Quantificação da adesão celular tumoral em crioseções de nó linfático

Os locais mais frequentes para metástase são os linfonodos originais. Somatids podem ser usados para detectar a afinidade adesiva entre as seções de linfonodos das células tumorais in vitro. Uma vantagem dessa técnica é que seções de linfonodos frescos fornecem uma complexidade natural do tecido original, o que não seria possível recriar usando proteínas purificadas.

Este método pode ser útil para estudos de oncologia molecular que buscam identificar genes ou terapias que interferem com a adesão das células tumorais em órgãos alvo metastáticos, como linfonodos. Para colher os linfonodos dentro de trinta minutos de sacrifício, coloque o rato Wistar adulto em recumbência dorsal em uma placa de dissecção limpa à temperatura ambiente e pulverize a pele com álcool isopropílico de 70%. Usando instrumentos esterilizados, levante a pele abdominal e faça uma incisão medial da pele para expor as vísceras abdominais.

Extrair o intestino até que os linfonodos torácicos e abdominais se tornem visíveis. Utilizando uma tesoura de ponta sem corte, extirve cuidadosamente os linfonodos sem ferir a artéria mesentérica superior subjacente, e coloque o linfonodo em um tubo de 15 mL contendo 5 mL de PBS estéril. Quando todos os linfonodos tiverem sido colhidos, coloque um linfonodo por criomold de cara para baixo na base de cada molde e adicione apenas o meio de temperatura de corte ideal suficiente para cobrir os tecidos.

Após o congelamento do snap, use um criostat para adquirir seções de 5 a 8 micrômetros de espessura a 22 graus Celsius e colete as seções em lâminas de microscópio de vidro. Crioseções de boa qualidade de fatias consecutivas do mesmo linfonodo são fundamentais para minimizar diferenças entre fatias e facilitar taxas consistentes de adesão celular. Para rotulagem celular tumoral, colher as células de interesse de uma cultura celular adequadamente encenada e suspender as células em um 1 x 10 para as 6 células por mL concentração e meio sem soro.

Transfira 1 mL de células para um novo tubo cônico de 15 mL e rotule as células com 2 microgramas por mL DiI (C18)por dez minutos a 37 graus Celsius, com agitação suave em cinco minutos para evitar a sedimentação celular. No final da incubação, pelota as células por centrifugação e lave as células rotuladas duas vezes com 10 mL de meio fresco livre de soro para remover qualquer corante em excesso. Após a segunda lavagem, suspenda as células a 1 x 10 às 6 células por mL de meio livre de soro, complementadas com concentração de albumina de soro bovino de 0,1%.

Procedendo as células tumorais rotuladas nas seções de tecido de linfonodos colhidos, lave suavemente as seções duas vezes em PBS, seguida de re-hidratação em PBS fresco por quinze minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, bloqueie qualquer ligação não específica com albumina de soro bovino de 2,5% por trinta minutos a 37 graus Celsius, antes de usar um cotonete para secar os slides. Use uma caneta hidrofóbica para desenhar uma barreira em torno de cada seção e adicione 100 microliters de células rotuladas em cada linfonodo circundado.

Depois de uma a duas horas a 37 graus Celsius em uma câmara umidificada, remova quaisquer células de não adesão com quatro lavagens suaves na PBS e fixe as células de fluorescência de adesão restantes com 3,7% de formaldeído em PBS por quinze minutos à temperatura ambiente. Para quantificação do índice adesivo, use o objetivo de 10x em um microscópio de fluorescência para obter imagens TIFF individuais de cada seção nos campos fluorescentes brilhantes e vermelhos. Em seguida, nomeie e salve as imagens sistematicamente antes de abrir as imagens em Fiji.

Após definir a escala, use a ferramenta poligonal para selecionar a região de interesse a ser quantificada. Selecione para quantificar a área do linfonodo. Os dados serão expressos em milímetros quadrados.

Em seguida, selecione Plugins, Analyze, Cell Counter e clique na foto para ser quantificada. Clique em Inicializar e selecione Tipo de contador. Em seguida, clique nas células da foto.

O índice de adesão do linfonodo será expresso como o número de células tumorais aderentes por área coberta de linfonodos. Para inicializar a próxima foto, abra a próxima foto e repita a quantificação como demonstrado. Como observado, a morfologia das células aderentes é arredondada em forma, e as células são heterogêneamente dispersas ao longo do linfonodo de interesse.

O índice de adesão do linfonodo é duas a três vezes maior nas linhas de células cancerígenas de mama negativas NDRG4, em comparação com a medida para células positivas NDRG4 correspondentes. Este procedimento pode ser adaptado para auxiliar as taxas de adesão em outros tecidos alvo metastáticos, como cérebro ou pulmões, para avaliar os locais preferenciais secundários de adesão para células tumorais inseminadas. Lembre-se que os tecidos frescos e congelados devem ser considerados bioarzardous e devem ser manuseados usando precauções de bio-segurança adequadas.