Identificação de novos reguladores de transpiração vegetal por triagem de imagens térmicas em larga escala em Helianthus Annuus

Este protocolo usa imagens térmicas para identificar novos compostos capazes de regular a transpiração da planta. Esta técnica é versátil em relação às espécies vegetais que podem ser testadas, a natureza do composto e o tipo de imagem. Para configurar as plantas para cultivo, adicione primeiro uma camada de quatro centímetros de espessura de vermiculite fina ao padrão de 10 por 20 polegadas bandejas de plantas sem furos e coloque os porta-sementes a dois centímetros de distância nas bandejas.

Encha os suportes de sementes com vermiculite e coloque uma semente de girassol apontada para baixo em cada suporte para que metade da semente permaneça exposta. Quando todas as sementes tiverem sido banhadas, cubra-as com mais dois centímetros de vermiculite fina e névoa com água de cima. Depois de uma hora, cubra as bandejas com tampas e coloque as plantas em uma câmara de crescimento em uma estufa.

Para configurar o sistema hidropônico, encha um recipiente de tamanho adequado para cultivar plantas hidroponicamente com água destilada e adicione fertilizante hidropônico geral, conforme indicado pelo fabricante. Em seguida, use bombas de ar e água para arejar a solução hidropônica resultante com movimento constante. Para preparar os flutuadores hidropônicos, corte uma folha de dois centímetros de espessura expandida espuma de poliestireno para as dimensões do recipiente e use a ferramenta de queima de madeira para fazer furos de um a dois centímetros de diâmetro na espuma.

Em seguida, coloque os flutuadores no sistema hidropônico. Cinco dias após o plantio, retire suavemente as mudas da vermiculite. Coloque imediatamente as mudas em um recipiente de água por 30 minutos para remover o excesso de vermiculite e suavizar os pericarps restantes.

Quando as raízes primárias emergentes estiverem visíveis, remova os pericarps manualmente, conforme necessário. Transfira as mudas dentro dos porta-sementes para os flutuadores de espuma de poliestireno preparados no sistema hidropônico. Cultivar as plantas em hidroponia por dois dias.

Deixe os produtos químicos da pequena biblioteca de compostos descongelarem à temperatura ambiente. Rotule seis microtubos sem tampa para o tratamento de controle negativo, três tubos para o tratamento aba, e os 60 tubos finais para análise dos efeitos dos 20 produtos químicos de interesse em triplicado. Adicione 10 microlitadores de cada produto químico em cada um dos tubos de ensaio, 10 microlitadores de 10 mililitros ABA e sulfóxido de dimetil nos três tubos ABA, e 10 microliters de sulfóxido de dimetil nos seis tubos de controle.

Em seguida, misture cuidadosamente 990 microliters de 10 milimônios hidróxido de potássio MES em cada tubo. Coloque os tubos em um rack de tubo com o controle positivo e negativo e tubos experimentais distribuídos uniformemente dentro do rack para explicar o viés relacionado à posição. Para configurar a câmera de imagem térmica, primeiro monte a câmera em um suporte de cópia e conecte todos os cabos a um laptop.

Ligue a câmera antes de ligar o laptop e abrir o software de análise de imagens térmicas. Para ajustar os parâmetros de gravação, role o mouse sobre o botão Gravar para permitir a seleção do ícone da chave em Configurações de registro e selecione o modo de gravação e as opções apropriados. Para o tratamento das mudas, levante cuidadosamente o suporte de sementes e mergulhe rapidamente a raiz no prato raso que contém água.

Corte a raiz primária de cada muda sob a água de 0,8 a um centímetro abaixo da extremidade mais basal do suporte de sementes para evitar a capitação e insira a planta recém-cortada em um tubo de produtos químicos. Quando todas as mudas forem transferidas, coloque as plantas sob a câmera de imagem térmica e confirme que todas as plantas estão dentro do campo de visão da câmera. Para focar a câmera na superfície dos cotilledons, pressione Control Alt A e clique em Gravar um Filme.

Uma nova janela confirmando a gravação será aberta. Depois de uma a duas horas, pare a gravação. Para análise de dados, abra os arquivos seq corretos e pause o filme.

Clique na região do cursor de medição de três por três pixels e mova o mouse sobre o centro de um cotilledon da primeira planta. Clique à esquerda na imagem para rotular o cotyledon. Rotule o segundo cotyledon da primeira planta da mesma forma.

Quando todas as plantas tiverem sido rotuladas com dois cursores, clique nas regiões de edição do ícone de interesse e no porão do clique esquerdo e role para selecionar todas as regiões de interesse. Em seguida, role o mouse sobre o ícone do visualizador estatístico e selecione o plot temporal. Uma nova janela se abrirá.

Rodar o filme, um gráfico vai preencher com os dados. Em seguida, na janela de gráfico, clique na seta dupla para abrir um novo menu e clique no ícone salvar para salvar os dados. O uso da erithrosina de corante vermelho B demonstra a capacidade de produtos químicos serem visivelmente absorvidos através de uma raiz cortada nos cotilledons de uma muda de girassol dentro de 10 minutos.

Quando as plantas são tratadas com ABA, um aumento na temperatura da folha é detectado em cotilledons de girassol dentro de 30 minutos que está associado à diminuição da abertura estomatal e da condutância estomatal. Além disso, um aumento da temperatura foliar é observado 15 minutos após o tratamento com 10 micromolar ABA e 20 minutos após o tratamento com cinco micromolar ABA demonstrando que a medição da temperatura da folha por imagem térmica é um bom proxy para medir a abertura estomatal e condutância. Neste experimento representativo, um tratamento estatístico baseado em pontuação padrão permite a identificação de produtos químicos que promovam o fechamento ou abertura estomatal.

Para medir os efeitos dos compostos na transpiração, é importante cultivar plantas em condições ideais de luz, umidade e temperatura. Este protocolo pode ser aplicado à maioria dos dicots. Também pode ser usado para avaliar o efeito de novos compostos no desempenho fotossintético, por exemplo, medindo fluorescência de clorofila.