Name: Infiltração de leucócitos do Músculo Cremaster em Camundongos Avaliados por Microscopia Intravital (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Aprenda microscopia intravital em vênulas pós-capilares do músculo cremaster de camundongos para estudar interações leucócito-endotélio e recrutamento celular em modelos de inflamação e sepse.

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Este estudo foi apoiado pelo Ministério Federal alemão de Educação e Pesquisa (BMBF) 01GL1746E como parte do Consórcio PRIMAL. Os autores reconhecem Britta Heckmann e Silvia Pezer por uma assistência técnica habilidosa.

Os animais foram alojados sob condições controladas e específicas sem patógenos no IBF (Interfakultäre Biomedizinische Forschungseinrichtung), Heidelberg. Todos os procedimentos descritos aqui foram aprovados pelo IRB local e pelo Regierungspraesidium Karlsruhe, Baden-Wuerttemberg, Alemanha.
1. Administração de anestesia
<ol><li>Anestesiar o rato por injeção intraperitoneal (i.p.) de 125 mg/kg de cetamina e 12,5 mg/kg de xilazina.</li>
	<li>Coloque e fixar o mouse em uma posição dorsais reclinada em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal do mouse (36,5-38 °C). Use uma sutura estéril não absorvível (6/0) para enrolar um laço simples ao redor dos dentes frontais e fixar as extremidades de junção da sutura à almofada de aquecimento. Esta fixação visa manter a boca aberta, a fim de evitar distúrbios respiratórios.</li>
	<li>Verifique se o mouse tem a profundidade apropriada da anestesia por meio de uma pitada interdigital do dedo do dedo (a retirada não deve ser vista).</li>
	<li>Uma vez que a anestesia suficiente é alcançada, prossiga para a preparação cirúrgica. Confirmar repetidamente a anestesia ao longo do experimento em andamento a cada 30 min. Re-administrar drogas como descrito acima, se necessário.</li>
	<li>Solução de sal fisiológico equilibrado (PSS, composição: 132 mmol/L NaCl, 4,7 mmol/L KCl, 1,2 mmol/L MgS04, 2,0 mmol/L CaCl2, 18 mmol/L NaHCO3) com 5% de CO2/95% N2 durante 15 minutos. Bolha contínua pss com 5% CO2/95% N2 durante todo o experimento e manter a 37 °C.</li>
</ol>2. Preparação cirúrgica da traqueia e artéria carótida (opcional)
<ol><li>Disseque a pele da área do pescoço puxando suavemente a pele com pinças na linha média. Use uma tesoura para aplicar um corte circular de 1-2 cm de diâmetro para dar espaço suficiente para a preparação cirúrgica.</li>
	<li>Disseque cuidadosamente os tecidos musculares, gorduras e conjuntivos ao redor usando pinças.</li>
	<li>Faça um corte transversal (~ 1,3 mm) na traquéia usando uma pequena tesoura cirúrgica e introduza um tubo de polietileno (I.D. x O.D. 0,034" x 0,050") dentro da extremidade caudal da traqueia para fixar as vias aéreas superiores.</li>
	<li>Fixar o tubo localizado na traqueia por uma única sutura circular (6/0 USP).</li>
	<li>Localize a artéria carótida ao longo do lado direito da traqueia e disseque o tecido circundante da parede da artéria carótida. Alternativamente, a jugular ou também a veia traseira poderia ser usada para acesso i.v. Tente evitar lesões no nervo vagal, pois ele está localizado de perto.</li>
	<li>Passe duas peças de sutura (6/0) por baixo da artéria carótida. Coloque a primeira sutura craniana proximal, perto da bifurcação das artérias carótidas e amarre-a permanentemente. A segunda sutura será localizada a cerca de 5-8 mm distal da primeira e depois será usada para fixar o tubo na artéria carótida. Não amarre ainda.</li>
	<li>Prepare um tubo de polietileno (I.D. x O.D. 0,011" x 0,024") com um comprimento de 30 cm, dobrando a parte final a uma agulha de seringa de 1 mL cheia de salina (0,9% NaCl). Descarga rigorosa é importante para evitar a embolização do ar durante a preparação.</li>
	<li>Use um grampo de vaso de 7 mm para fixar a artéria carótida distalmente da segunda sutura.</li>
	<li>Realize um pequeno corte transversal (~0,5 mm) na artéria carótida e introduza o tubo de polietileno estéril. Fixar o tubo na artéria usando a segunda sutura preparada antes.</li>
	<li>Remova o clipe do vaso e aplique delicadamente um pouco de tensão na seringa conectada ao tubo de polietileno. Este cateter carótida agora pode ser usado para administrar drogas ou colher amostras de sangue, se necessário, até mesmo o monitoramento da pressão arterial ou da freqüência de pulso é possível com os respectivos dispositivos.</li>
</ol>3. Preparação cirúrgica do músculo cremaster
<ol><li>Transfira o mouse na almofada de aquecimento (juntamente com a almofada de aquecimento) para a estrutura de plástico feita sob medida que segura o palco para microscopia posterior. Oriente o rato com seu escroto voltado para o estágio do microscópio.<ol>
<li>Reavaliar a profundidade da anestesia antes de prosseguir; re-administrar uma dose de meio quarto a meia de anestesia, se necessário.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Localize o escroto, segurando-o em sua parte mais distal usando pinças, puxe-o suavemente e corte uma seção circular de pele escrotal com cerca de 5 mm de diâmetro. Certifique-se de não prejudicar as estruturas subjacentes, como o músculo cremaster. Certifique-se de manter o tecido aberto bem hidratado com solução salina.</li>
	<li>Disseque tecido conjuntivo solto usando duas pinças e localize ambos os testículos.</li>
	<li>Segure um testículo distalmente e comece a puxá-lo suavemente, removendo o tecido conjuntivo circundante passo a passo.</li>
	<li>Uma vez que o testículo é exteriorizado, fixe sua extremidade distal para o anel de borracha ao redor do palco. Após a exteriorização, hidrate o tecido com solução salina durante todo o processo.</li>
	<li>
Passo crítico: Remova cuidadosamente o tecido conjuntivo sem prejudicar o músculo cremaster subjacente. O excesso de tecido conjuntivo pode obstruir a visão em microscopia posterior e pode produzir imagens embaçadas.</li>
	<li>Fixar a parte distal do testículo para baixo e abrir o músculo cremaster por um pequeno corte transversal (cerca de 1 mm), seguido de incisão longitudinal do muito distal para a extremidade proximal. Como resultado, o músculo cremaster deve abrir esfericamente. O vaso macroscopicamente visível não deve ser cortado, pois isso pode afetar a hemodinâmica.</li>
	<li>Espalhe cuidadosamente o músculo sobre o palco de vidro e fixe-o no anel de borracha. Certifique-se de não tocar ou prejudicar a região central, pois a microscopia será realizada aqui. Atenção: O excesso de estiramento pode obstruir o fluxo sanguíneo.</li>
	<li>Fixar o teste restante é de lado para dar acesso à região de interesse. Certifique-se de umedecer com PSS repetidamente para evitar a secagem. O músculo montado está pronto para microscopia.</li>
</ol>4. Microscopia intravital
<ol><li>Coloque o músculo cremaster montado no microscópio vertical e realize a microscopia usando um objetivo de 40x.</li>
	<li>Adquira dados e exporte usando espectrografia de imagem de alto throughput.</li>
	<li>Executar gravações em superfusão contínua com PSS17pré-aquecidos (35-37 °C) Aplique superfusão por um pequeno tubo que foi colado ao objetivo vertical do microscópio para permitir gotejamento contínuo de PSS ao lado do objetivo até o tecido muscular.</li>
	<li>Identificar venulos pós-capilar (confluência de dois vasos menores) e medir a microcirculação em venos com diâmetro de 20-40 μm.</li>
	<li>Registre imagens de alta resolução da microcirculação do músculo cremaster em um intervalo de tempo de 30 s. Como pode haver uma leve contração e relaxamento do tecido muscular durante a gravação, certifique-se de ajustar continuamente o foco. Geralmente, o mouse tende a apresentar circulação estável por cerca de 2 horas. É possível adquirir várias gravações de diferentes embarcações de diferentes regiões. Um ou ambos testis podem ser usados posteriormente. NOTA: Como este é um modelo de inflamação, as formas comuns de indução são: aplicação sistêmica ou injeção escrotal local de mediadores pró-inflamatórios, bem como superfusão com, por exemplo, N-Formylmethionyl-leucil-fenilanilinina (fMLP). A estimulação tnf-α local é comumente usada para desencadear o recrutamento de leucócitos; A endotoxemia induzida pelo LPS é um modelo de inflamação sistêmica grave do SIRS.</li>
</ol>5. Visualização de leucócitos
NOTA: Leucócitos aderentes e rolamentos podem ser facilmente vistos sem maior visualização. Para determinar a velocidade da linha central dos leucócitos em movimento livre, realize a coloração diferencial.
<ol><li>Se os camundongos rotulados eGFP forem usados, analise-os diretamente por microscopia de fluorescência.</li>
	<li>Para cepas de mouse não-eGFP rotuladas, use coloração de rhodamina.<ol>
<li>Administrar a rhodamina 6G a 0,2 mg/kg de peso corporal. Doses repetidas podem ser necessárias para alcançar intensidades de coloração suficientes. Certifique-se de manter pequenos volumes, pois volumes maiores podem afetar parâmetros hemodinâmicos.</li>
		<li>Para coloração instantânea de leucócitos, administre a mancha através da artéria carótida. Se a dissecção da artéria carótida não tiver sido realizada, pode ser obtida uma coloração suficiente pela aplicação i.p. utilizando a mesma dose18. Como alternativa ao cateterismo da artéria carótida, qualquer outro cateterismo venoso pode ser realizado. NOTA: Tenha em mente que a coloração de rhodamina, ao contrário da rotulagem eGFP, mostra a decomposição temporal da intensidade da fluorescência, bem como um máximo de coloração global de cerca de 80% dos leucócitos em concentrações mais elevadas.</li>
		<li>Visualize livremente a rhodamina manchada de leucócitos por microscopia de fluorescência.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Fim do experimento
NOTA: O tempo total estimado para executar este protocolo deve ser de 90 a 150 minutos.
<ol><li>Acabar com o experimento com eutanásia por luxação cervical.</li>
	<li>Para análises posteriores, como a transmigração, fixe o músculo cremaster em PFA enquanto ainda se estica no palco e manchado para histologia conforme necessário.</li>
</ol>7. Análise offline
<ol><li>Analise os seguintes parâmetros como contagens simples durante a reprodução do vídeo.<ol>
<li>Calcular fluxo de rolamento [número/min]: número de células de rolamento passando por uma linha imaginária/min</li>
		<li>Calcular adesão [número/mm2]: número de células adesivos à parede do vaso dentro do campo de visão ≥ 30 s/superfície vascular [mm2].</li>
	</ol>
</li>
	<li>Meça os seguintes parâmetros hemodinâmicos e microvasculares medidos utilizando-se imageJ.<ol>
<li>Calcule o diâmetro do vaso [μm] como o diâmetro da parede interna.</li>
		<li>Calcule o comprimento do vaso [μm] como o comprimento da linha central do vaso.</li>
		<li>Calcule a <img alt="Símbolo de micrômetro por segundo [μm/s] para medição de velocidade em equações científicas." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> velocidade da linha central obtida a partir da análise de vídeo quadro-a-quadro de leucócitos em movimento livre na linha central.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use as seguintes equações como uma estimativa.<ol>
<li>Calcular a superfície vascular em [mm2]: comprimento do vaso [μm] x diâmetro do vaso [μm] x π x 10-6.</li>
		<li>Calcular a taxa <img alt="Análise de equilíbrio estático; Símbolo ΣFx=0; ilustração conceitual; educação física." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"> de cisalhamento da <img alt="Símbolo de micrômetro por segundo [μm/s] para medição de velocidade em equações científicas." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> parede: 4,9 x (velocidade da linha central de 8 x x 0,625/diâmetro do vaso [μm]).</li>
		<li>Calcular a velocidade <img alt="Símbolo de micrômetro por segundo [μm/s] para medição de velocidade em equações científicas." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> média do <img alt="Símbolo de micrômetro por segundo [μm/s] para medição de velocidade em equações científicas." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> fluxo sanguíneo : velocidade da linha central x 0,625.</li>
		<li><img alt="Equação que descreve a medição da taxa em unidades de número por minuto para análise de dados experimentais." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 4"> Calcular fluxo total de leucócitos: contagem de leucócitos sistêmicos <img alt="Medição de concentração em unidades de número por microlitro [número/μL], usada em cálculos de laboratório." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 5"> x (velocidade média de <img alt="Símbolo de micrômetro por segundo [μm/s] para medição de velocidade em equações científicas." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> fluxo sanguíneo x 60/1000) x π x <img alt="Fórmula de cálculo do diâmetro vascular, diagrama para medição e análise microvascular." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 6"> .</li>
		<li>Calcular fração de fluxo de rolagem [%]: fluxo de fluxo de rolagem/fluxo total de leucócitos x 100.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

O IVM como método tem sido amplamente utilizado para estudar diferentes tipos de células em diferentes órgãos e tem sido extensivamente descrito e discutido19. O objetivo principal deste estudo é fornecer uma abordagem eficiente para configurar e executar ivm no músculo cremaster. A prática do método produzirá resultados confiáveis e reprodutíveis. Assim, o planejamento e a padronização são fatores-chave para dominar a técnica. Acima de tudo, a técnica é muito dependente de parâmetros hemodinâmico...

A microscopia intravital (IVM) é uma ferramenta comumente aplicada no campo da biologia leucócito. O recrutamento de leucócitos segue uma cascata de eventos bem definidos iniciados pela captura de leucócitos, rolamento e adesão à parede endotelial, e finalmente transmigração e extravasação de leucócitos para o local real de inflamação1. Cada passo é mediado e controlado por várias quimiocinas (por exemplo, IL-8/CXCL8), receptores (por exemplo, LFA-1, Mac-1) e moléculas de adesão celular endotelial correspondentes (por exemplo, ICAM-1, VCAM-1 e E-Selectin)2,3. A interação de diferentes locais reguladores, fatores de controle e mediadores da cascata de recrutamento de leucócitos como receptor de produtos finais de glicação avançada (RAGE), molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1), liga de motivos C-X-C (CXCL)1/2 e seu receptor CXCR2 foram descobertos utilizando IVM4,5,6,7,8,9.
O método do IVM tem sido descrito para muitos órgãos e tecidos diferentes, como o intestino10,pele11,linfonodos12,o saco de gema embrionária13 e outros. No entanto, o método mais estudado do IVM é o modelo cremaster, descrito pela primeira vez em ratos14. Embora ainda seja usado em ratos15,o método é hoje aplicado principalmente em camundongos devido à alta abundância de diferentes linhas transgênicas. Nosso grupo destacou recentemente o papel potencial do cremaster IVM no campo das muscolopatias inflamatórias como a Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) estudando camundongos mdx deficientes de distrofina16. Devido à sua fina composição de fibras entrelaçadas e de fácil acesso, o músculo cremaster representa o músculo candidato ideal a ser estudado como um conjunto de montagem usando microscopia leve ou fluorescente. O recrutamento e extravasação de leucócitos ocorre principalmente em venules pós-capilar, que podem ser facilmente identificados em uma camada muscular contínua no músculo cremaster.
A vantagem da imagem in vivo em comparação com outros ensaios in vitro é seu contexto biológico em um organismo vivo. Ao mesmo tempo, delinear contribuições específicas de células para o recrutamento alterado de leucócitos pode exigir modelos adicionais in vitro, como câmaras de fluxo ou ensaios endoteliais. A combinação de múltiplos métodos produzirá dados mais convincentes. Os cientistas devem estar cientes das limitações do modelo cremaster, pois qualquer manipulação cirúrgica levará ao aumento do tráfico e recrutamento de leucócitos. Portanto, o recrutamento de base é difícil de estimar com este método. Apesar de sua ampla aplicação, o IVM do cremaster pode ser desafiador e uma nova configuração pode levar tempo e recursos para estabelecer. Agora fornecemos um protocolo fácil que ajudará a evitar alguns dos erros comuns no IVM. Além disso, serão discutidas limitações e os métodos complementares serão destacados quando aplicável.
O IVM do cremaster representa uma abordagem ideal a ser implementada no campo dos estudos inflamatórios e infecciosos. Mais especificamente, o modelo cremaster pode ser de alto interesse para os cientistas que estudam biologia muscular esquelética no contexto da doença inflamatória.

<table><tbody><tr><td><forte>Material</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketanest S</td><td>Pfizer Pharma GmbH</td><td>PZN: 08509909</td><td>anestesia. Genérico / IUPAC Nome: cetamina</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>CP-Pharma GmbH</td><td>Artigo-nr.: 1205&nbsp;</td><td>anestesia. Nome genérico / IUPAC: xilazina (como cloridrato)</td></tr> <tr><td>Solução salina</td><td>B. Braun Melsungen&nbsp;</td><td>PZN 02737756</td><td>preparo cirúrgico. Genérico / IUPAC Nome: cloreto de sódio</td></tr><tr><td>Seringa agulha Omnican F</td><td>B. Braun Melsungen&nbsp;</td><td>REF 9161502</td><td>preparação cirúrgica&nbsp;</td></tr><tr><td>Sutura 6/0 USP</td><td>Resorba</td><td>REF 4217</td><td>preparação cirúrgica&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo de polietileno #10&nbsp;</td><td>BD</td><td>GmbH Fornecedor nº 427401</td><td>preparação cirúrgica&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo de polietileno #90&nbsp;</td><td>BD</td><td>GmbH Fornecedor nº 427421</td><td>preparação cirúrgica&nbsp;</td></tr><tr><td>Rhodamine 6G</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH</td><td>Número CAS 989-38-8&nbsp;</td><td>coloração de leucócitos. Nome genérico / IUPAC: etil 2-[3-(etilamino)-6-etilimino-2,7-dimetilxanteno-9-il]benzoato</td></tr><tr><td><forte>Equipamento de Configuração</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio vertical&nbsp;</td><td>Olympus&nbsp;</td>Objetiva de 40 vezes por <td>microscopia</td> <td>BX51W1</td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>Achroplan 40 &times; /0,80 W</td><td>microscopia</td></tr><tr><td>Software ImSpector Lavision</td><td>Biotec GmbH</td><td>ver. 4.0.469</td><td>software</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institute of Health, EUA</td><td>ver. 1.51j8</td><td>software</td></tr></tbody></table>

infiltração de leucócitos do músculo cremaster em camundongos avaliados por microscopia intravital

Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy

A microscopia intravital (IVM) é amplamente utilizada para monitorar processos fisiológicos e fisiopatológicos dentro da cascata de recrutamento de leucócitos in vivo. O protocolo atual representa um método prático e reprodutível para visualizar a interação com o endotélio leucócito, levando ao recrutamento de leucócitos no tecido derivado do músculo esquelético dentro do organismo intacto do camundongo. O modelo é aplicável a todos os campos de pesquisa que se concentram na ativação de granulócitos e seu papel na doença.
Fornecemos um protocolo passo a passo para orientar através do método e destacar possíveis armadilhas e dificuldades técnicas. O protocolo abrange os seguintes aspectos: configurações experimentais e material necessário, anestesia do camundongo, dissecção do músculo cremaster, bem como cânula traqueal e carótida, gravações ivm e análise off-line. Formatos de dados como leucócitos aderentes, fluxo de rolamento (RF) e fração de fluxo de rolamento (RFF) são explicados detalhadamente e aplicativos apropriados são discutidos. Os resultados representativos dos camundongos mdx deficientes de distrofina são fornecidos na seção de resultados.
O IVM é uma ferramenta poderosa para avaliar o recrutamento de leucócitos em um ambiente in vivo; no entanto, delinear, por exemplo, a função endotelial e leucócito pode exigir uma combinação com configurações ex-vivo, como experimentos de câmara de fluxo. Além disso, o histórico genético de animais de interesse pode influenciar muito o recrutamento de base, exigindo ajuste fino individual do protocolo fornecido. Apesar de suas limitações, o IVM pode servir como uma plataforma para traduzir prontamente achados in vitro em um organismo vertebrado vivo.

IvM de acordo com o protocolo fornecido produzirá insights únicos sobre a cascata de recrutamento de leucócitos no músculo esquelético. A seção de resultados se concentrará nos resultados típicos obtidos pelo IVM e destacará possíveis problemas que podem encontrar.
A configuração experimental para microscopia intravital está descrita na Figura 1. A preparação do músculo cremaster e a remoção do tecido conjuntivo são cruciais para obter imagens microscópicas focada...

Aqui, mostramos como realizar microscopia intravital em venulos pós-capilar esfarelados do músculo cremaster do rato. Comumente aplicada a diferentes modelos de inflamação e sepse, particularmente aqueles induzidos por quimiocinas e citocinas, destacamos sua relevância no estudo de muscolopatias envolvendo infiltração exagerada de leucócitos musculares.

Infiltração de leucócitos do Músculo Cremaster em Camundongos Avaliados por Microscopia Intravital

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The ...

Este método prático e reprodutível pode ser usado para visualizar as interações de leucócitos endotélio que levam ao recrutamento de leucócitos dentro de um rato intacto. Esta técnica também apresenta uma poderosa ferramenta para o monitoramento de processos fisiológicos e fisiofiológicos dentro da cascata de recrutamento de leucócitos in vivo. O método pode ser aplicado em diferentes modelos inflamatórios e sépticos.Por exemplo, recentemente destacamos sua relevância no estudo de musculopatias envolvendo infiltração de leucócitos musculares exagerados. Nossa sugestão para colegas cientistas que estão considerando usar essa técnica é obter o máximo de experiência prática possível, pois o método é muito suscetível a pequenos desvios. Demonstrando o procedimento será Simon Kranig, um clínico e cientista sênior do meu laboratório.Depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé no animal experimental anestesiado, fixe o rato em uma posição dorsal recumbent em uma almofada de aquecimento Celsius de 37 graus e use uma sutura estéril nãoabsorbável para enrolar um simples laço ao redor dos dentes frontais. Tape as extremidades de junção da sutura na almofada de aquecimento e use pinças para levantar suavemente a pele na linha média. Em seguida, faça uma incisão circular de um a dois centímetros de diâmetro sobre o pescoço e o tórax superior e use pinças para dissecar cuidadosamente os tecidos musculares, gordos e conjuntivos circundantes.Coloque uma sutura sob a traqueia. Use uma pequena tesoura cirúrgica para fazer um corte transverso de aproximadamente 1,3 milímetros na traqueia e introduzir um tubo de polietileno na extremidade caudal da traqueia para proteger as vias aéreas superiores. Fixar o tubo localizado com uma única sutura de nó circular e localizar a artéria carótida ao longo do lado direito da traqueia.Dissecar o tecido circundante da parede da artéria carótida e passar dois pedaços de sutura sob a artéria. Amarre a primeira sutura craniana proximal à bifurcação das artérias carótidas e posicione a segunda sutura cerca de cinco a oito milímetros distal da primeira sutura sem amarrar. Em seguida, conecte um pedaço de 30 centímetros de tubo de polietileno a uma agulha de seringa de um mililitro cheia de soro fisiológico e use um clipe de vaso de sete milímetros para fixar a artéria carótida distally à segunda sutura.Faça um corte transverso de aproximadamente 0,5 milímetros na artéria carótida e introduza o tubo de polietileno estéril na artéria. Fixar o tubo com a segunda sutura e remover o clipe do vaso. Em seguida, deprimir suavemente o êmbolo da seringa para jogar soro fisiológico no vaso.Para preparar o músculo cremaster, transfira o mouse para uma estrutura de microscópio plástico feita sob medida com o escroto voltado para o estágio do microscópio e segure cuidadosamente o escroto em sua extremidade mais distal com pinças. Puxando o escroto suavemente, remova uma seção circular de cerca de cinco milímetros de diâmetro da pele escrotal mantendo o tecido aberto bem hidratado com soro fisiológico. Use duas pinças para dissecar o tecido conjuntivo solto e localizar ambos os testículos.Compre um teste é distally e suavemente começar a retirar o tecido reprodutivo removendo qualquer tecido conjuntivo circundante passo a passo. Uma vez que o testísta tenha sido exteriorizado, fixar a extremidade distal do tecido ao anel de borracha ao redor do palco e hidratar o tecido com soro fisiológico. Em seguida, remova cuidadosamente o tecido conjuntivo sem prejudicar o músculo cremaster subjacente.É fundamental remover todo o tecido conjuntivo que resultaria em imagens embaçadas sem prejudicar o músculo cremaster subjacente. Quando todo o tecido tiver sido removido, faça uma incisão transversal de um milímetro para abrir o músculo cremaster antes de fazer uma incisão longitudinal do muito distal à extremidade proximal do tecido. O músculo deve abrir esfericamente.Espalhe cuidadosamente o músculo sobre a fase de vidro e fixe o músculo no anel de borracha tomando cuidado para não tocar ou prejudicar a região central do tecido. Em seguida, fixar o restante do testígico para o lado para dar acesso à região de interesse e hidratar o tecido com PSS. Para visualização intravital da vasculatura muscular, coloque o músculo cremaster montado no microscópio vertical e selecione o objetivo de 40X.Realize as gravações sob superfusão contínua com PSS de 35 a 37 graus Celsius através de um pedaço de pequeno tubo que foi colado ao objetivo vertical do microscópio para permitir o gotejamento contínuo de PSS ao lado do objetivo até o músculo e tecido. Identifique as venules pós-capilares. Meça a microcirculação em venules com diâmetro de 20 a 40 micrômetros.Em seguida, registre imagens de alta resolução da microcirculação do músculo cremaster durante um período de 30 segundos, ajustando continuamente o foco devido a pequenas alterações na contração e relaxamento do tecido muscular. O excesso de tecido conjuntivo pode levar a imagens microscópicas embaçadas. Nesta imagem microscópica representativa, os venules pós-capilares que devem ter entre 20 e 40 micrômetros de diâmetro podem ser identificados pela confluência de dois vasos menores.Leucócitos aderentes e rolando podem ser visualizados enquanto os leucócitos circulantes só podem ser rastreados em replay em câmera lenta de vídeos gravados. Uma infinidade de parâmetros pode afetar o recrutamento de leucócitos in vivo, incluindo a saída cardíaca, diâmetro do vaso, velocidade central, taxa de corte de parede e número de leucócitos circulantes. Observe que a velocidade central é influenciada pela saída cardíaca, resistência vascular periférica e volume intravasal.Por exemplo, um grande volume de Rhodamine ou outra substância experimental dada através do cateter carótida aumenta a velocidade central pós-capilar e inibe a captura e rolamento de leucócitos. Pelo contrário, insuficiência cardíaca, anestesia profunda ou hipotermia podem diminuir o fluxo pós-capilar. Para determinar a velocidade da linha central, podem ser usados leucócitos fluorescentes que circulam livremente ou os leucócitos devem ser tingidos com reagentes fluorescentes como Rhodamine.Observe que cepas de tipo selvagem podem mostrar variância fisiológica. Por exemplo, os camundongos C57BL/6 demonstram claramente melhor rolamento de leucócitos, adesão e transmigração em comparação com animais C57BL/10ScSn. As etapas de planejamento e padronização são importantes para dominar a técnica especialmente durante a preparação do músculo cremaster para microscopia.Outros métodos para visualizar o recrutamento de leucócitos podem ser conduzidos para produzir informações adicionais e ajudar a dissecar a contribuição individual de leucócitos e células endoteliais para a cascata de recrutamento. Esta técnica fornece uma plataforma para a avaliação pré-clínica de meditadores farmacológicos e novas substâncias modulatórias imunológicas.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

A preparação do tecido é descrito para visualização e manipulação experimental da microcirculação vida. Anestesiados em camundongos machos, o fino, altamente vascularizado do músculo cremaster está preparado para microscopia intravital para estudar redes microvasculares incluindo arteríolas, vênulas e capilares. Esta preparação é facilmente adaptada para ratos e hamsters.

O Mouse Preparação Muscle Cremaster for Imaging intravital da Microcirculação

Nós descrevemos um protocolo de brightfield microscopia intravital para medir a dinâmica interações neutrófilos-célula endotelial durante o recrutamento de neutrófilos em resposta à fonte de um chemoattractant neutrófilos in vivo. Neutrófilos rastejando intraluminal, a migração transendotelial e quimiotaxia em tecido muscular do rato cremaster são visualizados com o tempo decorrido, fotografia, vídeo e rastreados com ImageJ.

Rastreamento Crawling neutrófilos Intraluminal, migração transendotelial e Quimiotaxia em tecido por Microscopia intravital Vídeo

Microscopia de epifluorescência intravital Digital de vênulas na microcirculação cremastérico é um método conveniente para obter insights sobre leucócito-endotelial...

Real-time Digital Imaging de leucócito-endotélio Interação em isquemia-reperfusão (IRI) do músculo cremaster de rato

Aqui descrevemos uma técnica experimental de microscopia de fluorescência intravital para visualizar heterotípicos plaquetas neutrófilos interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos. Esta tecnologia microscópico será valiosa para estudar o mecanismo molecular da doença vascular e para testar agentes farmacológicos, em condições fisiopatológicas.

Imagens em tempo real de heterotípica plaquetas neutrófilos Interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos

Microscopia intravital do cremaster microcirculação rato M. oferece um único e bem padronizados modelo in vivo para a análise de medula óssea a migração de células estaminais periféricas.

Microscopia intravital da Microcirculação no músculo Rato Cremaster de Análise de Migração Stem Peripheral celular

Esta aplicação simplificada de microscopia intravital de veias mesentérias em camundongos pode ser usada em diferentes modelos de inflamação para observar as interações leucócitos-endoteliais e plaquetas-leucócitos.

Interações Intravital Microscopia de leucócito-endothelial e plaquetas-leucócitos em mesenterial Veias Ratos

Detalhamos um protocolo para monitorar o comportamento de neutrófilos e monócitos em veias mesentéricas em estado estacionário e condições inflamatórias usando microscopia confocal intravital em camundongos anestesiados.

Imagiologia neutrófilos e monócitos em Mesenteric Veins por Microscopia intravital em ratos anestesiados em Tempo Real

Aqui, descrevemos uma abordagem de microscopia de folha clara para visualizar o infiltrado de leucócitos CD45 + cardíacos em um modelo murino de miocardite fulminante asséptica, que é induzida pelo tratamento de toxina diftônica intratraqueal de ratos CD11c.DTR.

Visualização Quantitativa de Infiltrado de Leucócitos em um Modelo Murino de Miocardite Fulminante por Microscopia de Folha de Luz

Nós descrevemos um método para visualizar o IELS do ltγδ GFP-etiquetado usando a imagem latente intravital do intestino pequeno murino pela microscopia confocal invertida do disco de giro. Esta técnica permite o rastreamento de células ao vivo dentro da mucosa para até 4 h e pode ser usada para investigar uma variedade de interações imunológicas intestinais.

Imagem latente intravital de linfócitos intraepithelial no intestino pequeno murine

O recrutamento de leucócitos e plaquetas constitui um componente essencial necessário para o crescimento efetivo das artérias colaterais durante a arteriogênese. A microscopia multifóton é uma ferramenta eficiente para rastrear a dinâmica celular com alta resolução espaço-temporal in vivo e menor fototoxicidade para estudar o recrutamento e extravasamento de leucócitos durante a arteriogênese.

Imagem Intravital Multifóton para Monitoramento do Recrutamento de Leucócitos durante a Arteriogênese em Modelo de Membro Posterior Murino

A imagem in vivo das articulações é uma técnica valiosa para descobrir o comportamento migratório dos leucócitos e a dinâmica molecular dentro das articulações inflamadas. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para imagens in vivo das articulações usando um modelo murino da artrite induzida por colágeno tipo II (CIA).

In vivo Imagens revelam o comportamento migratório dos leucócitos dentro das articulações

Aprenda microscopia intravital em vênulas pós-capilares do músculo cremaster de camundongos para estudar interações leucócito-endotélio e recrutamento celular em modelos de inflamação e sepse.

Infiltração de leucócitos do Músculo Cremaster em Camundongos Avaliados por Microscopia Intravital

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