Desenvolvimento de um modelo experimental não invasivo, assistido a laser de perda de células endoteliais córneas

Os modelos atuais da doença para a perda de células endoteliais da córnea concentram-se na destruição do endotélio e, provavelmente, representam os estágios finais da doença quando o transplante de córnea é inevitável. Novos tratamentos usando células-tronco ou terapia genética, no entanto, estão agora disponíveis que poderiam ser mais úteis para os estágios iniciais da doença, os modelos para os quais faltam. A cirurgia intraocular não invasiva por fotodistração usando um laser Nd:YAG tornou-se um procedimento de rotina para oftalmologistas.

Após a obtenção de olhos suínos recém-enucleados do matadouro local, coloque as amostras em quatro graus Celsius meio completo. Use uma tesoura para remover os tecidos extracelulares e mergulhe os olhos em solução oftalmômica de iodo povidona de 5% povidone por cinco minutos. Em seguida, coloque as amostras desinfetadas em PBS estéreis à temperatura ambiente.

Usando um dispositivo de tomografia de coerência óptica de domínio espectral, tela os olhos para as principais patologias do segmento anterior, como cicatrizes córneas, edema e outras opacities. Após a triagem, posicione os olhos na frente de uma unidade de lâmpada de deslizamento equipada com um laser Nd:YAG com um comprimento de onda de 1.064 nanômetros e um diâmetro focal de 10 micrômetros no ar. Selecione a ampliação de 12X e desvie a iluminação para visualizar as camadas corneais individuais.

Após definir a energia do pulso e o foco apontam para os parâmetros apropriados para a ablação seletiva das células endoteliais da córnea, aplique várias injeções a laser no tecido. Em seguida, sob um microscópio dissecando, coloque uma clara paracentese de córnea perto do limbus e injete viscoelstic para estabilizar a câmara anterior. Em seguida, use uma trefina de oito milímetros para extirpar a córnea central tratada a laser e coloque a córnea isolada em um poço de uma placa de 12 poços endotelial.

Quando todas as córneas tiverem sido coletadas, adicione três milímetros de meio completo a cada amostra bem e incubar os espécimes por até três dias a 37 graus Celsius. No final da incubação, substitua o meio em cada poço por 4% de paraformaldeído sem metanol no tampão de Sorensen para uma incubação de 20 minutos à temperatura ambiente. Ao final da incubação, coloque as amostras fixas em 20% de sacarose na PBS por cerca de uma hora até as córneas afundarem.

Transfira as amostras para 30% de sacarose em PBS durante a noite antes de incorporar os tecidos em temperatura de corte ideal para armazenamento a menos 80 graus Celsius. Use um conjunto criostat para menos 27 graus Celsius para obter seções de 10 micrômetros de espessura dos tecidos congelados coletando cada seção em um slide de microscópio dentro de um minuto após sua aquisição. Em seguida, armazene os slides a menos 80 graus Celsius até a coloração.

Para a coloração de hematoxilina e eosina, o ar seque as seções congeladas por vários minutos para remover a umidade antes de colorir com hematoxilina filtrada de 0,1% Mayer por 10 minutos em um tubo de 50 mililitros. No final da incubação, enxágue os slides em água dupla destilada por cinco minutos em uma cuvette. Em seguida, mergulhe os slides em 0,5% eosin 10 vezes, seguido de mergulho enxaguando em água dupla destilada até que a eosina pare de estorar.

Mergulhe os slides enxaguados 10 vezes em 50% de etanol e 10 vezes em 70% de etanol. Após a última queda de 70% do etanol, equilibre as seções em 95% de etanol por 30 segundos, seguido por 60 segundos em 100% etanol antes de várias quedas no xileno. Em seguida, monte os espécimes com deslizamento de tampa antes de obter imagens em um microscópio de luz.

Duas imagens de microscopia de fótons e leves devem ser avaliadas independentemente como nenhum dano, muito dano ou quantidade correta de dano. Com base nessas avaliações, um mapa de calor pode então ser calculado para selecionar a constelação certa de parâmetros a laser para ablação seletiva das células endoteliais da córnea com danos mínimos ao tecido circundante. Análises anteriores determinaram que o ponto focal do laser deve estar pelo menos 0,15 milímetros atrás do endotélio córnea para a menor energia de pulso testada.

Para energias de pulso superiores a 2,9 milijoules, a maior distância focal testada ainda está muito próxima do endotélio. Vários agentes citoprotetores podem ser testados enquanto os espécimes excisados estão em cultura. Se comprovadamente bem sucedidas, elas podem ser adicionadas à solução de irrigação para tratamento.