Name: Detectando migração e infiltração de neutrófilos em camundongos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Aprenda três métodos para avaliar a migração e infiltração de neutrófilos em camundongos usando ensaio de bolsa de ar e modelo de artrite. Esta técnica auxilia no desenvolvimento de terapias para doenças inflamatórias.

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de CiênciaNatural da China (os números de subvenção 81430099 e 31500704), Projetos internacionais de Cooperação e Intercâmbio (número de subvenção 2014DFA32950) e o programa de pesquisa da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim ( números de subvenção BUCM-2019-JCRC006 e 2019-JYB-TD013).

Todos os procedimentos experimentais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade chinesa de Pequim.
NOTA: Foram utilizados camundongos C57BL/6 (7 a 8 semanas de idade).
1. Isolamento de neutrófilo
<ol><li>Aquisição de células exudadas peritoneais<ol>
<li>Prepare uma solução de peptona de proteosa fresca de 10% no ddH2O. Calcule o volume necessário de acordo com o número de camundongos. NOTA: Definir o número de camundongos como N, (2N+1) mL de solução deve ser dissolvido e filtrado com antecedência.</li>
		<li>Pulverizar o espaço de trabalho com 70% de etanol. Use um injetor de insulina para desenhar 1 mL de solução peptone e bolhas de descarga.</li>
		<li>Realizar a primeira injeção intraperitoneal de 1 mL de solução peptone por mouse.<ol>
<li>Pegue o mouse em uma posição de cabeça para baixo com uma mão. Desinfete o ponto de injeção com bolas de algodão encharcadas de álcool. NOTA: A posição de injeção preferida está no aspecto lateral do quadrante inferior esquerdo ou direito do abdômen.</li>
			<li>Infunda os reagentes rapidamente. Injete 1 mL na cavidade peritoneal de cada rato com o injetor de insulina. NOTA: O ângulo entre a agulha e a pele deve ser de aproximadamente 15-30° para evitar ferir o intestino ou outros órgãos.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Permitir que a resposta inflamatória se desenvolva da noite para o dia. Depois das 12h, conduza a segunda injeção da mesma forma que a primeira injeção.</li>
		<li>Três horas após a segunda injeção, anestesiar totalmente os camundongos com 5% de isoflurano por 5 min em uma câmara de anestesia a gás a uma velocidade de 2 L/min. Remova os ratos anestesiados da câmara e os sacrifice por luxação cervical. NOTA: Profundidade suficiente de anestesia é garantida beliscando os dedos antes de mover ratos da câmara para a única unidade de respiração. As pernas não devem se mover quando os dedos são beliscados. NOTA: Todas as seguintes etapas devem ser processadas em uma capa de cultura tecidual.</li>
		<li>Pulverizar o mouse com 70% de etanol. Coloque o rato em uma almofada de plástico estéril e conserte os membros com agulhas.</li>
		<li>Use um conjunto estéril de ferramentas cirúrgicas para fazer uma incisão horizontal (~1 cm) no meio do abdômen inferior. Levante a pele do abdômen superior com fórceps e corte ao longo da linha média do abdômen e exponha a parede peritoneal intacta.</li>
		<li>Injete 5 mL de RPMI-1640 completo estéril na cavidade abdominal com uma agulha de 30 G x 1/2". Insira a agulha através da parede peritoneal com a borda chanfrada da agulha virada para cima e injete todo o volume.</li>
		<li>Agite a almofada horizontalmente por 5 minutos. Massageie o abdômen suavemente várias vezes.</li>
		<li>Injete uma agulha de 23 G x 1 1/4" no espaço lateral do abdômen. Extrair o líquido abdominal (~5 mL) e recolhê-lo em um tubo de centrífuga de 50 mL. NOTA: Coloque os tubos no gelo o mais rápido possível em caso de ativação de neutrófilo.</li>
		<li>Injete mais 5 mL de meio completo e repita o procedimento para remover as células restantes do peritôono. Pool o fluido peritoneal no tubo centrífuga de 50 mL.</li>
		<li>Centrífuga o fluido peritoneal agrupado a 400 x g por 10 min à temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Descarte o supernatante. Resuspender as células em 1 mL de RPMI-1640 completo. NOTA: Não vórtice para evitar ativação de neutrófilos.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento de neutrófilos<ol>
<li>Adicione 4 mL de meio gradiente de densidade recém-preparado de 70,2% (por exemplo, Percoll) em um tubo de centrífuga de 15 mL.</li>
		<li>Sobreponha cuidadosamente 4 mL de um gradiente de densidade recém-preparado de 54,8% no meio gradiente de densidade de 70,2% lentamente ao longo da borda do tubo com pontas de pipeta afiadas no tubo centrífuga de 15 mL. NOTA: Tenha cuidado para evitar perturbar a interface entre o médio gradiente de densidade de 54,8% e o meio gradiente de densidade de 70,2%.</li>
		<li>Sobreponha cuidadosamente a suspensão da célula peritoneal de 1 mL em cima da camada média gradiente de densidade de 54,8% lentamente com pontas de pipeta afiada(Figura 1A). NOTA: Tenha cuidado para evitar perturbar a interface entre a suspensão celular e o meio gradiente de densidade de 54,8%.</li>
		<li>Centrífuga a 1.500 x g por 30 min a 22 °C sem frear.</li>
		<li>Colete os neutrófilos na interface do médio gradiente de densidade de 54,8% e 70,2% de camadas médias de gradiente de densidade(Figura 1B) para um novo tubo.</li>
		<li>Adicione 1 mL de RPMI-1640 completo ao meio completo às células coletadas e resuspenda cuidadosamente as células, canalizando suavemente várias vezes. Centrífuga a 100 x g por 10 min na RT e remova cuidadosamente o supernatante.</li>
		<li>Repita a etapa de lavagem (passo 1.2.6) uma vez.</li>
		<li>Adicione 0,5 mL de cultura média à pelota e resuspenda as células, canalizando suavemente várias vezes. Tome uma alíquota de 50 μL para contar as células usando um analisador automático de hematologia.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Ensaio de migração de nêutrons
<ol><li>Medir a migração de neutrófilos pela Transwell como say9 ou o ensaio da câmara de Zigmond como descrito anteriormente10,11.</li>
</ol>3. Ensaio de bolsa de ar
<ol><li>Primeira injeção de ar<ol>
<li>No dia 0, anestesiam totalmente os camundongos com 5% de isoflurano por 3 min em uma câmara de anestesia a gás a uma velocidade de 2 L/min, e mantêm a anestesia de cada rato em uma única unidade respiratória com 2% de isoflurano a uma velocidade de 0,5 L/min. NOTA: Profundidade suficiente de anestesia é garantida beliscando os dedos antes de mover ratos da câmara para a única unidade de respiração. As pernas não devem se mover quando os dedos são beliscados.</li>
		<li>Use um filtro de 0,22 μm anexado a uma seringa de 5 mL para obter um volume de 3 mL de ar esterilizado.</li>
		<li>Levante a pele traseira do mouse anestesiado com pinças e injete subcutâneamente 3 mL de ar esterilizado usando uma agulha de 26 G x 3/8".</li>
		<li>Após o tratamento, remova os camundongos da unidade de respiração. Monitore os ratos para garantir que eles estejam vivos até que comecem a se mover.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Segunda injeção de ar<ol>
<li>No dia 3, injete mais 3 mL de ar esterilizado no bolso de ar previamente estabelecido para sustentar a bolsa de ar conforme descrito na seção 3.1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tratamento<ol>
<li>No dia 6, 6 h antes do sacrifício, injete diferentes tratamentos na bolsa de ar. Injetar 1 mL de salino tampão de fosfato (PBS) como um controle negativo. Injete 1 mL de 1 μg/mL LPS como o controle positivo para induzir inflamação local.</li>
		<li>Anestesia total camundongos com 5% de isoflurano por 3 minutos em uma câmara de anestesia a gás a uma velocidade de 2 L/min, e manter a anestesia de cada rato em uma única unidade respiratória com 2% isoflurane a uma velocidade de 0,5 L/min. Prepare tampão de lavagem de acordo com tabela de materiais. NOTA: Profundidade suficiente de anestesia é garantida beliscando os dedos antes de mover ratos da câmara para a única unidade de respiração. As pernas não devem se mover quando os dedos são beliscados.</li>
		<li>Para cada bolsa de ar, lave a bolsa de ar com 1 mL de tampão de lavagem e colete o exudata inflamatório em um tubo de centrífuga de 15 mL. Lave a bolsa de ar com 2 mL de tampão de lavagem 2x e colete a exudação inflamatória no mesmo tubo de centrífuga.</li>
		<li>Centrífuga a 100 x g por 10 min na RT. Descarte as células supernatantes e resuspenda em 1 mL de tampão de lavagem. Conte as células para quantificar a razão de neutrófilo usando o analisador automático de hematologia. NOTA: Veja os resultados representativos na Figura 2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Indução do modelo de camundongo seduvante induzido por adjuvante (AA)
<ol><li>Suspenda o adjuvante completo da Freund (CFA) vórtices de pelo menos 5 s e, em seguida, desenhe 100 μL de suspensão em um injetor de insulina. NOTA: Recomendamos o uso completamente novo CFA em experimentos para garantir a esterilidade.</li>
	<li>Ratos anestesiados como descrito na etapa 3.1.1.</li>
	<li>Marque a pata escolhida e injete 20 μL de CFA no espaço articular do tornozelo. Injete 20 μL de suspensão em quatro pontos periarticulares na pata escolhida (80 μL no total).</li>
	<li>Remova os ratos da unidade de respiração e coloque os ratos processados em uma nova câmara. Monitore os camundongos para garantir que eles estejam respirando até recuperarem a capacidade de se mover.</li>
	<li>A cada 3 dias, avalie o diâmetro da articulação medindo o diâmetro da articulação do tornozelo usando um medidor de espessura do bolso (Figura 3A).</li>
	<li>A cada 3 dias, avalie a gravidade da artrite por critério de pontuação da artrite (Figura 3C): 0, normal, nenhuma evidência de eritema e inchaço; 1, a artrite mais leve, eritema e inchaço leve confinado às lonas ou articulação do tornozelo; 2, artrite moderada, eritema e inchaço leve que se estende do tornozelo até as tarsals; 3, artrite grave, eritema e inchaço moderado que se estende do tornozelo às articulações metatarsas; 4, a artrite mais grave, eritemthema e inchaço severo abrangem o tornozelo, pé e dígitos, ou anquilose do membro.</li>
</ol>5. Coloração imunohistoquímica de seções articulares
<ol><li>Isolamento conjunto<ol>
<li>Sacrifique o rato na seção 4 usando luxação cervical após anestesia com isoflurano. Pulverizar o mouse com 70% de etanol.</li>
		<li>Retire a pele e parte do músculo da perna traseira com pinças e tesouras. Pulverize a articulação com 70% de etanol e remova o resto dos músculos usando uma toalha de papel.</li>
		<li>Fixar a articulação do tornozelo em 4% paraformaldeído por 2 dias na RT. Decalcifique a articulação em 10% EDTA por 1 mês na RT e mude o médio semanal.</li>
		<li>Incorpore o tecido em parafina e prepare seções de tecido de 4 μm de espessura.<ol>
<li>Coloque o tecido em um molde marcado com certo volume de parafina líquida. Esfrie brevemente.</li>
			<li>Coloque a espessura em 4 μm e corte fatias em um microtome. Seções flutuantes em um banho de água de 43 °C.</li>
			<li>Monte as seções em slides e coloque os slides no forno a 70 °C por 2 h. Para uso futuro, conservar os slides a -20 °C.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Safranino O e mancha verde rápida de seções articulares NOTA: As seguintes etapas de coloração são realizadas na RT.<ol>
<li>Coloque os slides da etapa 5.1.4.3 em um rack e realize as seguintes lavhes para reidratar na RT: xileno por 5 min (3x), 100% de etanol por 2 min (2x), 95% de etanol por 2 min (2x), 70% de etanol por 2 min e 50% de etanol por 15 min. Lave água de torneira por 3 min.</li>
		<li>Mancha em solução verde rápida de 0,1% para 5 min. Enxágue em 1% de ácido acético para 10 s.</li>
		<li>Mancha em 0,1% solução de coloração O por 20 min. Mergulhe os slides nas seguintes lavais: 95% de etanol por 2 min (2x), 100% etanol por 2 min (2x) e xileno por 2 min (2x).</li>
		<li>Monte as seções teciduais e observe os tecidos um microscópio. NOTA: Veja imagens representativas na Figura 4A.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloração imunohistoquímica para visualizar neutrófilos<ol>
<li>Asse as seções de parafina por 2 h a 78 °C. Coloque os slides em um rack e realize as seguintes lavas para reidratar na RT: xileno por 15 min (2x), 100% de etanol por 5 min (2x), 95% de etanol por 5 min, 80% de etanol por 5 min, H2O por 3 min e PBS por 3 min. NOTA: Não deixe os slides secarem a qualquer momento durante esta etapa.</li>
		<li>Adicione uma gota de tampão de permeabilização para cobrir o tecido. Seções incubadas em uma bandeja controlada pela umidade a 37 °C.</li>
		<li>Enxágüe desliza na PBS por 3 min (3x). Evite enxaguar o tecido diretamente.</li>
		<li>Realize a recuperação de epitope de antígeno induzida pelo calor usando uma caldeira de pressão.<ol>
<li>Disponha slides em um rack. Mergulhe na caldeira de pressão cheia de tampão de recuperação.</li>
			<li>Coloque a caldeira de pressão em um forno de micro-ondas. Coloque o forno de micro-ondas a 600 W e aqueça os slides por 10 min.</li>
			<li>Depois de ferver, mantenha os slides na caldeira para esfriar até 90 °C. Tire os slides e enxágue-os na PBS por 3 min (3x).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aprática de atividade peroxidase endógena em recém-preparada 3% H2O2 na RT por 15 min. Enxágue desliza na PBS por 3 min (3x).</li>
		<li>Esboce um grande círculo ao redor da amostra com uma caneta hidrofóbica, evite tocar na amostra. Bloqueie com 3% de albumina de soro bovino (BSA) em uma câmara controlada pela umidade a 37 °C por 60 min.</li>
		<li>Remova a solução de bloqueio. Adicione 50 μL de anticorpo primário diluído por PBS a cada seção rapidamente. Em seguida, incubar os slides em uma bandeja controlada pela umidade a 4 °C durante a noite. NOTA: Diferentes índices de diluição são usados para diferentes anticorpos (1:25 para MPO e 1:20 para NE).</li>
		<li>No segundo dia, tire a bandeja e deixe-a ficar na RT por 30 min. Em seguida, enxágue os slides na PBS por 3 min (3x).</li>
		<li>Adicione 50 μL de anticorpos secundários diluídos por PBS ao tecido. NOTA: Foram aplicadas diferentes razões de diluição: 1:1.000 para MPO e 1:1.500 para NE.</li>
		<li>Incubar slides em uma bandeja controlada pela umidade a 37 °C por 30 min. Em seguida, enxágue os slides na PBS por 3 min (3x).</li>
		<li>Desenvolva-se em solução diluída 3,3'-diaminobenzidina (DAB) por 5 min. Fique de olho na reação em caso de desenvolvimento de uma cor escura. Enxágüe os slides em água destilada.</li>
		<li>Contralforme os slides em hematoxilina por 10 s. Enxágue os slides na água da torneira por 5 min.</li>
		<li>Enxágüe em solução de diferenciação super-rápida de álcool ácido para 3 s. Em seguida, enxágue na água da torneira por 10 min.</li>
		<li>Mergulhe os slides nas seguintes lavas na RT: 80% de etanol por 5 min, 95% de etanol por 5 min, 100% de etanol por 5 min e xileno por 15 min (2x). Corrija o deslizamento de cobertura com solução de montagem. Observe o tecido um microscópio. NOTA: Veja imagens representativas na Figura 4B.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-Mediated+Delivery+of+Dexamethasone+Palmitate-Loaded+Liposomes+Decorated+with+a+Sialic+Acid+Conjugate+for+Rheumatoid+Arthritis+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment.</a> Pharmaceutical Research. 36 (7), 97(2019).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Protocolos detalhados de neutrófilos altamente purificados do sangue periférico7,medula óssea e tecidos18 estão disponíveis há muito tempo. Aqui adotamos um método de isolar neutrófilos do fluido peritoneal19 no qual os neutrófilos maduros permanecem inativados para estudos anti-inflamatórios e antioxidantes.
Usamos o experimento da bolsa de ar para explorar a infiltração induzida pelo LPS de neutrófilos in vivo. Este méto...

Os neutrófilos são os glóbulos brancos mais abundantes e representam 50-70% de toda a população de glóbulos brancos em humanos1. Os neutrófilos são um dos principais respondentes durante a inflamação aguda. Os neutrófilos podem ser recrutados para locais de inflamação através da orientação de citocinas e quimokinas liberadas pelas células residentes em tecido2,3,4, que é mediada pelas interações entre moléculas de adesão celular na superfície de neutrófilos e células de endotelo vascular5. Os neutrófilos são fundamentais para hospedar a defesa e desempenham um papel nas reações inflamatórias patológicas devido à sua poderosa capacidade de danificar o tecido através da liberação de espécies de oxigênio reativa (ROS) e outras moléculas prejudiciais ao tecido3,6.
Estudos anteriores descreveram vários protocolos de isolamento de neutrófilos de camundongos ou humanos. Oh et al. demonstrou um método de separação de gradiente de densidade para isolar neutrófilos humanos de sangue humanointeiro 7. No entanto, o isolamento de neutrófilos suficientes do sangue do rato é difícil devido ao pequeno volume sanguíneo. Alternativamente, um grande número de neutrófilos de rato puro e viável pode ser obtido a partir de fluido peritoneal de camundongos, e esses neutrófilos purificados podem ser usados ex vivo para examinar vários aspectos das funções celulares ex vivo, incluindo infiltração de neutrófilos, migração, quimiotaxe, explosão oxidativa, citocina e armadilha extracelular de nêutrons (NET) produção8. Ensaios transwell9 ou câmara zigmond10,11 podem ser usados para avaliar a migração de neutrófiloino in vitro. O modelo de bolsa de ar é usado para avaliar a migração e infiltração de neutrófilos in vivo. O modelo subcutâneo da bolsa de ar é conveniente no modelo animal vivo para estudar a migração de células inflamatórias.
Tradicionalmente, os neutrófilos eram considerados como eliminadores de patógenos em fases agudas de inflamação. No entanto, descobertas recentes mostraram que os neutrófilos são células complicadas que executam uma variedade significativa de funções especializadas. Os neutrófilos podem regular muitos processos como lesão aguda e reparo, tumorigênese, resposta autoimune e inflamação crônica12,13. Os neutrófilos também modulam as respostas imunes adaptativas e podem regular células B e células T14,15. A escassez substancial de neutrófilos leva à mortalidade ou à imunodeficiência grave em humanos e à esgotamento de neutrófilos em camundongos leva à fatalidade, enquanto a ativação excessiva ou recrutamento de neutrófilos em órgãos causa várias doenças imunológicas, como artrite reumatoide (RA) e lúpus eritematosus sistêmico (SLE)6. Os neutrófilos são as células mais abundantes no fluido sinovial dos pacientes com RA. Os neutrófilos produzem quantidades excessivas de mieloperoxidase (MPO) e elastase de neutrófilo (NE) via degradação, o que agrava a erosão da cartilagem. MPO é uma enzima peroxidase expressa principalmente nos grânulos de neutrófilos16. O NE está associado à destruição articular da cartilagem17. MpO e NE poderiam ser usados para avaliar o status de migração de neutrófilos e infiltração no tecido de pacientes de RA.
Este artigo fornece três métodos convencionais para avaliar a migração de neutrófilos normais induzidos tanto in vivo quanto in vitro, bem como a infiltração de neutrófilos patológicos em um modelo de inflamação específico da articulação do camundongo.

<table><tbody><tr><td>Solução Verde Rápida a 0,1%</td><td>Solarbio</td><td>8348b</td><td>Transfira 20 mg de granada rápida FCF em um frasco para outro copo de 100 mL. Adicione 20 mL de H2O no béquer e dissolva a mancha mexendo para obter uma solução verde rápida a 0,1% e filtre-a usando um filtro Nalgene PES 75mm</td></tr><tr><td>0,1% Safranin O Staining Solution</td><td>Solarbio</td><td>8348a</td><td>Transfira 20 mg de safranina O em um frasco para um copo de 100 ml. Adicione 20 mL de H2O no béquer e dissolva a mancha mexendo para fazer uma solução de coloração de safranina O a 0,1% e filtre-a usando um filtro Nalgene PES 75mm</td></tr><tr><td>0,5 M Solução de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), pH 8,0</td><td>Sigma</td><td>324506</td><td>Estéril</td></tr><tr><td>100% Etanol</td><td>Beijing Chemical Works</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% Metanol</td><td>Beijing Chemical Works</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Centrífuga de Polipropileno Cônico de 15 mL</td><td>Falcon</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>23 G x 1 1/4" Agulha</td><td>BD</td><td>305120</td><td></td></tr><tr><td>26 G x 3/8" Agulha</td><td>BD</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>3% de albumina de soro bovino (BSA)</td><td></td><td></td><td>Dissolver 0,3 g de BSA em 10 mL de PBS</td></tr><tr><td>3% H2O2</td><td></td><td></td><td>Misture 1 mL 30% H2O2 com metanol com 9 mL</td></tr><tr>de kit de metanol<td>3,3'-diaminobenzidina (DAB)</td><td>ZSGB-BIO</td><td>ZLI-9018</td><td></td></tr><tr><td>30 G x 1/2" Agulha</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>30% H2O2</td><td>Beijing Chemical Works</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 5 mL</td><td>BD</td><td>Z683574</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Centrífuga de Polipropileno Cônico de 50 mL</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Mistura de Etanol</td><td></td><td></td> de 50<td>% 500 mL 100% de etanol com 500 mL dH2O</td></tr><tr><td>54,8% de Mistura de Percoll</td><td></td><td></td><td>2,74 mL SIP com 2,26 mL 1&times; PBS, stand still</td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td></td><td></td><td>Mix 700 mL 100% etanol com 300 mL dH2O</td></tr><tr><td>70,2% Percoll</td><td></td><td></td><td>Mix 3,51 mL SIP com 1,49 mL 1&times; PBS, stand still</td></tr><tr><td>80% Ethanol</td><td></td><td></td><td>Mix 800 mL 100% etanol com 200 mL dH2O</td></tr><tr><td>95% Ethanol</td><td></td><td></td><td>Mix 950 mL 100% etanol com 50 mL dH2O</td></tr><tr><td>Álcool Ácido Solução de Diferenciação Super-Rápida</td><td>Beyotime</td><td>C0165S</td><td></td></tr><tr><td>ANTICORPOS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-Mieloperoxidase</td><td>Abcam</td><td>ab208670</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-Elastase Neutrófilo</td><td>Abcam</td><td>ab21595</td><td></td></tr><tr><td>Analisador Automático de Hematologia</td><td>Sysmex</td><td>XS-800i</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>VWR</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>Adjuvante de Freund completo, 10 mg/ml</td><td>sigma</td><td>1002036152</td><td></td></tr><tr><td>lamínula</td><td>CITOGLAS</td><td>10212432C</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de espessura do mostrador</td><td>Mitutoyo</td><td>7301</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Microtubos, 1,5 mL</td><td>Sigma</td><td>Z606340</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal (FBS) Sistema de anestesia a</td> gás <td>Premium PAN</td><td>P30-1302</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ZS Dichuang</td><td>ZS-MV-IV</td><td></td></tr><tr><td>Cabra Anti-Coelho IgG H& L (HRP)</td><td>PPLYGEN</td><td>C1309</td><td>Este é o anticorpo secundário usado na coloração imuno-histoquímica.</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>02-016-1A</td><td></td></tr><tr><td>Solução de coloração de hematoxilina</td> estéril <td>ZSGB-BIO</td><td>ZLI-9609</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolissacarídeo (LPS)</td><td>Sigma</td><td>L3012</td><td></td></tr><tr><td>MEIOS E SUPLEMENTOS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Safranin O-fast Green FCF Modificado Kit de Coloração de Cartilagem Solarbio</td><td></td><td>G1371</td><td></td></tr><tr><td>N-formil-Met-Leu-Phe (fMLP)</td> <td>Sigma</td><td>47729</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Estreptomicina de Penicilina, 100&vezes;</td><td>Invitrogen</td><td>1514022</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>10245207</td><td>Gradiente de densidade médio</td></tr><tr><td>Permeabilização Buffer</td><td></td><td></td><td>Mix 100 &mu; L Triton X-100 com 1 L dH2O para obter 0,01% de tampão fosfato Triton X-100</td></tr><tr><td>Salino (PBS), 1&times;</td><td></td><td></td><td>Misture 90% ddH2O com 10% (v/v) 10&times; PBS, tampão fosfato autoclavado</td></tr><tr><td>salino (PBS), 10 vezes;</td><td></td><td></td><td>Dissolver 16 g de NaCl, 0,4 g de KCl, 2,88 g de Na2HPO4&middot; 2H2O, 0,48 g KH2PO4 (anidro) em 200 mL ddH2O, ajuste o pH 7,4, autoclavado</td></tr><tr><td>PRODUTOS E EQUIPAMENTOS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DE PLÁSTICO EM PÓ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteose Peptona</td><td>Oxóide 1865317</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampão</td><td></td><td></td> <td>de RecuperaçãoMisture 18 mL de tampão de recuperação A com 82 mL de tampão de recuperação B, adicione dH2O a 1000 mL, ajuste o pH para 6.0</td></tr><tr><td>Tampão de recuperação A Estoque para IHC</td><td></td><td></td><td>Dissolva 4,2 g de ácido cítrico (C6H5O7&middot; H2O) em 200 mL de dH2O</td></tr><tr><td>Estoque de tampão de recuperação B para IHC</td><td></td><td></td><td>Dissolver 5,88 g de citrato trissódico di-hidratado (C6H5Na3O7&middot; 2H20) em 200 mL dH2O</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 meio</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Meio</td><td></td><td></td> completo <td>O meio RPMI-1640 é suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina/estreptomicina.</td></tr><tr><td>Agulha de injeção de insulina estéril descartável Shu Rui U40 1 mL</td><td>BD</td><td>328421</td><td></td></tr><tr><td>Slide</td><td>CITOGLAS</td><td>10127105P-G</td><td></td></tr><tr><td>SOLUÇÃO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estoque Isotônico Percoll (SIP)</td><td></td><td></td> <td>Misture 90% (v/v) de percoll com 10% (v/v) 10&vezes; PBS, fique parado por 20 min</td></tr><tr><td>Wash Buffer no</td> ensaio de bolsa <td></td><td></td> de ar <td>Dilua 0,5 M EDTA a 10 mM com HBSS</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Beijing Chemical Works</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detectando migração e infiltração de neutrófilos em camundongos

Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice

Os neutrófilos são um dos principais membros do sistema imunológico inata e desempenham papéis fundamentais na defesa hospedeira contra patógenos e reações inflamatórias patológicas. Os neutrófilos podem ser recrutados para locais de inflamação através da orientação de citocinas e quiminas. A infiltração esmagadora de neutrófilos pode levar a danos teciduais indiscriminados, como na artrite reumatoide (RA). Os nêtrófilos isolados da exoneração peritoneal respondem a um quimioatrativo definido, N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro em ensaios de câmara Transwell ou Zigmond. O experimento da bolsa de ar pode ser usado para avaliar a quimiotáxi dos neutrófilos em direção ao lipopolissacarídeo (LPS) in vivo. O modelo de camundongo seduvante induzido por adjuvante (AA) é frequentemente usado em pesquisas de RA, e a coloração imunohistoquímica de seções articulares com anti-mieloperoxidase (MPO) ou anticorpos elastase anti-nêutrons (NE) é um método bem estabelecido para medir infiltração de neutrófilo. Esses métodos podem ser usados para descobrir terapias promissoras que visam a migração de neutrófilos.

Células exacetadas peritoneal foram coletadas a partir de fluido de lavage de camundongos. As células foram resuspensas em 1 mL de RPMI-1640 completo, em camadas em duas etapas (54,8%/70,2%) Gradiente de densidade descontínua (Figura 1A) e centrífuga sem 1.500 x g por 30 min. Neutrófilos (≥95%, ~1 x 107 neutrófilos/mouse) foram recuperados da interface inferior (Figura 1B).</p...

Aqui, apresentamos três métodos para avaliar a migração de neutrófilos e infiltração tanto in vivo quanto in vitro. Esses métodos podem ser usados para descobrir terapêuticas promissoras visando a migração de neutrófilos.

Detectando migração e infiltração de neutrófilos em camundongos

Neutrophils are a major member of the innate immune system and play pivotal roles in host defense against pathogens and pathologic inflammatory reactions. ...

Este método tenta descrever três métodos frequentemente utilizados para avaliar a migração de neutrófilos normais in vivo e in vitro, bem como a infiltração de neutrófilos patológicos no modelo de artrite do camundongo. Achamos que esse método pode ser útil para outros pesquisadores neste campo. Este protocolo contém os detalhes metodológicos para avaliar a capacidade de migração de neutrófilos nos locais de inflamação usando ensaio de bolsa de ar e artrite induzida por adjuvante.As implicações dessa técnica se estendem para a terapia da artrite, comparando o grupo modelo com o grupo de tratamento. Este método poderia fornecer insights sobre doenças inflamatórias e pode ser aplicado a doença inflamatória intestinal. Demonstrando o procedimento estarão Qingyi Lu e Haixu Jiang, estudantes de pós-graduação do nosso laboratório.Após a anestesia dos camundongos no dia zero, use um filtro de 0,22 mícrons ligado a uma seringa de cinco mililitros para obter um volume de três mililitros de ar esterilizado. Levante a pele traseira do rato anestesiado com pinças e use subcutâneamente um medidor de 26 por agulha de 3/8 polegadas para injetar três mililitros do ar esterilizado. Após o tratament

detecting-migration-and-infiltration-of-neutrophils-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui, descrevemos um método não invasivo de dois fótons abordagem microscopia (2P) para estudo de leucócitos homing na pata do rato. Discutimos os aspectos técnicos de nossa preparação tissular e andar o leitor através de um experimento típico de configuração inicial para coleta de execução e de dados.

Não-invasiva por imagem do Homing leucócitos e Migração In vivo</em

Nós descrevemos um protocolo de brightfield microscopia intravital para medir a dinâmica interações neutrófilos-célula endotelial durante o recrutamento de neutrófilos em resposta à fonte de um chemoattractant neutrófilos in vivo. Neutrófilos rastejando intraluminal, a migração transendotelial e quimiotaxia em tecido muscular do rato cremaster são visualizados com o tempo decorrido, fotografia, vídeo e rastreados com ImageJ.

Rastreamento Crawling neutrófilos Intraluminal, migração transendotelial e Quimiotaxia em tecido por Microscopia intravital Vídeo

Este vídeo demonstra imagens in vivo para estudar a dinâmica de recrutamento de neutrófilos em um local de infecção em um camundongo transgênico imunocomprometido com neutrófilos que expressam GFP. Envolve a injeção de bactérias luminescentes para causar uma infecção. Isso leva ao recrutamento de neutrófilos para o local da infecção, cujo rastreamento é feito por imagem.

Monitoramento da dinâmica de recrutamento de neutrófilos e carga bacteriana no local da infecção em um modelo murino

Descreve-se um protocolo para o isolamento e purificação de neutrófilos de medula óssea do rato por centrifugação de gradiente de densidade e de neutrófilos para rotulagem com corantes CellTracker. Isso representa um método simples, rápido, reprodutível e econômica para a obtenção de um grande número de neutrófilos para estudos funcionais a jusante ou de transferência e controle de experimentos adotivos.

Isolamento, purificação e Rotulagem de neutrófilos da medula óssea do rato de Estudos funcionais e Experimentos de transferência adotiva

A migração trans-epitelial de neutrófilos em resposta à infecção bacteriana mucosa contribui para lesão epitelial e doença clínica. Foi desenvolvido um modelo in vitro que combina patógenos, neutrófilos humanos e camadas de células epiteliais humanas polarizadas cultivadas em filtros transwell para facilitar investigações para desvendar os mecanismos moleculares que orquestram esse fenômeno.

In vitro Ensaio de cocultura para avaliar migração trans epitelial de neutrófilo induzida por patógenos

Desenvolvemos um modelo in vitro que mimetiza um componente importante da resposta inflamatória aguda durante a infecção da bexiga por Escherichia coli uropatogênica.  O ensaio de migração transuroepitelial de neutrófilos permite a avaliação quantitativa da migração de neutrófilos humanos através do epitélio da bexiga, cultivada em suportes permeáveis, em resposta a infecções bacterianas ou substâncias quimioatraentes.

Avaliação quantitativa de neutrófilos humanos migração através de um Cultivadas bexiga Epitélio

Detalhamos um protocolo para monitorar o comportamento de neutrófilos e monócitos em veias mesentéricas em estado estacionário e condições inflamatórias usando microscopia confocal intravital em camundongos anestesiados.

Imagiologia neutrófilos e monócitos em Mesenteric Veins por Microscopia intravital em ratos anestesiados em Tempo Real

Este protocolo atual emprega repórteres fluorescentes, marcação in vivo e técnicas de imagem intravital para permitir o monitoramento do processo dinâmico de priming de neutrófilos em animais vivos.

Imagem intravital de neutrófilos Priming Usando IL-1-driven promotor DsRed Mice Reporter

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar a presença de neutrófilos em seções fixas/permeabilizado histologia e avaliar o estado de ativação de neutrófilos purificados ao vivo. Em particular, o peptídeo de40 MUB vincula lactoferrina presente nos grânulos neutrófilos específicos e terciários. Exposição do conteúdo do grânulo através de permeabilização ou ativação de neutrófilos permite a marcação de neutrófilos.

O peptídeo de40 MUB para uso na detecção de eventos inflamação mediada por neutrófilos

Aqui, mostramos como realizar microscopia intravital em venulos pós-capilar esfarelados do músculo cremaster do rato. Comumente aplicada a diferentes modelos de inflamação e sepse, particularmente aqueles induzidos por quimiocinas e citocinas, destacamos sua relevância no estudo de muscolopatias envolvendo infiltração exagerada de leucócitos musculares.

Infiltração de leucócitos do Músculo Cremaster em Camundongos Avaliados por Microscopia Intravital

A migração de neutrófilos depende da remodelação rápida e contínua da membrana plasmática em resposta ao quimioatraente e suas interações com o microambiente extracelular. Descrito aqui é um procedimento baseado em Microscopia Subcelular Intravital para investigar a dinâmica de remodelação da membrana em neutrófilos injetados na orelha de camundongos anestesiados.

Imagem da migração de neutrófilos na pele de camundongos para investigar a remodelação da membrana subcelular em condições fisiológicas

Aprenda três métodos para avaliar a migração e infiltração de neutrófilos em camundongos usando ensaio de bolsa de ar e modelo de artrite. Esta técnica auxilia no desenvolvimento de terapias para doenças inflamatórias.

Detectando migração e infiltração de neutrófilos em camundongos

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