Name: Desenvolvimento de um modelo experimental não invasivo, assistido a laser de perda de células endoteliais córneas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: Aprenda a criar um modelo ex vivo de ceratopatia bolhosa em estágio inicial usando laser Nd:YAG para destacar células endoteliais córneas de olhos suínos. Este método não invasivo auxilia pesquisadores a estudar dinâmicas celulares e desenvolver terapias para doenças corneanas.

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Agradecemos a Christine Örün e Jan A. M. Sochurek pela ajuda com métodos experimentais.

Todos os procedimentos envolvendo tecido animal seguem as diretrizes do Comitê de Ética e Cuidado Animal local.
1. Preparação da cultura de órgãos e tratamento a laser
<ol><li>Obtenha olhos suínos recém-enucleados do matadouro local. Mantenha-os frios (4 °C) no meio águia modificado (DMEM) modificado de Dulbecco com alta glicose, suplementado com L-glutamina, piruvato de sódio, penicilina/estreptomicina (1%) e soro suíno (10%), a partir de agora referido neste artigo como meio completo.</li>
	<li>Remova os tecidos extracelulares com uma tesoura e mergulhe os olhos em uma solução oftalmológica de 5% de povidone-iodo por 5 minutos antes de colocá-los em solução salina esterilizada com fosfato tamponado (PBS) até o uso.</li>
	<li>Olhos de tela para as principais patologias do segmento anterior, como cicatrizes na córnea, edema e outras opacidades com um dispositivo de tomografia de coerência óptica de domínio espectral(Tabela de Materiais).</li>
	<li>Posicione os olhos em frente a uma unidade de lâmpada de fenda equipada com um laser Nd:YAG(Table of Materials),que tem um comprimento de onda de 1.064 nm e um diâmetro focal de 10 μm de ar. NOTA: Para um posicionamento ideal é utilizado um aparelho de retenção impresso em 3D, que foi projetado para segurar o olho firme, sem colocar muita pressão sobre ele(Figura 1).</li>
	<li>Use uma ampliação de 12x e desvie a iluminação para visualizar as camadas córneas individuais.</li>
	<li>Defina a energia de pulso (por exemplo, 1,6 mJ) e o ponto de foco (por exemplo, 0,16 mm) para ablação seletiva de células endoteliais.</li>
	<li>Coloque uma paracentese de córnea clara perto do membro e injete viscoelástico(Tabela de Materiais)para estabilizar a câmara anterior.</li>
	<li>Excisão da córnea central tratada a laser usando uma tifina de 8 mm.</li>
	<li>Coloque a córnea excisa em um poço de 12 poços com o sítio endotelial voltado para cima e incubar o espécime em 3 mL de meio completo a 37 °C por até 3 dias. NOTA: Potenciais agentes citoprotetores podem ser adicionados ao meio durante esta etapa.</li>
</ol>2. Preparação para a histologia
<ol><li>Prepare o buffer de Sorensen com um pH de 7,4 contendo 19,6 mL de 133 mM KH2PO4 e 80,4 mL de 133 mM Na2HPO4.</li>
	<li>Remova o meio do poço contendo córneas e fixar o tecido por 20 min à temperatura ambiente (RT) usando paraformaldeído livre de metanol (4%) no tampão de Sorensen.</li>
	<li>Coloque o tecido em 20% de sacarose na PBS até que o tecido afunde (1 h) e depois em 30% de sacarose na PBS durante a noite no RT. Tome cuidado para evitar o contato com bolhas e a interface da superfície do ar. Incorpore tecido no composto de temperatura de corte ideal (OCT) e armazene a -80 °C.</li>
	<li>Corte as seções de 10 μm de espessura usando um criostato a -27 °C. NOTA: Uma escova de cabelo de camelo é útil para ajudar a guiar a seção emergente sobre a lâmina da faca.</li>
	<li>Transfira a seção para um slide de microscópio tocando o slide para o tecido dentro de 1 min de corte para evitar a secagem congelada do tecido. Armazene os slides a -80 °C.</li>
</ol>3. Coloração de hematoxilina e eosina (H&E)
<ol><li>Seções secas a ar por vários minutos para remover a umidade.</li>
	<li>Mancha com hematoxilina mayers filtrada por 10 min em um tubo de 50 mL.</li>
	<li>Em um frasco de Coplin, enxágue em ddH2O fresco por 5 min e mergulhe em 0,5% eosin 10x.</li>
	<li>Mergulhe em ddH2O até que a eosina pare de estriae e depois mergulhe em 50% (10x) bem como 70% (10x) EtOH.</li>
	<li>Equilibre em 95% EtOH (30 s) e 100% EtOH (60 s) antes de mergulhar em xileno várias vezes.</li>
	<li>Finalmente montar e cobrir o espécime antes de tirar imagens usando um microscópio leve.</li>
</ol>

<ol><li>DelMonte, D. W., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+physiology+of+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cataract+and+Refractive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Anatomy and physiology of the cornea.</a> Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).</li>
<li>Edelhauser, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+balance+between+corneal+transparency+and+edema%3A+the+Proctor+Lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (5), 1754-1767 (2006).</li>
<li>Tuft, S. J., Coster, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corneal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">The corneal endothelium.</a> Eye. 4, London, England. Pt 3 389-424 (1990).</li>
<li>Bourne, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+the+corneal+endothelium+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">Biology of the corneal endothelium in health and disease.</a> Eye. 17, 912-918 (2003).</li>
<li>He, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+map+of+the+human+corneal+endothelial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3D map of the human corneal endothelial cell.</a> Scientific Reports. 6, 29047(2016).</li>
<li>Gain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Survey+of+Corneal+Transplantation+and+Eye+Banking%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking.</a> JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).</li>
<li>Schwartzkopff, J., Bredow, L., Mahlenbrey, S., Boehringer, D., Reinhard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+corneal+endothelium+following+complete+endothelial+cell+loss+in+rat+keratoplasty%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Regeneration of corneal endothelium following complete endothelial cell loss in rat keratoplasty.</a> Molecular Vision. 16, 2368-2375 (2010).</li>
<li>Bredow, L., Schwartzkopff, J., Reinhard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+corneal+endothelial+cells+following+keratoplasty+in+rats+with+bullous+keratopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Regeneration of corneal endothelial cells following keratoplasty in rats with bullous keratopathy.</a> Molecular Vision. 20, 683-690 (2014).</li>
<li>Bartakova, A., Kunzevitzky, N. J., Goldberg, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+Cell+Therapy+for+Corneal+Endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Ophthalmology+Reports%22%5BJournal%5D)">Regenerative Cell Therapy for Corneal Endothelium.</a> Current Ophthalmology Reports. 2 (3), 81-90 (2014).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+three-dimensional+organ+culture+model+for+corneal+wound+healing+and+corneal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Development of a three-dimensional organ culture model for corneal wound healing and corneal transplantation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2840-2846 (2006).</li>
<li>Aron-Rosa, D., Aron, J. J., Griesemann, M., Thyzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+neodymium-YAG+laser+to+open+the+posterior+capsule+after+lens+implant+surgery%3A+a+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+-+American+Intra-Ocular+Implant+Society%22%5BJournal%5D)">Use of the neodymium-YAG laser to open the posterior capsule after lens implant surgery: a preliminary report.</a> Journal - American Intra-Ocular Implant Society. 6 (4), 352-354 (1980).</li>
<li>Vogel, A., Hentschel, W., Holzfuss, J., Lauterborn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavitation+bubble+dynamics+and+acoustic+transient+generation+in+ocular+surgery+with+pulsed+neodymium%3A+YAG+lasers%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Cavitation bubble dynamics and acoustic transient generation in ocular surgery with pulsed neodymium: YAG lasers.</a> Ophthalmology. 93 (10), 1259-1269 (1986).</li>
<li>Vogel, A., Schweiger, P., Frieser, A., Asiyo, M. N., Birngruber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraocular+Nd%3AYAG+laser+surgery%3A+laser-tissue+interaction%2C+damage+range%2C+and+reduction+of+collateral+effects%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Journal+of+Quantum+Electronics%22%5BJournal%5D)">Intraocular Nd:YAG laser surgery: laser-tissue interaction, damage range, and reduction of collateral effects.</a> IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2240-2260 (1990).</li>
<li>Zhu, Q., Zhu, Y., Tighe, S., Liu, Y., Hu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+Human+Corneal+Endothelial+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Engineering of Human Corneal Endothelial Cells In Vitro.</a> International Journal of Medical Sciences. 16 (4), 507-512 (2019).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinamide+inhibits+corneal+endothelial+mesenchymal+transition+and+accelerates+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Nicotinamide inhibits corneal endothelial mesenchymal transition and accelerates wound healing.</a> Experimental Eye Research. 184, 227-233 (2019).</li>
<li>Pescina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+convenient+ex+vivo+model+for+the+study+of+the+transcorneal+permeation+of+drugs%3A+histological+and+permeability+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: histological and permeability evaluation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 63-71 (2015).</li>
<li>Smeringaiova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Wound+Repair+of+the+Organ-Cultured+Porcine+Corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Endothelial Wound Repair of the Organ-Cultured Porcine Corneas.</a> Current Eye Research. 43 (7), 856-865 (2018).</li>
<li>Yamashita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rabbit+Corneal+Endothelial+Dysfunction+Model+Using+Endothelial-Mesenchymal+Transformed+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A Rabbit Corneal Endothelial Dysfunction Model Using Endothelial-Mesenchymal Transformed Cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16868(2018).</li>
<li>Schubert, H. D., Trokel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+repair+following+Nd%3AYAG+laser+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Endothelial repair following Nd:YAG laser injury.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (8), 971-976 (1984).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabbit+Model+of+Corneal+Endothelial+Injury+Established+Using+the+Nd%3A+YAG+Laser%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Rabbit Model of Corneal Endothelial Injury Established Using the Nd: YAG Laser.</a> Cornea. 36 (10), 1274-1281 (2017).</li>
<li>McCally, R. L., Bonney-Ray, J., de la Cruz, Z., Green, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+endothelial+injury+thresholds+for+exposures+to+1.54+micro+m+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Physics%22%5BJournal%5D)">Corneal endothelial injury thresholds for exposures to 1.54 micro m radiation.</a> Health Physics. 92 (3), 205-211 (2007).</li>
<li>Nash, J. P., Wickham, M. G., Binder, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+damage+following+focal+laser+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Corneal damage following focal laser intervention.</a> Experimental Eye Research. 26 (6), 641-650 (1978).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Os resultados deste estudo piloto indicam que um laser Nd:YAG pode ser usado para abmar seletivamente células endoteliais da córnea quando forem escolhidos parâmetros apropriados para dose de energia e posição de ponto de foco.
Como a função endotelial é importante para a transparência da córnea e para a salvaguarda da córnea a partir de edema estromo, os modelos de disfunção endotelial desempenham um papel importante no desenvolvimento de medicamentos anti-edematosos ou procedimentos cirúrgic...

A transparência da córnea é essencial para a transmissão da luz para a retina e seus fotorreceptores1. Nesse sentido, um estado relativo de desidratação é fundamental para manter as fibras de colágeno dentro do estroma da córnea corretamente alinhadas. Esta homeostase é mantida por células endoteliais córneas (CEC) localizadas na membrana de Descemet (DM)2. O endotélio é a camada córnea mais interna. Possui uma importante função de barreira e bomba, que é crucial para a transparência da córnea3. Em contraste com o epitélio, o endotélio não é capaz de se auto-renovar4. Portanto, qualquer dano celular causado por doença ou trauma estimula as células endoteliais remanescentes a aumentar e migrar, para cobrir defeitos resultantes e manter a funcionalidade da córnea5. No entanto, se a densidade do CEC cair abaixo de um limiar crítico, a descompensação do endotélio leva a um edema, resultando em visão turva e desconforto ou até mesmo dor severa4. Apesar da disponibilidade de medicamentos para aliviar os sintomas, atualmente o único tratamento definitivo nesses casos é o transplante de córnea, que pode ser realizado na forma de enxerto de espessura total ou transplante endotelial lamellar. Este último procedimento está disponível como a ceratoplastia endotelial de membrana de Descemet (DMEK), bem como a ceratoplastia automatizada de descascamento de Descemet (DSAEK)6. No entanto, a proteção da CEC remanescente e o aumento de sua sobrevivência podem ser um alvo alternativo, que precisa de um modelo de doença adequado para testar possíveis drogas terapêuticas.
Os modelos atuais de doença de perda de CEC concentram-se na destruição do endotélio através da injeção de agentes tóxicos (por exemplo, cloreto de benzalkonium) na câmara anterior ou por abrasão mecânica das células utilizando uma técnica de descemetorhexis invasiva7,8. Embora esses modelos estejam bem estabelecidos, existem desvantagens como a resposta inflamatória geral e danos colaterais imprecisos. Portanto, esses modelos são mais propensos a representar os estágios finais da doença, quando as opções cirúrgicas acima mencionadas são inevitáveis.
Com os avanços nas estratégias de tratamento celular, como células-tronco e terapia genética, a aplicação dessas terapias celulares poderia ser útil nos estágios iniciais da perda de CEC9. Posteriormente, precisamos de um modelo que represente esses estágios iniciais da doença de forma mais adequada. Nesse sentido, os modelos de cultura celular melhoraram na última década, mas ainda são limitados em sua validade, pois as células in vitro não podem chegar perto de replicar as interações complexas que ocorrem entre os diferentes tipos de células dentro da córnea10. Portanto, os modelos de doenças ex vivo e in vivo ainda estão em alta demanda e melhorar os existentes é de extremo interesse.
A cirurgia intraocular não invasiva por fotodisrupção usando um laser neodímio:YAG (Nd:YAG) tornou-se um procedimento de rotina para oftalmologistas em todo o mundo desde sua introdução no final da década de 197011. A fotointerrupção depende da absorção de luz não linear que leva à formação de plasma, geração de ondas de choque acústicas e criação de bolhas de cavitação, sempre que o local de aplicação estiver localizado em um ambiente líquido12. Em geral, esses processos contribuem para o efeito pretendido do corte preciso do tecido. No entanto, eles também podem ser a fonte de danos colaterais desnecessários que limitam o confinamento local da cirurgia a laser13.
A previsão de efeitos mecânicos resultantes melhorou significativamente através da caracterização do curso de propagação e cavitação da onda de choque. Nosso objetivo é atingir a CEC com o mínimo de dano possível ao tecido circundante para fornecer um modelo de doença experimental não invasiva, assistida a laser para os estágios iniciais da perda de CEC. Para isso, é necessário determinar as energias e posições de pulso ideais dos pontos focais do laser.

<table><tbody><tr><td>BARRON VACUUM TREPHINE</td><td>Katena</td><td>K20-2058</td><td></td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica</td><td>CM 3050S</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águia Modificada' s Meio - alto teor de glicose</td><td>PAA</td><td>E-15009</td><td></td></tr><tr><td>Eye holder</td><td>Auto</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Invertido</td><td>Leica</td><td>DMI 6000 B</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>529568</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Merck</td><td>1065860500</td><td></td></tr><tr><td>Nd:YAG laser</td><td>Zeiss Meditec</td><td>visuLAS YAG II mais</td><td></td></tr><tr><td>OCT Tissue Tek</td><td>Sakura Finetechnical</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010056</td><td></td></tr><tr><td>Soro suíno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12736C</td><td></td></tr><tr><td>Tomógrafo de coerência óptica de domínio espectral</td><td>Placa de cultura de tecidos Heidelberg Engineering</td><td>Spectralis</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dois fótons</td><td></td> de <td></td> 833921 Sarstedt de 12 poços JenLab DermaInspect <td></td></tr><tr><td>Viscoelastic</td><td>OmniVision</td><td>Methocel</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

desenvolvimento de um modelo experimental não invasivo, assistido a laser de perda de células endoteliais córneas

Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

Os lasers Nd:YAG têm sido usados para realizar cirurgias intraoculares não invasivas, como a capsulotomia há várias décadas. O efeito incisivo depende da quebra óptica no foco do laser. Ondas de choque acústicas e bolhas de cavitação são geradas, causando ruptura tecidual. Os tamanhos das bolhas e as amplitudes de pressão variam com a energia do pulso e a posição do ponto focal. Neste estudo, os olhos de porco enucleados foram posicionados em frente a um laser Nd:YAG comercialmente disponível. Foram testadas energias de pulso variáveis, bem como diferentes posições dos pontos focais posteriores à córnea. As lesões resultantes foram avaliadas por microscopia e histologia de dois fótons para determinar os melhores parâmetros para um descolamento exclusivo de células endoteliais córneas (CEC) com dano colateral mínimo. As vantagens deste método são a ablação precisa da CEC, redução dos danos colaterais e, sobretudo, o tratamento sem contato.

Utilizando o procedimento aqui apresentado, tratamos os olhos com um laser Nd:YAG, avaliando diferentes energias de pulso (1,0-4,6 mJ) e posições de pontos focais (distância da superfície posterior da córnea: 0,0−0,2 mm) para encontrar os parâmetros ideais. Foram avaliadas múltiplas réplicas (n = 3) para cada constelação dos parâmetros do laser (12 x 21).
Além do protocolo acima mencionado, a amostra foi analisada com um microscópio de dois fótons antes da fixação e coloração de H&amp;E. O mic...

Aqui, apresentamos um protocolo para desprender as células endoteliais da córnea (CEC) da membrana de Descemet (DM) usando um laser de neodímio:YAG (Nd:YAG) como um modelo de doença ex vivo para ceratopatia bânouca (BK).

Desenvolvimento de um modelo experimental não invasivo, assistido a laser de perda de células endoteliais córneas

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the ...

Os modelos atuais da doença para a perda de células endoteliais da córnea concentram-se na destruição do endotélio e, provavelmente, representam os estágios finais da doença quando o transplante de córnea é inevitável. Novos tratamentos usando células-tronco ou terapia genética, no entanto, estão agora disponíveis que poderiam ser mais úteis para os estágios iniciais da doença, os modelos para os quais faltam. A cirurgia intraocular não invasiva por fotodistração usando um laser Nd:YAG tornou-se um procedimento de rotina para oftalmologistas.Após a obtenção de olhos suínos recém-enucleados do matadouro local, coloque as amostras em quatro graus Celsius meio completo. Use uma tesoura para remover os tecidos extracelulares e mergulhe os olhos em solução oftalmômica de iodo povidona de 5% povidone por cinco minutos. Em seguida, coloque as amostras desinfetadas em PBS estéreis à temperatura ambiente.Usando um dispositivo de tomografia de coerência óptica de domínio espectral, tela os olhos para as principais patologias do segmento anterior, como cicatrizes córneas, edema e outras opacities. Após a triagem, posicione os olhos na frente de uma unidade de lâmpada de deslizamento equipada com um laser Nd:YAG com um comprimento de onda de 1.064 nanômetros e um diâmetro focal de 10 micrômetros no ar. Selecione a ampliação de 12X e desvie a iluminação para visualizar as camadas corneais individuais.Após definir a energia do pulso e o foco apontam para os parâmetros apropriados para a ablação seletiva das células endoteliais da córnea, aplique várias injeções a laser no tecido. Em seguida, sob um microscópio dissecando, coloque uma clara paracentese de córnea perto do limbus e injete viscoelstic para estabilizar a câmara anterior. Em seguida, use uma trefina de oito milímetros para extirpar a córnea central tratada a laser e coloque a córnea isolada em um poço de uma placa de 12 poços endotelial.Quando todas as córneas tiverem sido coletadas, adicione três milímetros de meio completo a cada amostra bem e incubar os espécimes por até três dias a 37 graus Celsius. No final da incubação, substitua o meio em cada poço por 4% de paraformaldeído sem metanol no tampão de Sorensen para uma incubação de 20 minutos à temperatura ambiente. Ao final da incubação, coloque as amostras fixas em 20% de sacarose na PBS por cerca de uma hora até as córneas afundarem.Transfira as amostras para 30% de sacarose em PBS durante a noite antes de incorporar os tecidos em temperatura de corte ideal para armazenamento a menos 80 graus Celsius. Use um conjunto criostat para menos 27 graus Celsius para obter seções de 10 micrômetros de espessura dos tecidos congelados coletando cada seção em um slide de microscópio dentro de um minuto após sua aquisição. Em seguida, armazene os slides a menos 80 graus Celsius até a coloração.Para a coloração de hematoxilina e eosina, o ar seque as seções congeladas por vários minutos para remover a umidade antes de colorir com hematoxilina filtrada de 0,1% Mayer por 10 minutos em um tubo de 50 mililitros. No final da incubação, enxágue os slides em água dupla destilada por cinco minutos em uma cuvette. Em seguida, mergulhe os slides em 0,5% eosin 10 vezes, seguido de mergulho enxaguando em água dupla destilada até que a eosina pare de estorar.Mergulhe os slides enxaguados 10 vezes em 50% de etanol e 10 vezes em 70% de etanol. Após a última queda de 70% do etanol, equilibre as seções em 95% de etanol por 30 segundos, seguido por 60 segundos em 100% etanol antes de várias quedas no xileno. Em seguida, monte os espécimes com deslizamento de tampa antes de obter imagens em um microscópio de luz.Duas imagens de microscopia de fótons e leves devem ser avaliadas independentemente como nenhum dano, muito dano ou quantidade correta de dano. Com base nessas avaliações, um mapa de calor pode então ser calculado para selecionar a constelação certa de parâmetros a laser para ablação seletiva das células endoteliais da córnea com danos mínimos ao tecido circundante. Análises anteriores determinaram que o ponto focal do laser deve estar pelo menos 0,15 milímetros atrás do endotélio córnea para a menor energia de pulso testada.Para energias de pulso superiores a 2,9 milijoules, a maior distância focal testada ainda está muito próxima do endotélio. Vários agentes citoprotetores podem ser testados enquanto os espécimes excisados estão em cultura. Se comprovadamente bem sucedidas, elas podem ser adicionadas à solução de irrigação para tratamento.

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Medicine

Medicina

Este vídeo demonstra um procedimento não invasivo assistido por laser para danificar seletivamente as células endoteliais da córnea no olho suíno. O modelo ex vivo desenvolvido de dano às células endoteliais pode ser usado para estudar doenças do endotélio da córnea.

Ablação seletiva assistida por laser de células endoteliais da córnea suína: uma técnica para induzir lesão endotelial da córnea suína focada para estudos ex vivo

A neovascularização (NV) da córnea pode complicar múltiplas patologias visuais. Utilizando um modelo controlado lesão alcalino-queima, um nível quantificável da NV córnea pode ser produzido para o estudo mecanicista da NV córnea e avaliação de potenciais terapias para doenças neovascular.

Um ferimento Modelo Alkali queima de córnea neovascularização no Rato

Um procedimento totalmente a laser é proposto no transplante endotelial. A técnica cirúrgica baseia-se no uso de um laser de femtossegundo para preparar o tecido doador. A técnica de soldagem a laser é então usada para fixar o endotélio doador na posição correta.

Um &quot;All-a laser&quot; Endotelial Transplant

Aqui, apresentamos o protocolo de neovascularização coroidal induzida por laser de camundongo (CNV), um modelo experimental que recria as características vasculares da degeneração macular relacionada à idade neovascular (DMRI). Uma vez dominado, ele pode induzir a CNV de forma confiável e eficaz como um sistema modelo para testar várias medidas experimentais.

Um modelo de rato para induzida por laser coróide Neovascularização

A cultura primária de células endoteliais da córnea de bovino foi utilizada para investigar o mecanismo de transição endotelial-mesenquimais da córnea. Além disso, um modelo criolesão endotélio corneano de rato foi utilizado para demonstrar transição endotelial-mesenquimais da córnea in vivo.

In vitro e in vivo em modelos para o Estudo de Transição da córnea endotelial-mesenquimal

O seguinte artigo fornece uma técnica fácil, reprodutível para efetivamente criar um modelo do rato sustentável da deficiência límbica (LSCD). Este modelo animal é útil em testar e comparar a eficácia dos tratamentos para as doenças de células estaminais do limbo.

Um procedimento mecânico simples de criar Limbal Deficiência Stem Cell no mouse

Aqui, apresentamos a utilidade da imagem longitudinal na vivo na sequência de alterações morfológicas da neovascularização de coroide do laser-induzida em camundongos.

Na Vivo Imagiologia multimodal e análise do modelo de neovascularização coroide de induzida por Laser de Mouse

Aqui, um protocolo passo a passo para a preparação e o cultivo de botões córneos rachados suínos é apresentado. Como este modelo organo-tipicamente cultivado da cultura do órgão mostra taxas de morte da pilha dentro de 15 dias, comparável às córneas doadoras humanas, representa o primeiro modelo permitindo o cultivo a longo prazo de córneas não-humanas sem adicionar o Dextran tóxico.

Um modelo de cultura de órgão endotelial corneano porcina usando Split córnea botões

Descemet's Stripping Only é um procedimento experimental em que pacientes com gutae córnea central resultante da Distrofia Corneal Endotelial De Fuchs têm a membrana de Descemet despojada para células periféricas para regenerar a camada endotelial. Apresentamos nova metodologia simulando DSO em córneas humanas distróficas ex vivo com cura acelerada estimulada pelo eFGF1 (NM141).

Um modelo de cultura de órgãos córneas humanas de descascamento de descemet apenas com cura acelerada estimulada pelo fator de crescimento do fibroblasto projetado 1

Este protocolo descreve um método para induzir uma lesão córnea e límbica precisa e reprodutível em um modelo de camundongo. O protocolo é vantajoso, pois permite uma lesão uniformemente distribuída na córnea e no limbo de camundongos altamente curvos.

Indução de lesão de córnea e límplice alcalino pela técnica punch-trephine em modelo murino

Aqui, propomos três métodos diferentes de danificar as fibras sensoriais que inervam a córnea. Estes métodos facilitam o estudo da regeneração axonal em camundongos. Estes três métodos, adaptáveis a outros modelos animais, são ideais para o estudo da fisiologia e regeneração da inervação corneana.

Três estratégias para induzir ceratite neurotrófica e regeneração nervosa na córnea murina

Aprenda a criar um modelo ex vivo de ceratopatia bolhosa em estágio inicial usando laser Nd:YAG para destacar células endoteliais córneas de olhos suínos. Este método não invasivo auxilia pesquisadores a estudar dinâmicas celulares e desenvolver terapias para doenças corneanas.

Desenvolvimento de um modelo experimental não invasivo, assistido a laser de perda de células endoteliais córneas

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