Name: Imagem Dpp Liberação de um disco de asa drosophila (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Aprenda a visualizar a liberação de Dpp em discos de asa de Drosophila usando microscopia confocal. Este método permite estudar fatores genéticos e ambientais que afetam a dinâmica de liberação desta proteína BMP essencial para o desenvolvimento.

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Gostaríamos de agradecer ao Dr. Sarala Pradhan por trabalhar em uma versão anterior deste protocolo. Gostaríamos de agradecer ao NSF-IOS 1354282 pelo financiamento enquanto desenvolvemos este protocolo. Gostaríamos de agradecer ao NIH-NIDCR RO1DE025311 pelo financiamento do nosso laboratório atualmente.

1. Coleta de ovos para gerar larvas para dissecação
<ol><li>Cruz 30-40 virgem fêmea Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu voa para 10-15 masculino Sp / CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu. Nota: Quaisquer dois genótipos contendo Dpp-GAL4 e UAS-Dpp-GFP podem ser usados enquanto os balanceadores tiverem marcadores larvais que permitem a seleção da progênie apropriada durante o estágio larval.</li>
	<li>Para coletar ovos, vire as moscas cruzadas em um frasco fresco de comida e permita que elas coloquem por 3-4 h antes de removê-los do frasco. Para incentivar a postura de ovos, uma pequena quantidade de pasta de fermento feita de levedura granulada misturada com uma pequena quantidade de água pode ser adicionada ao topo dos alimentos antes que as moscas sejam introduzidas no frasco. O mesmo conjunto de moscas cruzadas pode ser mantido e usado por até 7 dias de coleta de ovos. Nota: Qualquer receita padrão de alimentos para fubás Drosophila deve ser aceitável. Usado aqui é a receita de alimentos descrito por Hazegh e Reis20.</li>
	<li>Mantenha os frascos de coleta de ovos a 25 °C por aproximadamente 144 h até que as larvas estejam no terceiro estágio instar (errante).</li>
	<li>Para selecionar as larvas apropriadas para dissecação (aqueles que expressam dpp-gal4 e UAS-Dpp-GFP) primeiro escolher larvas que não são tb. Estas larvas serão de comprimento normal, em vez de curto e gordo.</li>
	<li>Entre as larvas não tb, haverá larvas expressando CyO-GFP e larvas expressando Dpp-GFP. Para selecionar as larvas expressando Dpp-GFP, veja-as um estómicroscópio de fluorescência. Enquanto tanto Dpp-GFP quanto CyO-GFP expressando larve terão alguma fluorescência gfp, o Dpp-GFP expressando larvas pode ser distinguido na medida em que o GFP é restrito aos discos de asa e a fluorescência é muito menos brilhante do que o CyO-GFP expressando larvas. Selecione estas larvas menos brilhantes para dissecação.</li>
</ol>2. Preparação de solução para imagens larvais e dissecação
<ol><li>Para imagens ao vivo de discos de asa, prepare a mídia HL3 modificada21 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,5 mM CaCl2 dishydrate, 4 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 mM trehalose dyhydrate, 115 mM sacarose, 5 mM HEPES). Esta mídia permite que o disco de asa para ser mantido vivo para a imagem21.</li>
	<li>Ajuste o pH para 7,1 usando HEPES e filtre com um filtro de 0,22 μm. Use esta mídia tanto para as dissecações de disco de asa e como a mídia de montagem para imagens ao vivo.</li>
</ol>3. Preparando slides para montagem de disco de asa
<ol><li>Coloque dois pedaços de fita dupla face incolor em largura através de um slide de microscópio, deixando um espaço de cerca de 5 mm entre eles. As partes de fita devem ser longas bastante que as extremidades da fita se encontram niveladas com as bordas da corrediça do microscópio.</li>
	<li>Use uma borda plana (como a extremidade do punho de um par de fórceps dissecando) para pressionar a fita firmemente para o slide para que nenhuma mídia pode infiltrar-se debaixo dela.</li>
	<li>Coloque 25 μL de mídia HL3 modificada entre as duas peças de fita. O disco de asa será montado nesta gota de mídia entre pedaços de fita para que a fita impeça o coverslip de esmagar o disco (Figura 1A).</li>
</ol>4. Dissecando e montando discos de asa para imagem
<ol><li>Dissecar larvas na mídia HL3 modificada preparada26.</li>
	<li>Rasgue delicadamente as larvas ao meio usando dois pares de fórceps e descarte a metade posterior da larva.</li>
	<li>Segure o meio da metade anterior da larva com um par de fórceps e use outro par de fórceps fechados para empurrar os ganchos de boca de volta para a larva até que a larva esteja completamente invertida.</li>
	<li>Os discos de asa podem ser encontrados mais facilmente procurando as curvas afiadas nos dois ramos primários de cor mais escura das traqueias que escorrem por ambos os lados das larvas. Os discos de asa encontram-se diretamente estas curvas nas traqueias em uma larva invertida.</li>
	<li>Retire suavemente os discos de asa e transfira-os para os 25 μL da mídia HL3 no slide do microscópio preparado. É importante certificar-se de que nenhuma parte de traqueia está deixada unida aos discos dissecados da asa porque esta pode fazer com que os discos flutuem, fazendo a imagem latente difícil.</li>
	<li>Disponha o disco de asa para que o lado peripodial da bolsa da asa esteja voltado para cima, longe do deslizamento do microscópio, com o disco deitado (ver Figura 1A,B).</li>
	<li>Cubra o disco de asa e fita com um coverslip e selar o coverslip usando esmalte. Uma vez que o polonês está seco, imediatamente proceder para os passos de imagem abaixo.</li>
</ol>5. Liberação de Dpp da imagem latente
<ol><li>Imagem do disco de asa montado usando um microscópio de varredura de laser confocal com um objetivo de óleo 40x e 488 nm laser. O Dpp-GFP deve aparecer como uma faixa de fluorescência GFP para baixo do centro do disco de asa com pequena puncta de Dpp-GFP sendo liberado a partir desta faixa central de células.</li>
	<li>Coletar imagens a uma velocidade de 2 Hz por 2 min para visualizar a liberação dpp. Para obter melhores resultados, definir o laser em uma configuração apenas forte o suficiente para obter uma imagem clara das células liberadoras de Dpp para evitar o branqueamento excessivo durante a coleta de imagens. As imagens podem ser coletadas como uma série de tempo que pode então ser exportada como arquivos AVI (sem compressão, 3 quadros /s) para obter arquivos de vídeo da versão Dpp.</li>
</ol>

<ol><li>Ferguson, E. L., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decapentaplegic+acts+as+a+morphogen+to+organize+dorsal-ventral+pattern+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Decapentaplegic acts as a morphogen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo.</a> Cell. 71 (3), 451-461 (1992).</li>
<li>Ferguson, E. L., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+enhancement+and+repression+of+the+activity+of+the+TGF-beta+family+member%2C+decapentaplegic%2C+is+necessary+for+dorsal-ventral+pattern+formation+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Localized enhancement and repression of the activity of the TGF-beta family member, decapentaplegic, is necessary for dorsal-ventral pattern formation in the Drosophila embryo.</a> Development. 114 (3), 583-597 (1992).</li>
<li>Wharton, K. A., Ray, R. P., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+activity+gradient+of+decapentaplegic+is+necessary+for+the+specification+of+dorsal+pattern+elements+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An activity gradient of decapentaplegic is necessary for the specification of dorsal pattern elements in the Drosophila embryo.</a> Development. 117 (2), 807-822 (1993).</li>
<li>Raftery, L. A., Twombly, V., Wharton, K., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screens+to+identify+elements+of+the+decapentaplegic+signaling+pathway+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic screens to identify elements of the decapentaplegic signaling pathway in Drosophila.</a> Genetics. 139 (1), 241-254 (1995).</li>
<li>Raftery, L. A., Sanicola, M., Blackman, R. K., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+of+decapentaplegic+and+engrailed+expression+in+Drosophila+imaginal+disks%3A+do+these+genes+mark+the+anterior-posterior+compartment+boundary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The relationship of decapentaplegic and engrailed expression in Drosophila imaginal disks: do these genes mark the anterior-posterior compartment boundary.</a> Development. 113 (1), 27-33 (1991).</li>
<li>Blackman, R. K., Sanicola, M., Raftery, L. A., Gillevet, T., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extensive+3%27+cis-regulatory+region+directs+the+imaginal+disk+expression+of+decapentaplegic%2C+a+member+of+the+TGF-beta+family+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-beta family in Drosophila.</a> Development. 111 (3), 657-666 (1991).</li>
<li>de Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+function+of+decapentaplegic+and+thick+veins+during+the+differentiation+of+the+veins+in+the+Drosophila+wing%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression and function of decapentaplegic and thick veins during the differentiation of the veins in the Drosophila wing.</a> Development. 124 (5), 1007-1018 (1997).</li>
<li>De Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+the+Drosophila+wing%3A+The+development+of+the+veins%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins.</a> Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).</li>
<li>Letsou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Dpp+signaling+is+mediated+by+the+punt+gene+product%3A+a+dual+ligand-binding+type+II+receptor+of+the+TGF+beta+receptor+family%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila Dpp signaling is mediated by the punt gene product: a dual ligand-binding type II receptor of the TGF beta receptor family.</a> Cell. 80 (6), 899-908 (1995).</li>
<li>Nellen, D., Affolter, M., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+serine%2Fthreonine+kinases+implicated+in+the+control+of+Drosophila+body+pattern+by+decapentaplegic%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Receptor serine/threonine kinases implicated in the control of Drosophila body pattern by decapentaplegic.</a> Cell. 78 (2), 225-237 (1994).</li>
<li>Raftery, L. A., Sutherland, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+family+signal+transduction+in+Drosophila+development%3A+from+Mad+to+Smads%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">TGF-beta family signal transduction in Drosophila development: from Mad to Smads.</a> Developmental Biology. 210 (2), 251-268 (1999).</li>
<li>Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inwardly+rectifying+potassium+channels+regulate+Dpp+release+in+the+Drosophila+wing+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Inwardly rectifying potassium channels regulate Dpp release in the Drosophila wing disc.</a> Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).</li>
<li>Dahal, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inwardly+rectifying+K%2B+channel+is+required+for+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An inwardly rectifying K+ channel is required for patterning.</a> Development. 139 (19), 3653-3664 (2012).</li>
<li>George, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+Channel+Contributions+to+Wing+Development+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Ion Channel Contributions to Wing Development in Drosophila melanogaster.</a> G3. 9 (4), Bethesda. 999-1008 (2019).</li>
<li>Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+signaling+at+cytoneme+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Glutamate signaling at cytoneme synapses.</a> Science. 363 (6430), 948-955 (2019).</li>
<li>Teleman, A. A., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dpp+gradient+formation+in+the+Drosophila+wing+imaginal+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dpp gradient formation in the Drosophila wing imaginal disc.</a> Cell. 103 (6), 971-980 (2000).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inwardly+rectifying+potassium+channels+influence+Drosophila+wing+morphogenesis+by+regulating+Dpp+release%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Inwardly rectifying potassium channels influence Drosophila wing morphogenesis by regulating Dpp release.</a> Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).</li>
<li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL4+system+in+Drosophila%3A+a+fly+geneticist%27s+Swiss+army+knife%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).</li>
<li>Hazegh, K. E., Reis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Buoyancy-based+Method+of+Determining+Fat+Levels+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54744(2016).</li>
<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
<li>Hsiung, F., Ramirez-Weber, F. A., Iwaki, D. D., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+Drosophila+wing+imaginal+disc+cytonemes+on+Decapentaplegic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dependence of Drosophila wing imaginal disc cytonemes on Decapentaplegic.</a> Nature. 437 (7058), 560-563 (2005).</li>
<li>Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+Drosophila+cytonemes+for+distinct+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways.</a> Science. 332 (6027), 354-358 (2011).</li>
<li>Kornberg, T. B., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytonemes+as+specialized+signaling+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cytonemes as specialized signaling filopodia.</a> Development. 141 (4), 729-736 (2014).</li>
<li>Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoneme-mediated+contact-dependent+transport+of+the+Drosophila+decapentaplegic+signaling+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein.</a> Science. 343 (6173), 1244624(2014).</li>
<li>Kornberg, T. B., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Communicating+by+touch--neurons+are+not+alone%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Communicating by touch--neurons are not alone.</a> Trends in Cell Biology. 24 (6), 370-376 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

BMPs como Dpp fazer seu impacto significativo quando ligam um complexo de receptores ligados à membrana para causar uma cascata de sinalização intracelular em células vizinhas ou aparentemente distantes. O laboratório do Dr. Thomas Kornberg mostrou que as células que produzem as células de contato com sinal Dpp que recebem o sinal usando estruturas finas de filapodia à base de actina chamadas citonemes15,24,25. Estes dados suger...

As proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs) são essenciais para a embriogênese embrionária precoce e o padrão das estruturas adultas. Os BMPs são produzidos e secretados para afetar a transcrição dos genes-alvo necessários para o crescimento e a diferenciação celular nas células de resposta. Decapentapla (Dpp) é um homolog Drosophila de BMP4 que é importante para o desenvolvimento de estruturas embrionárias e adultas como a asa1,2,3,4. Vários grupos se concentraram no papel de Dpp no padrão de asas de mosca adulta saem por 1) as asas são compostas por duas folhas transparentes de epitélia com um padrão de venação consistente que pode ser facilmente avaliado; 2) os discos de asa também são razoavelmente planos, podem ser cultivados fora da larva, e são simples de imagem e quantificar diferenças no padrão; e 3) o desenvolvimento do padrão de asa é sensível a Dpp de tal forma que pequenas perturbações no caminho terá impacto padrão de venação das asas.
Dpp é produzido em células localizadas no limite anterior/posterior do disco de asa5,6,7,8. Dpp se liga a um complexo de receptores de quinase serina/threonina tipo 19,10. Após a ligação Dpp, o receptor tipo 2 fosforiatos o receptor tipo 1 que, em seguida, fosforiatomães contra Dpp (Mad), um smad 1/5/8 homolog. O SMAD fosforilado recruta um co-Smad adicional (Madea), que permite entrar no núcleo onde regula os genes-alvo, levando a efeitos a jusante, como proliferação ou diferenciação4,11.
Recentemente, o Laboratório Bates mostrou que a liberação inadequada de Dpp dentro do disco de asa pode levar a uma diminuição da fosforiação louca, redução na expressão gênica alvo e defeitos de padronização de asa12,13. Vários canais de íons impactam o desenvolvimento da asa drosophila e estruturas associadas14,15. Esses canais de íons também podem estar envolvidos na liberação do Dpp. Ao determinar o mecanismo de liberação de morfogênio, é importante que haja um método para visualizar eventos de liberação.
Drs. Aurelio Teleman e Stephen Cohen criou uma proteína de fusão Dpp-GFP que é capaz de resgatar a perda de Dpp, o que significa que é biologicamente ativo e é lançado de forma biologicamente relevante16. Aqui, descrevemos como visualizamos os eventos de lançamento do Dpp usando este Dpp-GFP. Esta proteína de fusão é particularmente útil porque gfp é pH sensível de tal forma que quando está em vesículas ácidas, a fluorescência é saciada17. Portanto, quando uma proteína marcada com GFP é liberada de uma vesícula para o ambiente extracelular mais neutro, a intensidade da fluorescência gfp aumenta17. Aproveitamos a sensibilidade ao pH da GFP para determinar se o Dpp-GFP reside em vesículas ácidas. Nós imagemddiscos de asa expressando Dpp-GFP antes e depois da adição de cloreto de amônio, que neutraliza compartimentos intracelulares vesículas18. Encontramos um aumento significativo na fluorescência de puncta após a adição de cloreto de amônio, sugerindo que o Dpp-GFP intracelular é saciado antes da adição de cloreto de amônio18. Concluímos que o Dpp-GFP intracelular reside em compartimentos ácidos ligados à membrana, como vesículas, e é insaciável após a adição de cloreto de amônio para neutralizar o pH dos compartimentos intracelulares18. Isso torna a imagem ao vivo do Dpp-GFP uma técnica útil para visualizar a dinâmica do Dpp no disco da asa drosophila, uma vez que é liberado de compartimentos ácidos para o ambiente extracelular.
Aqui, descrevemos o método que usamos para visualizar eventos de lançamento do Dpp usando o Dpp-GFP. Dpp-GFP pode ser expressa em seu padrão nativo em discos de asa Drosophila usando o sistema UAS-GAL419. Este é o método que foi usado para determinar que os canais Irk impacto Dpp liberação18. Validamos o método por meio de imagens ao vivo z-pilhas. Nós não vemos Dpp-GFP puncta movendo-se dentro do plano de foco na série de tempo, se adquirimos em um plano de foco. Nós também não vemos movimento de Dpp-GFP puncta se nós imaged em um z-pilha. Concluímos que o Dpp-GFP puncta visto usando este método são eventos de liberação, em vez de movimento de vesículas intracelularmente. Este método de imagem ao vivo do Dpp-GFP poderia potencialmente ser usado para testar outros modificadores putativos de liberação Dpp por seu impacto na dinâmica Dpp ou poderia ser modificado para olhar para a dinâmica de outros ligantes

<table><tbody><tr><td>Levedura de padeiro</td><td>Red Star</td><td>&nbsp; </td><td>&nbsp; </td></tr><tr><td>CaCl2 dyhydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas</td><td>VWR</td><td>484-457</td><td></td></tr><tr><td>Fita dupla face</td><td>Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Agar Tipo II</td><td>Apex</td><td>66-104</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu</td><td></td><td></td><td>Este estoque será disponibilizado em breve no Bloomington Drosophila Stock Center</td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu</td><td></td><td></td><td>Este estoque será disponibilizado em breve no Bloomington Drosophila Stock Center</td></tr><tr><td>Pinças Dumont #5</td><td>World Precision Instruments</td><td>500233</td><td>Fórceps para dissecar</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC193780010</td><td></td></tr><tr><td>Light Corn Syrup</td><td>Karo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extrato de malte</td><td>Breiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC223210010</td><td></td></tr><tr><td>lâminas de microscópio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8400</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>RPI</td><td>S22060-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Unha polonês</td><td>Micsroscopy Electronics Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Ácido propiônico</td><td>VWR</td><td>U330-09</td><td></td></tr><tr><td>Farinha de soja</td><td>ADM Ingredientes especiais</td><td>062-100</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Fisher</td><td>S512</td><td></td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-259</td><td></td></tr><tr><td>Trealose dihidratada</td><td>Chem-Impex Internacional, Inc.</td><td>00766</td><td></td></tr> Microscópio confocal amarelo <tr><td></td><td>Quaker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 780</td> de farinha de milho Microscópio <td>Zeiss</td><td></td><td>para imagens ao vivo</td></tr><tr><td>Microscópio Zeiss SteREO Discovery.V8 Microscópio</td><td>Zeiss</td><td></td><td>para dissecações</td></tr></tbody></table>

imagem dpp liberação de um disco de asa drosophila

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

A superfamília transformadora Fator de Crescimento-beta (TGF-β) é essencial para o padrão embrionário precoce e o desenvolvimento de estruturas adultas em organismos multicelulares. A superfamília TGF-β inclui TGF-β, proteína morfogenética óssea (BMPs), Activins, Fatores de Crescimento e Diferenciação e Nodals. Há muito se sabe que a quantidade de ligand expostos às células é importante para seus efeitos. Pensava-se que gradientes de concentração de longo alcance criaram padrão embrionário. No entanto, recentemente, tornou-se claro que o momento da exposição a esses ligantes também é importante para suas conseqüências transcricionais a jusante. Um ligand superfamily de TGF-β não pode ter uma conseqüência desenvolvente até que esteja liberado da pilha em que foi produzido. Até recentemente, era difícil determinar quando esses ligantes eram liberados das células. Aqui mostramos como medir a liberação de um BMP Drosophila chamado Decapentaplegic (Dpp) das células do primordium asa ou disco de asa. Este método pode ser modificado para outros sistemas ou ligantes de sinalização.

A figura 2 mostra resultados representativos de imagem ao vivo deste protocolo. Quando o protocolo é bem sucedido, Dpp-GFP pode ser visto como uma faixa para baixo do centro do disco de asa com núcleos visíveis como círculos não fluorescentes dentro da região dpp-GFP (Figura 2). A liberação de Dpp-GFP é visível como pontuatura fluorescente que aparece e desaparece. Observamos a fluorescência de Dpp-GFP aparecendo e desaparecendo nos corpos celulares e longe dos ...

O momento da exposição a ligantes pode afetar suas conseqüências de desenvolvimento. Aqui mostramos como a liberação de imagem de uma proteína morfogenética óssea Drosophila (BMP) chamada Dpp das células do disco da asa.

Imagem Dpp Liberação de um disco de asa drosophila

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in ...

O DPP afeta o destino celular ligando receptores e enviando um sinal intracelularmente para afetar a transcrição. Se o DPP for produzido, mas não for liberado, ele não tem acesso a receptores e, portanto, não pode desempenhar suas funções. Essa técnica possibilita visualizar a liberação de DPP permitindo que os pesquisadores examinem quais fatores genéticos e ambientais alteram a dinâmica de liberação de DPP.A via de sinalização BMP é conservada de moscas para humanos, por isso esperamos que o mecanismo que dita a liberação de DPP também seja relevante para o desenvolvimento humano e a regeneração. Comece cruzando de 30 a 40 moscas virgens DPP GAL4 com moscas de 10 a 15 moscas UAS DPP-GFP masculinas. Incentive a colocação de ovos adicionando uma pequena quantidade de pasta de levedura a um frasco fresco de alimentos.Para coletar os ovos, vire as moscas cruzadas para o frasco e deixe-as colocar por três a quatro horas antes de removê-los. Mantenha os frascos de coleta de ovos a 25 graus Celsius por aproximadamente 144 horas até que as larvas estejam no terceiro estágio instar. Em seguida, selecione as larvas apropriadas para dissecção.Primeiro, escolha larvas que não sejam TB que serão de comprimento normal em vez de curto e gordo. Para selecionar as larvas expressas DPP-GFP, visualize-as sob um microscópio estéreo de fluorescência. Todas as larvas não-TB terão alguma fluorescência, mas o GFP é restrito aos discos de asa e é menos brilhante nas larvas DPP-GFP.Prepare a mídia HL3 modificada de acordo com as instruções do manuscrito que manterão os discos de asa vivos para imagens. Ajuste o pH para 7.1 com HEPES e depois filtre-o através de um filtro de 0,22 micrômetros. Coloque duas peças de largura de fita dupla face incolor em um slide de microscópio deixando um espaço de cerca de cinco milímetros entre eles e certificando-se de que as extremidades da fita estão lavadas com as bordas do slide.Use uma borda plana para pressionar a fita firmemente para o slide. Adicione 25 microliters da mídia HL3 modificada entre as duas peças de fita. Quando o disco de asa é montado na mídia, as peças de fita evitarão que ele seja esmagado pelo deslizamento de tampa.Para dissecar a larva, coloque-a na mídia HL3 modificada e rasgue-a suavemente ao meio usando dois pares de fórceps. Descarte a metade posterior, depois segure o meio da metade anterior com um par de fórceps e use o outro par para empurrar os ganchos da boca de volta para a larva até que ela seja completamente invertida. Procure as curvas afiadas nos dois ramos primários de cor mais escura da traqueia que escorrem pelos dois lados da larva.Os discos das asas estão diretamente embaixo. Remova suavemente os discos e coloque-os na mídia HL3 no slide preparado certificando-se de que nenhuma peça de traqueia ainda esteja presa aos discos. Organize os discos de asa para que o lado peripodial da bolsa de asa esteja voltado para cima com o disco deitado.Cubra a asa com uma mancha de cobertura e selado com esmalte. Uma vez que o polimento esteja seco, proceda imediatamente com imagens. Imagem do disco de asa montado usando um microscópio de varredura a laser confocal com um objetivo de óleo 40X e um laser de 488 nanômetros.Colete imagens a uma velocidade de dois hertz por dois minutos. Para obter melhores resultados, defina a potência laser forte o suficiente para obter uma imagem clara das células liberadoras de DPP para evitar o branqueamento excessivo. Colete as imagens como uma série temporal e exporte-as como arquivos AVI para obter um vídeo da versão DPP.Quando o protocolo é bem sucedido, o DPP-GFP aparece como uma faixa no centro do disco de asa com núcleos visíveis como círculos não fluorescentes. A liberação de DPP-GFP é visível como puncta fluorescente que aparecem e desaparecem dentro e longe dos corpos celulares. As punctas distintas são provavelmente em citonemes ou em sinápsias de citonemes.Os discos de asa são montados para que a imagem seja feita do lado peripodial. Se o disco de asa for imageado do lado inverso, a fluorescência DPP-GFP aparecerá fora de foco e a resolução será ruim. Quando o GFP não é fundido ao DPP, não são observadas puncta fora dos corpos celulares.Este controle demonstra que o DPP-GFP se comporta de forma diferente apenas do GFP. Além disso, nenhuma puncta fluorescente aparece quando o DPP-GFP não é expresso. Durante este procedimento, é importante que o disco de asa seja montado lado peripodial para cima.Se o disco de asa estiver inadequadamente orientado, o DPP-GFP aparecerá fora de foco. Este método poderia ser usado para estudar a liberação de outros ligantes de sinalização de desenvolvimento, como sem asas ou ouriços. Podemos explorar todos os diferentes fatores ambientais e genéticos que podem afetar a liberação de DPP.Além disso, podemos adaptar este método para estudar a liberação de BMP de outros tipos de células.

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Research

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