de pipeta de 1.000 microliteres, transfira cerca de três gotas de solução de montagem para o tubo, e use uma ponta de pipeta de 200 microliteres com aproximadamente 0,33 milímetros aparados da extremidade para transferir todos os 120 microlitros de solução de montagem contendo ovário em um microscópio de vidro. Coloque delicadamente um vidro de deslizamento sobre a solução de montagem e sele as bordas com esmalte transparente.
Em seguida, use um microscópio confocal em uma ampliação de 10x com uma abertura de 0,8 para adquirir imagens dos ovários manchados e montados. Utilizando o portal PRECOG como demonstrado, os escores Z de NOTCH2, NOTCH3 e MAML1 no câncer de ovário podem ser obtidos. Os valores negativos de escore Z indicam a baixa sobrevida geral de pacientes com altos níveis de expressão dos três genes.
Usando o banco de dados CSIOVD para confirmar esses achados, indica ainda que uma alta expressão de NOTCH2, NOTCH3 e MAML1 se correlaciona com uma baixa sobrevida geral e livre de doenças. Outros testes de permutação sugerem que NOTCH2, NOTCH3 e MAML1 são altamente expressos em tecidos tumorais. Com base nesses três genes principais, uma rede de sinalização pode ser criada para fornecer os 50 genes vizinhos mais frequentemente alterados que também estão no mesmo caminho com as maiores taxas de mutação.
De interesse, a superexpressão do gene ENT NOTCH equivalente a Drosophila, NICD, sozinho, não induz tumores em Drosophila. Considerando que a superexpressão da NICD e do mam juntos induz tumores em moscas frutíferas, como evidenciado pela presença de múltiplas camadas epiteliais e células acumuladas. Novas validações de experimentação podem abrir caminho para a identificação de potenciais novos alvos de terapia medicamentosa, biomarcadores de doenças e tratamentos personalizados.
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Visão Geral
Este artigo explora a integração de bioinformática e experimentação para investigar a sinalização de notch no câncer de ovário. Ao aproveitar os bancos de dados de bioinformática, os pesquisadores podem planejar estrategicamente seus experimentos, levando a descobertas científicas mais informadas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Bioinformática
- Pesquisa sobre câncer de ovário
- Validação experimental
Fundamentos
- A bioinformática auxilia no processamento de conjuntos de dados em larga escala.
- Combinar bioinformática com experimentação melhora os resultados da pesquisa.
- A sinalização de notch desempenha um papel significativo no câncer de ovário.
- Utilizar dados de bioinformática existentes pode orientar o design experimental.
Objetivo do Estudo
- Investigar o papel da sinalização de notch no câncer de ovário.
- Validar descobertas de bioinformática através de abordagens experimentais.
- Melhorar terapias e diagnósticos para o câncer de ovário.
Métodos Utilizados
- Análise bioinformática das vias de sinalização de notch.
- Validação experimental das previsões de bioinformática.
- Integração de dados de bancos de dados de bioinformática.
- Planejamento da direção da pesquisa com base em insights de bioinformática.
Principais Resultados
- Identificação bem-sucedida dos componentes-chave da sinalização de notch.
- Validação das descobertas de bioinformática através de experimentação.
- Insights sobre potenciais alvos terapêuticos para o câncer de ovário.
- Demonstração da eficácia da combinação de bioinformática com métodos experimentais.
Conclusões
- A bioinformática é uma ferramenta poderosa na pesquisa do câncer.
- A validação experimental é crucial para confirmar previsões de bioinformática.
- Combinar essas abordagens pode levar a avanços significativos na compreensão do câncer de ovário.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Integrating bioinformatics with experimental validation enables biopharma teams to de-risk target hypotheses in ovarian cancer by leveraging large-scale datasets for target prioritization before costly wet-lab efforts. This combined approach improves predictive confidence in Notch signaling components as potential therapeutic targets or biomarkers, supporting informed go/no-go decisions in early discovery. The methodology supports translational continuity from target identification through preclinical validation by aligning computational findings with functional evidence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of Notch2, Notch3, and MAML1 as putative drivers in ovarian cancer through bioinformatics analysis of survival Z-scores and gene expression correlations.
- Operational Value: Supports functional target validation by guiding experimental design using PRECOG, CSIOVDB, GENT, and CBIO portals to identify differentially expressed genes and altered signaling networks.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by identifying genetic alterations and signaling networks associated with poor survival, informing target selection for further validation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems (e.g., Drosophila ovaries with NICD/mam overexpression) for downstream compound screening by establishing phenotype-genotype links in Notch pathway modulation.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through defined spatiotemporal gene expression controls and standardized ovarian tissue isolation, fixation, and imaging protocols.
- Scalability Value: Enables platform reuse across cancer types by demonstrating a transferable workflow for integrating database mining with experimental validation in genetically tractable models.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by linking Notch pathway activation in Drosophila ovaries to tumorigenic phenotypes, providing a mechanistic basis for therapeutic targeting.
- Operational Value: Addresses risk-adjusted advancement decisions by requiring combinatorial overexpression (NICD + mam) to induce tumors, highlighting context-dependent pathway activity critical for target validation.
- Translational Biomarker Alignment: Connects bioinformatics-derived survival correlations (NOTCH2/3/MAML1 Z-scores) with experimental tumor phenotypes, supporting biomarker qualification efforts.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target identification through lead optimization, where bioinformatics informs hypothesis generation and experimental validation confirms target druggability and pathway relevance in ovarian cancer.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mining survival and expression databases to prioritize Notch signaling components for functional interrogation.
- Screening: Describes assay readiness through standardized ovarian tissue preparation and confocal imaging, enabling quantitative readouts of Notch pathway activation phenotypes.
- Analytics: Highlights survival Z-scores, gene expression correlations, and permutation test outputs that allow cross-functional teams to compare target relevance and pathway alteration frequencies.
- Translational Research: Connects computational target prioritization to preclinical continuity by validating Notch-driven tumorigenicity in a genetic model, supporting de-risked advancement.
- Enterprise Reuse: Frames the workflow as a reusable capability for target validation across oncology indications by demonstrating a repeatable process of database interrogation followed by experimental confirmation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target selection, reduction of mechanistic ambiguity in Notch pathway involvement, and improved target hypothesis quality.
- Operational Value: Standardization of bioinformatics-to-experiment workflows, reproducibility of ovarian tissue isolation and imaging, and scalability of database mining approaches.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions through dual-evidence target validation, capital efficiency by focusing experiments on bioinformatics-prioritized targets, and reduced late-stage biological risk via mechanistic de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of Notch2/3/MAML1 or network neighbors for investment, and data-driven advancement decisions based on concordant computational and experimental evidence.
Implementation Considerations
- Required expertise in bioinformatics database navigation (PRECOG, CSIOVDB, GENT, CBIO) and interpretation of survival Z-scores, gene expression profiles, and mutation data.
- Instrumentation needs include access to academic-affiliated bioinformatics portals, standard molecular biology tools for fly handling, dissection microscopes, centrifuges, and confocal microscopes for tissue imaging.
- Cross-team standardization requires alignment between computational biologists and experimentalists on target selection criteria, gene symbols, and validation endpoints such as tumor phenotype scoring.
- Adaptation considerations include modifying gene targets, cancer types in database queries, and overexpression constructs while maintaining the core workflow of in silico prediction followed by in vivo/in vitro validation.
- Practical limitations include dependency on database annotation quality, potential species-specific differences in Notch signaling between Drosophila and humans, and the need for orthogonal validation in mammalian models to confirm translational relevance.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:44
Prediction of Clinical Outcomes from Genomic Profiles (PRECOG)
1:22
Cancer Science Institute of Singapore Database (CSIOVDB) and Gene Expression Across Normal and Tumor Tissue (GENT)
2:30
cBioPortal
3:30
Drosophila Dissection and Staining
7:23
Results: Representative Bioinformatic Approaches to Understanding the Role of Notch Signaling in Ovarian Cancer
8:42
Conclusion
