Name: Avaliação de células auxiliares tolas e resposta do centro germinal durante a infecção pelo vírus da influenza A em camundongos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Aprenda a avaliar células T auxiliares foliculares e resposta do centro germinal em camundongos infectados pelo vírus influenza A. Este protocolo orienta pesquisadores em estudos imunológicos de resposta viral.

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Agradecemos aos funcionários das instalações de citometria de fluxo, instalações ABSL2 e instalações de animais SPF do Institut Pasteur de Xangai por sua ajuda técnica e conselhos. Este trabalho foi apoiado pelas seguintes bolsas: Programa de Pesquisa Prioritária Estratégica da Academia Chinesa de Ciências (XDB29030103), Programa Nacional de P&D da China (2016YFA0502202), Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (31570886).

<ol><li>Johnston, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+and+Blimp-1+are+reciprocal+and+antagonistic+regulators+of+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 and Blimp-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation.</a> Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).</li>
<li>Nurieva, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+mediates+the+development+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells.</a> Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+repressor+Bcl-6+directs+T+follicular+helper+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcriptional repressor Bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment.</a> Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).</li>
<li>Pedros, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TRAF-like+motif+of+the+inducible+costimulator+ICOS+controls+development+of+germinal+center+TFH+cells+via+the+kinase+TBK1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">A TRAF-like motif of the inducible costimulator ICOS controls development of germinal center TFH cells via the kinase TBK1.</a> Nature Immunology. 17 (7), 825-833 (2016).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+T-helper+cell+recruitment+governed+by+bystander+B+cells+and+ICOS-driven+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Follicular T-helper cell recruitment governed by bystander B cells and ICOS-driven motility.</a> Nature. 496 (7446), 523-527 (2013).</li>
<li>Lee, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+priming+for+extrafollicular+antibody+responses+requires+Bcl-6+expression+by+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">B cell priming for extrafollicular antibody responses requires Bcl-6 expression by T cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 208 (7), 1377-1388 (2011).</li>
<li>Zotos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-21+regulates+germinal+center+B+cell+differentiation+and+proliferation+through+a+B+cell-intrinsic+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">IL-21 regulates germinal center B cell differentiation and proliferation through a B cell-intrinsic mechanism.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207 (2), 365-378 (2010).</li>
<li>Vogelzang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fundamental+role+for+interleukin-21+in+the+generation+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A fundamental role for interleukin-21 in the generation of T follicular helper cells.</a> Immunity. 29 (1), 127-137 (2008).</li>
<li>Ansel, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemokine-driven+positive+feedback+loop+organizes+lymphoid+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A chemokine-driven positive feedback loop organizes lymphoid follicles.</a> Nature. 406 (6793), 309-314 (2000).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+Controls+Follicular+T+Helper+Cell+Positioning+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">PD-1 Controls Follicular T Helper Cell Positioning and Function.</a> Immunity. 49 (2), 264-274 (2018).</li>
<li>Methot, S. P., Di Noia, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanisms+of+Somatic+Hypermutation+and+Class+Switch+Recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+ImmunoChemical%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanisms of Somatic Hypermutation and Class Switch Recombination.</a> Advanced ImmunoChemical. 133, 37-87 (2017).</li>
<li>Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+helper+CD4+T+cells+%28TFH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Follicular helper CD4 T cells (TFH).</a> Annual Review of Immunology. 29, 621-663 (2011).</li>
<li>Calame, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+cells%3A+finding+new+light+at+the+end+of+B+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Plasma cells: finding new light at the end of B cell development.</a> Nature Immunology. 2 (12), 1103-1108 (2001).</li>
<li>Yoo, J. K., Fish, E. N., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LAPCs+promote+follicular+helper+T+cell+differentiation+of+Ag-primed+CD4%2B+T+cells+during+respiratory+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">LAPCs promote follicular helper T cell differentiation of Ag-primed CD4+ T cells during respiratory virus infection.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1853-1867 (2012).</li>
<li>Leon, B., Bradley, J. E., Lund, F. E., Randall, T. D., Ballesteros-Tato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP3%2B+regulatory+T+cells+promote+influenza-specific+Tfh+responses+by+controlling+IL-2+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">FoxP3+ regulatory T cells promote influenza-specific Tfh responses by controlling IL-2 availability.</a> Nature Communications. 5, 3495(2014).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+protein+1+promotes+follicular+helper+T+cell+differentiation+and+antibody+production%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix protein 1 promotes follicular helper T cell differentiation and antibody production.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 8621-8626 (2018).</li>
<li>León, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+TH2+development+by+CXCR5%2B+dendritic+cells+and+lymphotoxin-expressing+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of TH2 development by CXCR5+ dendritic cells and lymphotoxin-expressing B cells.</a> Nature Immunology. 13 (7), 681-690 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Foxp1+is+a+critical+negative+regulator+of+the+differentiation+of+follicular+helper+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Foxp1 is a critical negative regulator of the differentiation of follicular helper T cells.</a> Nature Immunology. 15 (7), 667-675 (2014).</li>
<li>Bouvier, N. M., Lowen, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+for+Influenza+Virus+Pathogenesis+and+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission.</a> Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).</li>
<li>Miyauchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+neutralizing+influenza+antibody+response+in+the+absence+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective neutralizing influenza antibody response in the absence of T follicular helper cells.</a> Nature Immunology. 17 (12), 1447-1458 (2016).</li>
<li>Rodriguez, L., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+Virus+Studies+in+a+Mouse+Model+of+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).</li>
<li>Kitano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+protein+expression+shapes+pre-germinal+center+B+cell+dynamics+and+follicular+helper+T+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Bcl6 protein expression shapes pre-germinal center B cell dynamics and follicular helper T cell heterogeneity.</a> Immunity. 34 (6), 961-972 (2011).</li>
<li>Yusuf, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germinal+center+T+follicular+helper+cell+IL-4+production+is+dependent+on+signaling+lymphocytic+activation+molecule+receptor+%28CD150%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Germinal center T follicular helper cell IL-4 production is dependent on signaling lymphocytic activation molecule receptor (CD150).</a> The Journal of Immunology. 185 (1), 190-202 (2010).</li>
<li>Sun, J., Dodd, H., Moser, E. K., Sharma, R., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+cell+help+and+innate-derived+IL-27+induce+Blimp-1-dependent+IL-10+production+by+antiviral+CTLs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD4+ T cell help and innate-derived IL-27 induce Blimp-1-dependent IL-10 production by antiviral CTLs.</a> Nature Immunology. 12 (4), 327-334 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Devido a funções especializadas no fornecimento de ajuda de células B para a geração de anticorpos de alta afinidade, as células Tfh têm sido extensivamente estudadas nos mecanismos de diferenciação e manipulação para fornecer novas estratégias para o desenho da vacina. A infecção pelo vírus da influenza induz respostas vigorosas das células Tfh e GC B, sendo assim um modelo apropriado para este campo de pesquisa. Neste artigo, descrevemos protocolos de infecção pelo vírus da gripe por inoculação intranasal, avaliação da...

Na última década, inúmeros estudos foram focados no recém-identificado subconjunto de células CD4+ T, subconjunto de células Tfh, por suas funções essenciais no desenvolvimento do Centro Germinal (GC) B. Linfoma de célula B 6 (Bcl6), que é considerado principalmente como um repressor genético, é o fator definidor de linhagem das células Tfh para a evidência de que a expressão ectópica de Bcl6 é suficiente para impulsionar a diferenciação de Tfh enquanto a deficiência de Bcl6 resulta na diferenciação Tfh desaparecida1,2,3. Ao contrário de outros subconjuntos de ajuda CD4+ T que executam sua função de efeitos por migração para os locais de inflamação, as células Tfh fornecem ajuda da célula B principalmente na zona folicular de células B de baço e linfonodo. Moléculas co-estimulatórias ICOS e CD40L, desempenham papéis significativos na interação entre as células Tfh e GC B. Durante a diferenciação do Tfh, o ICOS transmite sinais necessários de células B coginadas e também atua como um receptor recebendo sinais de migração de células B espectadores para localização da zona de célula B4,5. CD40L é um mediador de sinais de células Tfh para proliferação e sobrevivência de células B6. Outro fator que desempenha o papel semelhante ao CD40L é o citocina IL21, que é principalmente secretado por células Tfh. O IL21 regula diretamente o desenvolvimento e a produção de células GC B de anticorpos de alta afinidade, mas seu papel na diferenciação do Tfh ainda é controverso7,8. PD-1 e CXCR5, que agora são mais utilizados na identificação de células Tfh na análise de citometria de fluxo, também desempenham papéis significativos na diferenciação e função deste subconjunto. CXCR5 é o receptor de quimiocina folicular de células B e media a localização de células Tfh em folículos de células B9. O PD-1 agora é identificado para não só ter a função de orientação folicular, mas também transmitir sinais críticos no processo de maturação de afinidade de afinidade de células GC B10. Com base nesses achados, avaliar a expressão dessas moléculas poderia basicamente refletir a maturação e função das células Tfh.
GC é uma estrutura microanatomical transitória induzida em órgãos linfoides secundários e altamente dependente das células Tfh, sendo assim uma leitura perfeita para avaliar a resposta Tfh. Em GC, após receber sinais mediados por citocinas e moléculas co-estimulantes, as células B estão sujeitas a troca de classe e hipermutação somática para gerar anticorpos de alta afinidade11. A troca diferencial da classe anticorpo ocorre no nicho diferencial de citocina, no qual il4 e IL21 induzem a troca de classe IgG1 enquanto IFNγ induz a comutação da classe IgG212. As células plasmáticas são os produtores de anticorpos secretos e são células terminais diferenciadas. Como as células Tfh, o desenvolvimento de células B em GC está associado à expressão dinâmica de muitas moléculas significativas. Com base no presente estudo, as células GC B podem ser identificadas como B220+PNA+Fas+ ou B220+GL7+Células Fas+ e células plasmáticas, em comparação com seus precursores, expressão de baixa regulação de B220 e expressão CD13813. Além disso, ambas as características podem ser detectadas na análise de citometria de fluxo e imunofluorescência, sendo assim a avaliação adequada da resposta gc.
Respostas celulares robustas e humorais são induzidas na infecção pelo vírus da gripe, com células Tfh e Th1 dominando a resposta celular CD4+ T14,o que o torna um modelo perfeito para o estudo de diferenciação de células Tfh. Influenza A/Porto Rico/8/34 H1N1(PR8), que é uma cepa comumente usada adaptado ao rato, é frequentemente utilizada neste estudo14,15,16. Aqui, descrevemos alguns protocolos básicos do ensaio relevante do estudo Tfh na infecção pelo vírus da gripe: 1) inoculação intranasal do vírus PR8; 2) células Tfh específicas de antígeno, células GC B e plasma e detecção de IL21 com citometria de fluxo; 3) visualização histológica de GC; 4) detecção de titulação de anticorpos específicas de antígeno em soro com ELISA. Esses protocolos fornecem as técnicas necessárias para novos pesquisadores no estudo associado ao Tfh.

<table><tbody><tr><td><forte>Imunocoloração de células Tph, células Tfh NP-específicas e Bcl-6</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37% formaldeído</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD16/32 camundongo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0161-86</td><td></td></tr><tr><td>APC-conjugado-IAbNP311-325 MHC tetrâmero classe II</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bcl-6 PE</td><td>Biolegend</td><td>358504</td><td>clone: 7D1</td></tr><tr><td>Biotina-CXCR5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-7185-82</td><td>clone: SPRCL5</td></tr><tr><td>CD4 Percp-eFluor 710</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-0041-82</td><td>clone: GK1.5</td></tr><tr><td>CD44 eVolve 605</td><td>Thermo Fisher Scientifi</td><td>83-0441-42</td><td>clone: IM7</td></tr><tr><td>CD44 FITC</td><td>Thermo Fisher Scientifi</td><td>11-0441-82</td><td>clone: IM7</td></tr><tr><td>CD62L FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553150</td><td>clone: MEL-14</td></tr><tr><td>ICOS BV421</td><td>Biolegend</td><td>564070</td><td>clone: 7E.17G9</td></tr><tr><td>PD1 PE / Cy7</td><td>Biolegend</td><td>135216</td><td>clone: 29F.1A12</td></tr><tr><td>Streptavidin BV421</td><td>BD Pharmingen</td><td>563259</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>554081</td><td></td></tr><tr><td>Coloração intracelular de IL21</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37% formaldeído</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>109-605-098</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B6542</td><td></td></tr><tr><td>receptor humano FCc IL-21</td><td>R & D Sistema</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de ionomicina</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Kit de coloração de células mortas Aqua fixáveis vivas / mortas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>MP</td><td>102855 <</td><td></td></tr> <tr><td>forte > GC B e coloração de células plasmáticas< / forte ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>B220 APC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-0452-81</td><td>clone: RA3-6B2</td></tr><tr><td>CD138 PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>561070</td><td>clone: 281-2</td></tr><tr><td>CD95 (FAS) PE / Cy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>557653</td><td>clone: Jo2</td></tr><tr><td>IgD eFluor 450</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-5993-82</td><td>clone: 11-26c</td></tr><tr><td>PNA FITC</td><td>Sigma</td><td>L7381</td><td></td></tr><tr><td>Ensaio de título de anticorpos específicos de HA com ELISA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PR8-HA</td><td>Sino Biológico</td><td>11684-V08H</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SSBC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-mouse Ig (SBA Clonotyping System-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-mouse IgM (SBA Clonotyping System-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-rato IgG1 (SBA Clonotyping System-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti mouse IgG2b (SBA Clonotyping System-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti mouse IgG2c (SBA Clonotyping System-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>TMB Conjunto de reagentes de substrato</td><td>BD Pharmingen</td><td>555214</td><td></td></tr><tr><td>Histologia</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Alexa Fluor 555-cabra-anti rato IgG</td><td>Life Technology</td><td>A21434</td><td></td></tr><tr><td>anti-camundongo</td><td>IgD Biolegend</td><td>405702</td><td></td></tr><tr><td>biotinilado PNA</td><td>Vector laboratories</td><td>B-1075</td><td></td></tr><tr><td>diluído Alexa Fluor 488-estreptavidina</td><td>Life Technology</td><td>S11223</td><td></td></tr><tr><td>soro de cabra normal</td><td>SouthernBiotech</td><td>0060-01</td><td></td></tr><tr><td>Reagente antidesbotamento de ouro Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>P3630</td><td></td></tr><tr><td>STREPTAVIDIN/BIOTIN blocking</td><td>kit Vector laboratories</td><td>SP-2002</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação de células auxiliares tolas e resposta do centro germinal durante a infecção pelo vírus da influenza a em camundongos

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

As células T Follicular Helper (Tfh) são um subconjunto independente de células CD4+ T especializado em fornecer ajuda para o desenvolvimento do centro germinal (GC) e geração de anticorpos de alta afinidade. Na infecção pelo vírus da gripe, respostas robustas de células Tfh e GC B são induzidas para facilitar a erradicação eficaz do vírus, o que confere um modelo de camundongo qualificado para o estudo associado ao Tfh. Neste artigo, descrevemos protocolos na detecção de resposta imune básica associada ao Tfh durante a infecção pelo vírus da gripe em camundongos. Estes protocolos incluem: inoculação intranasal do vírus da gripe; coloração e análise da citometria de fluxo de células Tfh policlonais e antígenos, células GC B e células plasmáticas; detecção de imunofluorescência de GCs; ensaio imunosorbente ligado à enzima (ELISA) de anticorpo específico do vírus da influenza no soro. Esses ensaios basicamente quantificam a diferenciação e função das células Tfh na infecção pelo vírus da gripe, fornecendo ajuda para estudos em mecanismo de diferenciação e estratégia de manipulação.

Caracterização da morbidade do camundongo na infecção pelo vírus da gripe Após a infecção pelo vírus da gripe, os camundongos são menos ativos e anoréxicos devido à doença, que se reflete na perda de peso grave, sintoma comumente utilizado para monitorar a morbidade do camundongo19. Como mostrado na Figura 1a , camundongos infectados pelo vírus PR8 começaram a perder peso no dia 6, atingiram o maior nível de perda no dia 8 e volta...

Este artigo descreve protocolos de avaliação da resposta Tfh e GC B no modelo de camundongos de infecção por vírus influenza.

Avaliação de células auxiliares tolas e resposta do centro germinal durante a infecção pelo vírus da influenza A em camundongos

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and ...

As células T foliculares auxiliares são um subconjunto de células T CD4 recém-identificadas que fornecem ajuda às células B na produção animal de alta afinidade. Demonstrar a identificação de células Tfh em uma infecção pelo vírus influenza ajudará novos pesquisadores a entender como realizar as técnicas necessárias para estudos associados ao Tfh. Como um título de vírus inadequado pode causar mortalidade ou uma resposta imune muito fraca, aconselhamos que o título seja determinado antes de realizar um experimento.Para inoculação do vírus PR8 de camundongos C57 pretos 6 machos de oito semanas de idade. Sob condições de nível de biossegurança 2, descongele um estoque de vírus PR8 armazenado de 80 graus Celsius negativos no gelo. Vortex o vírus para obter uma solução homogênea.Dilua o vírus para duas unidades de plataforma por microlitro de PBS em um tubo pré-resfriado de 1,5 mililitro e confirme a falta de resposta ao pinçamento do dedo do pé nos animais anestesiados. Vortex o vírus novamente. Carregue uma ponteira de pipeta de 20 microlitros com 10 microlitros de vírus.Adicione cuidadosamente gotas de vírus em uma narina de até três animais sedados antes de repetir a inoculação do outro lado. Em seguida, coloque todos os camundongos em decúbito esternal em gaiolas quentes com monitoramento até a recuperação total e pese cada camundongo diariamente por 10 dias. No final do experimento, coloque os camundongos em uma capela de fluxo laminar de nível 2 de biossegurança e prenda o primeiro animal a uma placa de dissecação de espuma absorvente coberta de papel.Use uma tesoura de dissecção para cortar a pele ao longo da linha média abdominal, esticando a pele com uma pinça e prendendo a pele na placa de dissecação. Abra o peritônio para coletar o baço e coloque o baço em um filtro de 70 micrômetros com um prato de 6 centímetros contendo 5 mililitros de DMEM suplementado com 1% de FBS. Divida o diafragma e as costelas até o timo e prenda a costela ao lado para expor a cavidade torácica.Mova o pulmão e o coração para localizar o linfonodo mediastinal próximo ao lado ventral da traqueia. Em seguida, coloque o linfonodo em sua própria peneira em um segundo prato de 6 centímetros contendo 5 mililitros de meio e use êmbolos de seringa de 3 mililitros para amassar suavemente os dois tecidos através da malha de ambos os filtros. Enxágue cada filtro com 1 mililitro de DMEM fresco mais FBS e transfira as suspensões celulares para tubos de centrífuga individuais de 15 mililitros.Colete as células por centrifugação e ressuspenda completamente os pellets em 1 mililitro de DMEM fresco mais FBS por tubo. Em seguida, adicione quatro mililitros adicionais de meio à suspensão da célula do baço e coloque os dois tubos no gelo. Para corar as células para a expressão de CXCR5, inverta o tubo várias vezes para misturar e transfira 2 vezes 10 para as 6 células por amostra em tubos FACS individuais.Adicione 2 mililitros de tampão de coloração a cada tubo e misture as células por vórtice. Pulverizar as células por centrifugação e rejeitar os sobrenadantes. Bata suavemente em cada tubo em papel absorvente duas vezes e sacuda suavemente os dois fundos para ressuspender as células no sobrenadante residual.Bloqueie a ligação inespecífica com 0,2 microlitros de bloco receptor Fc por tubo e agite o tubo suavemente para misturar antes de colocar os tubos no gelo por 10 minutos. No final da incubação, adicione 0,3 microlitros de biotina anti-mouse CXCR5 a cada tubo e misture com movimentos suaves. Coloque os tubos no gelo por uma hora com movimentos suaves em 30 minutos.No final da incubação, adicione 2 mililitros de tampão de coloração aos tubos e vórtice para misturar antes de sedimentar as células por centrifugação. Rejeitar o sobrenadante e agitar para ressuspender as células no tampão residual. Em seguida, coloque os tubos no gelo e rotule as células com anticorpos contra o marcador de superfície de interesse, conforme descrito na tabela, conforme demonstrado.No final da incubação, lavar as células com 2 mililitros de tampão de coloração e ressuspender cada pellet em 400 microlitros de tampão de coloração fresco para análise por citometria de fluxo. Os camundongos infectados pelo vírus PR8 começam a perder peso no sexto dia, atingindo a maior perda no oitavo dia e retornando aos níveis iniciais de peso no dia 10. Como esperado, a perda de peso não é observada em camundongos controle tratados com PBS.A infecção por vírus também leva a uma expansão robusta de linfócitos dentro do linfonodo de drenagem. Conforme observado pela análise por citometria de fluxo, a diferenciação de células T foliculares auxiliares começa no quinto dia e atinge o pico no dia 10 após a infecção com um número robusto de células T foliculares auxiliares induzidas em camundongos infectados pelo vírus influenza em comparação com animais de controle. Além disso, tanto nos linfonodos mediastinais quanto nos baços, o número de células T CD4-positivas específicas para o antígeno da influenza é induzido significativamente em comparação com aqueles observados em camundongos controle com populações aumentadas de células positivas para CXCR5 positivas para PD-1 em animais PR8.Além disso, a coloração intracelular para IL-21 revela que a infecção por PR8 induz uma produção significativamente maior dessa citocina em resposta à infecção por vírus. A coloração imunofluorescente indica a presença de uma reação induzida do centro germinativo em camundongos infectados com PR8, e o ELISA demonstra a geração de anticorpos específicos do vírus influenza em animais infectados pelo vírus. É importante realizar a coloração CXCR5 no gelo por uma hora, pois a qualidade da coloração será afetada pela temperatura e pelo tempo de coloração.Embora tenhamos demonstrado a coloração CXR5 e IL-21, outros marcadores de superfície, fatores de transcrição e citocinas podem ser avaliados por este método para fornecer multidões sobre a diferenciação e função do Tph.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este método descreve o uso de sistema de imagem de Infravermelhos corante baseada em para a detecção de A H1N1 no bronchioalveolar o lavado de fluido (BAL) de camundongos infectados em uma alta sensibilidade. Esta metodologia pode ser realizado em um 96 - ou 384-bem prato, requer &lt;volume de 10 uL de material de teste e tem o potencial para a triagem concomitante de agentes patogénicos múltiplos.

Alta capacidade método de detecção de vírus Influenza

Source: Wang, M., et al, Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates intranasal infection of a mouse with a pathogenic influenza virus to establish a respiratory tract infection. The procedure outlines the administration of the virus into the nasal cavity. The virus enters host cells, replicates, and activates the immune system.

Intranasal Infection of a Mouse with a Pathogenic Influenza Virus

Dois métodos baseados em citometria de fluxo - um ensaio de priming de células T in vitro e coloração de citocinas intracelulares foram utilizados para medir a capacidade de apresentação de antígenos de células dendríticas e respostas de células T específicas do antígeno a uma infecção mutante pelo vírus do Nilo Ocidental em camundongos.

In Vitro Análise do mediada por Myd88 Cellular resposta imune a vírus do Nilo Ocidental Mutant Strain Infection

Há uma falta geral de conhecimento sobre como as vacinas funcionam. Aqui, propomos o uso combinado de genética reversa e camundongos quiméricos da medula óssea para obter informações sobre as respostas imunes iniciais do hospedeiro às vacinas, com foco especial nas células dendríticas e na imunidade das células T.

A administração intranasal de recombinantes Vacinas contra Influenza em quimérico rato Modelos para estudar a imunidade mucosal

Vírus da influenza A (IAVs) são importantes patógenos respiratórios humanos. Para entender a patogenicidade de IAVs e realizar testes pré-clínicos de vacina romance abordagens, modelos animais, imitando a fisiologia humana são necessários. Aqui, descrevemos técnicas para avaliar a patogênese do IAV, respostas humorais e eficácia de vacina usando um modelo do rato da infecção.

Estudos de vírus da influenza A em um modelo do rato da infecção

Nós descrevemos um método para medir a ativação das funções efetoras Fc-mediada por anticorpos que visam a hemaglutinina do vírus da gripe. Este ensaio também pode ser adaptado para avaliar a capacidade dos anticorpos monoclonais ou policlonais soros visando outras glicoproteínas de superfície virais para induzir imunidade mediada por Fc.

Um método para avaliar funções efetoras mediada por Fc induzidas por anticorpos específicos de hemaglutinina de gripe

Um protocolo para avaliar as respostas de células T antígeno-específicas nos órgãos immunoprivileged do Ifnar1- / - modelo murino para a infecção de vírus (ZIKV) Zika é descrito. Este método é essencial para investigar os mecanismos celulares da proteção e imunopatogênese das vacinas ZIKV e também é valioso para sua avaliação de eficácia.

Avaliação das respostas de células T Zika vírus específicos em órgãos Immunoprivileged de infectados Ifnar1- / - ratos

Neste estudo, apresentamos um protocolo para executar dois fotões intravital imagem e célula interação análise na mucosa traqueal murino após infecção com vírus da gripe. O presente protocolo será relevante para pesquisadores estudando a dinâmica de células imunes durante infecções respiratórias.

Interação de célula de imagem latente na Mucosa traqueal durante a infecção de vírus de Influenza usando microscopia Intravital dois fotões

Este artigo descreve um novo modelo de camundongo para a transição de pneumococo de um colonizador assintomático para um patógeno causador de doença durante a infecção viral. Este modelo pode ser facilmente adaptado para estudar interações polimicrobianas e patógeno-hospedeiro durante as diferentes fases de progressão da doença e em vários hospedeiros.

Um modelo de camundongo para a transição de Streptococcus pneumoniae de colonizador para patógeno após coinfecção viral recapitula a doença exacerbada pela idade

O presente estudo apresenta protocolos para avaliar o compromisso de destino precoce de células TFH específicas do vírus e manipular a expressão gênica nessas células.

Acesso à diferenciação precoce de células T CD4+ foliculares específicas de vírus em camundongos infectados por LCMV agudo

Este protocolo fornece instruções para administração intranasal de IAV e análise a jusante de danos pulmonares em camundongos e alterações transcricionais associadas aos tipos de células pulmonares.

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Aprenda a avaliar células T auxiliares foliculares e resposta do centro germinal em camundongos infectados pelo vírus influenza A. Este protocolo orienta pesquisadores em estudos imunológicos de resposta viral.

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