Um ensaio de liposcopia única baseado em microscopia quantitativa para detectar a inhomogeneidade composicional entre lipossomos individuais

A maioria das pesquisas com lipossomos dependem de técnicas ousadas intrinsecamente assumindo que todos os lipossomos sejam idênticos. Ao estudar lipossomos únicos, podem ser observadas inhomogenidades significativas. A única técnica liposonea apresentada aqui nos permite estudar centenas de lipossomos simultaneamente e detectar inhomogeneidades em seu tamanho e composição.

O método pode ser facilmente ajustado para estudar outros sistemas em um único nível lipossomo, como interações de membrana proteica. Tudo que você precisa é do composto que você estuda para ser rotulado fluorescentemente. Com este vídeo, fornecemos aos pesquisadores a ferramenta sobre como eles podem realizar estudos lipossomos únicos.

Esperamos que fique claro que o ensaio pode ser facilmente modificado para estudar uma série de outros tópicos científicos. Para começar, misture os estoques lipídicos preparados 138 microliters de POPC e 120 microliters de colesterol em um frasco de vidro fresco. Em seguida, adicione 500 microliters cada um de dois lipídios fluorescentes rotulados e 50 microliters de DSPE-PEG-biotina.

Solte a tampa do frasco de vidro e estote o frasco em nitrogênio líquido por um a dois minutos. Lyophilize a mistura lipídica congelada durante a noite em uma secadora congelante. Pela manhã, adicione um mililitro de 200 mililitros de tampão D-sorbitol aos lipídios secos.

Aqueça a mistura a 45 graus Celsius e exponha-a à agitação magnética por pelo menos uma hora. Em seguida, congele a suspensão lipídica mergulhando o frasco em nitrogênio líquido e espere até que a suspensão esteja completamente congelada. Em seguida, mergulhe a suspensão congelada em um banho de aquecimento a 55 graus Celsius até que a mistura esteja completamente descongelada.

Exponha a mistura a um total de 11 ciclos de congelamento. Depois disso, usando um mini kit de extrusão, extrude a suspensão lipossa uma vez através de um filtro de policarbonato de 800 nanômetros. Mix 1.200 microliters de BSA e 120 microliters de biotina BSA.

Adicione 300 microliters da mistura a cada poço em um slide de oito poços e incubar o slide por 20 minutos em temperatura ambiente. Incline ligeiramente o slide e a partir da borda de cada poço aspirar o meio. Adicione imediatamente 300 microliters de tampão HEPES em cada poço para lavar.

Lave cada poço oito vezes no total. Adicione 250 microliters de streptavidina e incubar por 10 minutos à temperatura ambiente. Repita as oito lavagens descritas anteriormente.

Coloque o slide no microscópio e ajuste o joystick do microscópio para se concentrar na superfície da câmara. Isso pode ser facilmente feito usando o sinal de reflexo a laser aumentado da interface tampão de vidro como um guia. Em um tubo de microcentrifuge, adicione 10 microliters do estoque lipossomo diluído contendo 20 lipídios totais de micromolar.

Transfira 100 microliters de tampão da câmara para o tubo de microcentrífuga, misture corretamente e transfira os 110 microliters de volta para a câmara. Coloque a câmara sob o microscópio e use uma configuração de microscópio rudimental capaz de detectar sinal a partir dos fluoroforos lipossos para observar os lipossomos sendo imobilizados na superfície. Configure o microscópio como descrito no manuscrito.

Para imagem tanto do DOPE ATTO488 quanto do DOPE ATTO655 fluoroforos nos lipossomos, imagem múltiplos canais. Certifique-se de que cada canal seja imageado sequencialmente para evitar a excitação cruzada. Por exemplo, primeiro tire uma imagem por emocionante em 488 nanômetros e emissão de leitura em 495 a 590 nanômetros.

Depois disso, mude as configurações e tire outra imagem empolgante em 633 nanômetros, mas a emissão de leitura apenas em 660 a 710 nanômetros. Analisar. No menu de imagem, escolha a cor e use a função de canal de mesclagem para criar um composto dos dois canais. Observe se os lipossomos visualizados em dois canais diferentes exibem boa co-localização ou se ocorreu deriva visível.

Para detectar partículas, abra o menu plugins, escolha cometa e clique em detectar partículas. No Cometa, verifique se as configurações estão corretas e pressione OK. Após a execução da análise, duas janelas pop-up com resultados e resumo show. A tabela de resultados contém a razão de intensidade entre os dois canais.

Exportar os resultados da tabela de dados contendo os dados de co-localização. Encaixe a razão de intensidade histograma com uma função gaussiana e extraia o desvio médio e padrão. O desvio médio e padrão pode ser usado para calcular o grau de inhomogeneidade.

Prepare uma formulação liposa que foi extrudada várias vezes através de um filtro de 50 nanômetros. Calibrar o tamanho dos lipossomos comparando a intensidade da fluorescência com os dados de tamanho do DLS. Com as mesmas configurações experimentais de microscópio anteriormente, imagem os lipossomos de calibração.

Trace um histograma de intensidade de raiz quadrada da intensidade da fluorescência dos lipossomos de calibração. Encaixe o histograma com uma distribuição normal de troncos e extraia a intensidade média de fluorescência dos lipossomos de calibração como a média geométrica. Para determinar a relação entre a intensidade da raiz quadrada e o tamanho lipossomo, calcule o fator de correção dividindo o diâmetro lipossomo médio obtido a partir das medidas dinâmicas de dispersão de luz com a média geométrica da intensidade da raiz quadrada.

Calcule os valores de intensidade da raiz quadrada para os lipossomos no experimento de inhomogeneidade composicional e converta esses dois diâmetros multiplicando-se com o fator de correção. Traçar o valor da razão de intensidade em função do diâmetro para os lipossomos composicionais da inhomogeneidade, alcançando assim a inhomogeneidade em função do tamanho lipossomo para uma população de lipossomos que abrange de aproximadamente 50 nanômetros a 800 nanômetros. Neste protocolo, a imobilização superficial bem sucedida dos lipossomos foi imediatamente aparente após a adição da solução lipossa à câmara indicada pelos pontos de intensidade limitada da difração.

Recomenda-se imobilizar lipossomos suficientes para atingir uma densidade de 300 a 400 lipossomos por quadro. Uma densidade menor torna a análise de dados mais demorada, enquanto uma densidade maior torna desafiador distinguir lipossomos únicos. Se todo o campo de visão não estiver em foco adequado, a placa de amostra pode estar inclinando.

Além disso, se os lipossomos parecerem grandes e embaçados, isso indica que o tampão na câmara pode ter evaporado e a superfície secada. A proporção de intensidade histogramas tipicamente revelam uma distribuição gaussiana em torno de um valor médio de razão. Se forem observados fortes desvios de uma distribuição gaussiana, indica um problema de sensibilidade de detecção sugerindo que um subconjunto de lipossomos mostrando um sinal mais fraco foi excluído.

Após a montagem da razão de intensidade histograma com função gaussiana, um grau de valor de inhomogeneidade de 0,23 foi traduzido para 32% da população diferindo em mais de 23% da razão molar média do conjunto. A quantificação da incerteza experimental foi encontrada em 0,1. O ensaio nunca vai ficar melhor do que os materiais que você usa tão liposomos unilaminar de alta qualidade são essenciais.

Então, quando você prepará-los, não corte nenhum canto, como deixar de fora ciclos de congelamento. Imagens ruins levarão a uma alta incerteza experimental e farão você superestimar a inhomogeneidade, então aproveite o tempo para adquirir boas imagens em foco. O que o ensaio basicamente faz é estudar a densidade superficial do rótulo fluorescente.

Se este rótulo fluorescente estiver em um lipídio percolado, este ensaio pode ser usado para testar lipossomos de qualidade para a entrega de medicamentos. A configuração foi aplicada para estudar como os peptídeos se ligam às membranas e sentem a curvatura. Isso deu aos pesquisadores insights únicos sobre as pistas moleculares que regem como os peptídeos são classificados dentro das células.