Name: Protocolos de bioimpressão 3D de bioinks baseados em hidrogel de gelatina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Aprenda protocolos de bioimpressão 3D usando hidrogéis de GelMA para engenharia de tecidos e aplicações biomédicas. Este método demonstra estratégias eficazes para melhorar a impressibilidade e criar estruturas complexas.

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Este trabalho foi patrocinado pelo National Key Research and Development Program of China (2018YFA0703000), a National Nature Science Foundation of China (No.U1609207, 81827804), o Science Fund for Creative Research Groups of the National Natural Science Fundação da China (Nº 51821093).

1. Cultivo de células
<ol><li>Prepare o meio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco, complementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina, usado para cultura de células de câncer de mama humana (MDA-MB-231) e linhas de célula endotelial de veia umbilical humana (HUVEC).</li>
	<li>Prepare o DMEM com l-glutamina (DMEM/F-12), complementado com 10% FBS e 1% penicilina/estreptomicina, usado para cultura de células-tronco mesenquimais de medula óssea (BMSC).</li>
	<li>Defina o ambiente de cultivo como 37 °C e 5% DE CO2. Cultura MDA-MB-231, HUVEC e BMSC, e passar as células em uma proporção de 1:2 quando 90% de confluência é atingido.</li>
</ol>2. Fabricação de microesferas GelMA
<ol><li>Imprima o dispositivo elétrico como a figura 1A com ácido poliláctico (PLA) em uma impressora fundida da modelagem da deposição (FDM). Coloque dois eletrodos de anel de metal no dispositivo elétrico.</li>
	<li>Conecte os dois eletrodos de anel de metal com solo e postes positivos, respectivamente. Coloque a placa de metal conectada com a alta tensão abaixo do eletrodo anel e coloque uma placa de Petri com óleo de silício na placa de metal como um receptor de gotículas.</li>
	<li>Dissolva gelma liofilizado (5% w/v) e fenil de lítio-2,4,6-trimetilbenzoylphosphinate (LAP, 0,5% w/v) na soro fisiola tampão de fosfato de Dulbecco (DPBS) como o bioink (10 mL). Filtre o bioink através de um filtro de 0,22 μm para esterilidade e aqueça-o em um banho de água de 37 °C por 15 min.</li>
	<li>Desagre as células MDA-MB-231 com 3 mL de 0,25% de solução EDTA de 0,02% para 3 min a 37 °C. Células centrífugas em um tubo centrífuga de 15 mL a 100 x g por 5 min para obter uma pelota celular.</li>
	<li>Retire o supernatant. Misture a pelota de célula com 1 mL de bioink preparado lentamente tubulação-lo para evitar a produção de bolhas.</li>
	<li>Coloque 1 mL de bioink (MDA-MB-231) em uma seringa estéril de 3 mL. Alimente o bioink pela força do ar comprimido (~0.5 kPa). Coloque a seringa no dispositivo elétrico. NOTA: O ambiente de impressão deve ser estritamente controlado a uma temperatura de 30 °C e umidade de 50%.</li>
	<li>Ligue a potência de alta tensão e definir a tensão como 0-4 kV. Simultaneamente, ligue a luz de comprimento de onda de 405 nm para cruzar as gotículas GelMA em 5 mL de óleo de silício.</li>
	<li>Despeje a maior parte do óleo de silício de distância, decantando a placa de Petri. Transfira o óleo de silício restante e as microesferas GelMA para um tubo centrífuga de 15 mL usando uma colher.</li>
	<li>Adicione 5 mL de DPBS e agite a mistura uniformemente. Centrífuga do tubo a 100 x g por 5 min e remover o fluido supernatant.</li>
	<li>Repita o passo 2.9 3x.</li>
	<li>Retire as microesferas GelMA com uma colher e cultirá-las em DMEM em uma placa de Petri a 37 °C e 5% CO2 por 3 dias.</li>
	<li>Descarte o meio e lave as microesferas com DPBS. Correção com 2 mL de 4% de paraformaldeído (PFA) para 30 min à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Descarte a PFA e lave as microesferas com DPBS. Permeabilize com 2 mL de 0,5% surfactante nonionic (ou seja, Triton X-100) por 5 min na RT.</li>
	<li>Descarte o surfactante nonionic e lave as microesferas com DPBS. Manchá-los com 2 mL de tetrametilrhodamina (TRITC) faloide por 30 min na escuridão em RT.</li>
	<li>Descarte o TRITC e lave as microesferas com DPBS. Manchá-los com 2 mL de 4-,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) por 10 min na escuridão em RT.</li>
	<li>Descarte o DAPI e lave as microesferas com DPBS. Capture a morfologia com um microscópio de fluorescência confocal.</li>
</ol>3. Fabricação de fibras GelMA
<ol><li>Prepare um bico coaxial como mostrado na Figura 2A. Corrija um bico interno (25 G, OD = 510 μm, ID = 250 μm) e bico exterior (18 G, OD = 1200 μm, ID = 900 μm) com solda. Ligue um tubo de vidro (comprimento = 50 mm, diâmetro interno = 1,2 mm) até o final do bico coaxial.</li>
	<li>Dissolva o pó de alginato de sódio (Na-Alg) que é esterilizado luz ultravioleta (UV) por 30 min em água deionizada a 2% (w/v).</li>
	<li>Prepare uma solução de bioink estéril após o passo 2.3. Aqueça a solução GelMA bioink e Na-Alg em um banho de água de 37 °C por 15 min.</li>
	<li>Desaparado bmscs células com 3 mL de 0,25% trypsin-0,02% solução EDTA para 3 min em 37 °C. Células centrífugas em um tubo centrífuga de 15 mL a 100 x g por 5 min para obter uma pelota celular.</li>
	<li>Retire o fluido supernatant. Misture a pelota celular com 2 mL de bioink GelMA preparado lentamente por tubulação lentamente-lo para evitar a produção de bolhas.</li>
	<li>Coloque 2 mL de bioink (BMSCs) em uma seringa de 10 mL. Coloque 2 mL de solução Na-Alg em outra seringa (10 mL). Alimente-os com duas bombas de seringa, respectivamente (aqui, bioink em 50 μm/min e solução Na-Alg em 350 μm/min). NOTA: O ambiente de impressão deve ser estritamente controlado a uma temperatura de 30 °C e umidade de 50%.</li>
	<li>Ligue a luz de comprimento de onda de 405 nm para irradiar o tubo transparente para cruzar as fibras GelMA. Use uma placa de Petri com DPBS para receber as fibras.</li>
	<li>Retire as fibras GelMA com uma colher de DPBS e cultizá-los por 3 dias no DMEM preparado / F-12 em 37 ° C e 5% CO2.</li>
	<li>Siga os passos 2.12-2.16 para preparar as fibras GelMA para observação morfológica com microscópio de fluorescência confocal.</li>
</ol>4. Fabricação de estruturas complexas de GelMA 3D
NOTA: Figura 3A mostra o esboço de fabricação das estruturas complexas gelma 3D.
<ol><li>Limpe o bioprinter DLP(Figura 3E)com 75% de álcool e expô-lo à irradiação UV por 30 min para esterilidade.</li>
	<li>Dissolva o GelMA liofilizado (10% w/v) e LAP (0,5% w/v) na DPBS. Adicione pigmento comestível magenta na solução (3% v/v) para melhorar a precisão da impressão.</li>
	<li>Filtre a solução através de um filtro de 0,22 μm para esterilidade e aqueça-o em um banho de água de 37 °C por 15 min.</li>
	<li>Construa os modelos 3D com software de design (CAD) auxiliado por computador. Importe os documentos do modelo para o software superior (EFL) do bioprinter DLP aplicado.</li>
	<li>Adicione 10 mL de bioink preparado na calha do bioprinter dlp.</li>
	<li>Defina os parâmetros de impressão no software superior da seguinte forma: intensidade de luz = 12 mW/cm2,duração da irradiação = 30 s, e altura da fatia = 100 μm. Comece a imprimir.</li>
	<li>Retire a estrutura impressa do bioprinter e mergulhe-a em DPBS em uma placa de Petri.</li>
	<li>Desaque as células MDA-MB-231 com 3 mL de 0,25% de solução EDTA de 0,02% para 3 min a 37 °C. Células centrífugas a 100 x g por 5 min em um tubo de 15 mL para obter uma pelota celular.</li>
	<li>Retire o fluido supernatant e misture a pelota celular com 2 mL de DMEM.</li>
	<li>Adicione 100 μL de suspensão celular nas estruturas impressas. Cultiuiná-los por 3 dias no DMEM preparado em 37 °C e 5% CO2.</li>
	<li>Siga os passos 2.12-2.16 para preparar as complexas estruturas 3D para observação morfológica com microscópio de fluorescência confocal.</li>
</ol>5. Fabricação de chips microfluídicos à base de GelMA
NOTA: Figura 4A mostra o esboço de fabricação do chip microfluídico baseado em GelMA.
<ol><li>Dissolva o GelMA liofilizado 10% (w/v) e LAP (0,5% w/v) em DPBS. Filtre a solução GelMA através de um filtro de 0,22 μm para esterilidade.</li>
	<li>Esterilizar o pó de gelatina luz UV por 30 min e adicioná-lo à solução GelMA-LAP preparado no passo 5.1 para uma concentração final de gelatina de 5% (w/v). Aqueça a mistura em um banho de água de 37 °C por 15 min.</li>
	<li>Projete um grupo de moldes(Figura 4B,C)com software CAD e fabrice-os com resina de fotopolímero em uma impressora DLP.</li>
	<li>Preencha os moldes totalmente com o bioink preparado.</li>
	<li>Coloque os moldes em um refrigerador de 4 °C para cruzar a gelatina por 30 min.</li>
	<li>Retire os moldes e demoldo com uma lâmina parcialmente (fisicamente) cruzadas folhas de hidrogel dos moldes.</li>
	<li>Combine as duas folhas de hidrogel demoldadas e vincule-as com a ajuda da GelMA irradiando a 405 nm por 1 min.</li>
	<li>Desaque as células HUVECs com 3 mL de 0,25% de solução EDTA de 0,02% para 3 min a 37 °C. Células centrífugas em um tubo centrífuga de 15 mL para obter uma pelota celular a 100 x g por 5 min.</li>
	<li>Retire o fluido supernatant e misture a pelota celular com 2 mL de DMEM.</li>
	<li>Encha o microcanal totalmente injetando a suspensão celular com um bico e seringa.</li>
	<li>Vire o chip de cabeça para baixo a cada 15 min durante os próximos 3 h para alcançar a semeadura de células uniforme e completa. Cultura as batatas fritas na placa de Petri por 3 dias no DMEM preparado em 37 °C e 5% CO2.</li>
	<li>Siga os passos 2.12-2.16 para preparar os chips microfluídicos para observação morfológica com microscópio de fluorescência confocal.</li>
</ol>

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Os autores não têm nada a divulgar.

Este artigo descreve várias estratégias para fabricar estruturas 3D GelMA, ou seja, microesferas GelMA, fibras GelMA, estruturas complexas GelMA e chips microfluídicos à base de GelMA. A GelMA tem capacidade promissora de biocompatibilidade e formação e é amplamente utilizada no campo da biofabricação. As estruturas da microsfera são adequadas para liberação controlada de medicamentos, cultivo de tecidos e injeção em organismos para terapia adicional21,22,</...

Acredita-se que os hidrogéis sejam um material adequado no campo da biofabricação1,2,3,4. Entre eles, a gelatina methacriloyl (GelMA) tornou-se um dos biomateriais mais versáteis, inicialmente proposto s em 2000 por Van Den Bulcke et al.5. GelMA é sintetizado pela reação direta da gelatina com anidrido glicílico (MA). A gelatina, que é hidrolisada pelo colágeno mamífero, é composta por motivos-alvo da matriz metaloproteinase (MMP). Assim, os modelos de tecidos tridimensionais in vitro (3D) estabelecidos pela GelMA podem idealmente imitar as interações entre células e matriz extracelular (ECM) in vivo. Além disso, as sequências de ácido arginina-glicina-aspartic (DRg), que estão ausentes em alguns outros hidrogéis, como alginatos, permanecem nas cadeias moleculares do GelMA. Isso torna possível perceber o anexo de células encapsuladas dentro das redes de hidrogel6. Além disso, a capacidade de formação da GelMA é promissora. Os grupos de metionlamia nas cadeias moleculares GelMA reagem com o fotoiniciador condições de reação leve e formam laços covalentes após a exposição à irradiação luminosa. Portanto, as estruturas impressas podem ser rapidamente cruzadas para manter as formas projetadas de uma maneira simples.
Com base nessas propriedades, uma série de campos utiliza o GelMA para realizar várias aplicações, como engenharia de tecidos, análise básica de citologia, triagem de medicamentos e biosensoriamento. Assim, várias estratégias de fabricação também foram demonstradas7,8,9,10,11,12,13,14. No entanto, ainda é um desafio realizar bioimpressão 3D com base no GelMA, que se deve às suas propriedades fundamentais. GelMA é um material sensível à temperatura. Durante o processo de impressão, a temperatura da atmosfera de impressão tem que ser estritamente controlada, a fim de manter o estado físico do bioink. Além disso, a viscosidade do GelMA é geralmente menor do que outros hidrogéis comuns (ou seja, alginato, quitosana, ácido hialurônico, etc.). No entanto, outros obstáculos são enfrentados ao construir arquiteturas 3D com este material15.
Este artigo resume várias abordagens para a bioimpressão 3D de GelMA proposta pelo nosso laboratório e descreve as amostras impressas (ou seja, a síntese de microesferas GelMA, fibras GelMA, estruturas complexas gelma e chips microfluidos à base de GelMA). Cada método tem funções especializadas e pode ser adotado em diferentes situações com diferentes requisitos. As microesferas GelMA são geradas por um módulo eletroassistido, que forma força elétrica externa extra para diminuir o tamanho das gotículas. Em termos de fibras GelMA, elas são extrucadas por um bico de bioimpressão coaxial com a ajuda de alginato de sódio viscoso. Além disso, o estabelecimento de estruturas 3D complexas é alcançado com um bioprinter de processamento de luz digital (DLP). Finalmente, propõe-se uma estratégia de cruzamento duas vezes para construir chips microfluídicos à base de GelMA, combinando hidrogel GelMA e chips microfluídicos tradicionais. Acredita-se que este protocolo é um resumo significativo das estratégias de bioimpressão GelMA usadas em nosso laboratório e pode inspirar outros pesquisadores em campos relativos.

<table><tbody><tr><td>0,22 &mu; </td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2- (4-amidinofenil) -6-indoloridina dicloridrato de indoloridina (DAPI)</td> <td>Yeasen Biological Technology Co., Ltd., Xangai, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioimpressora 3D</td><td>SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luz de comprimento de onda de 405 nm</td><td>SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bico coaxial</td><td>SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscópio de fluorescência confocal</td><td>OLYMPUS FV3000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bioimpressora de processamento de luz digital (DLP)</td><td>SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Impressora DLP</td><td>SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS)</td><td>Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meio de águia modificado de Dulbecco com L-glutamina (DMEM/F-12)</td><td>Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EFL Software</td><td>SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>soro fetal bovino (FBS)</td><td>Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gelatina</td><td>Sigma-Aldrich, Xangai, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gelatina metacriloil (GelMA)</td><td>SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>poder de alta tensão</td><td>SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fenil-2 de lítio, 4, 6-trimetilbenzoilfosfinato (LAP)</td><td>SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>paraformaldeído</td><td>Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina</td><td>Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>alginato de sódio (Na-Alg)</td><td>Sigma-Aldrich, Xangai, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRITC faloidina</td><td>Yeasen Biological Technology Co., Ltd., Xangai, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Solarbio Co., Ltd., Xangai, China</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protocolos de bioimpressão 3d de bioinks baseados em hidrogel de gelatina

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Gelatina methacriloyl (GelMA) tornou-se um biomaterial popular no campo da bioimpressão. A derivação deste material é a gelatina, que é hidrolisada do colágeno mamífero. Assim, as sequências de ácido arginina-glicina-aspartic (DRg) e motivos-alvo da metaloproteinase matriz (MMP) permanecem nas cadeias moleculares, que ajudam a alcançar o apego e degradação celular. Além disso, as propriedades de formação da GelMA são versáteis. Os grupos de metionlamia permitem que um material se torne rapidamente cruzado irradiação leve na presença de um fotoiniciador. Portanto, faz muito sentido estabelecer métodos adequados para sintetizar estruturas tridimensionais (3D) com este material promissor. No entanto, sua baixa viscosidade restringe a capacidade de impressão da GelMA. Aqui são apresentados métodos para realizar bioimpressão 3D de hidrogéis GelMA, ou seja, a fabricação de microesferas GelMA, fibras GelMA, estruturas complexas GelMA e chips microfluídicos à base de GelMA. As estruturas resultantes e a biocompatibilidade dos materiais, bem como os métodos de impressão, são discutidas. Acredita-se que este protocolo pode servir como uma ponte entre biomateriais previamente aplicados e GelMA, bem como contribuir para a criação de arquiteturas 3D baseadas em GelMA para aplicações biomédicas.

Durante a fabricação das microesferas GelMA, as gotículas GelMA foram separadas pela força externa do campo elétrico. Quando as gotículas caíram no óleo de silício receptor, eles permaneceram forma esferóide padrão sem caudas. Isso ocorre porque as gotículas GelMA estavam em uma fase aquosa, enquanto o óleo de silício estava em uma fase de petróleo. A tensão superficial que se formou entre as duas fases fez com que as gotículas GelMA mantivessem uma forma esferóide padrão. Em termos de microesferas carregadas de células,...

Apresentado aqui é um método para a bioimpressão 3D de gelatina methacriloyl.

Protocolos de bioimpressão 3D de bioinks baseados em hidrogel de gelatina

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

A biônica à base de hidrogel GelMA tornou-se muito popular na bioimpressão 3D. No entanto, a baixa viscosidade restringe sua impressão. Aqui estamos compartilhando estratégias para imprimir o GelMA em nosso laboratório com outros pesquisadores.Neste vídeo utilizamos plenamente as propriedades especiais deste bioma material e propomos diversos métodos de impressão para diferentes estruturas 3D que poderiam contribuir para outras aplicações biomédicas. Para tomar danos nos órgãos, por exemplo, implicações são potenciais para serem usadas na terapia correspondente, injetando incorporação ou rastreamento das estruturas de GelMA impressas. Não seria fácil dissolver totalmente o GelMA congelado em pouco tempo.Para acelerar o processo de dissolução, um misturador de vórtice poderia ser usado. Todo bioma material usará propriedades especiais íntimas do GelMA. Eu sugeri que um novo chemer deve dar um passeio adequado do que está condicionando crítico ao imprimir.Os detalhes da operação determinam o sucesso dos procedimentos de impressão. É por isso que escolhemos uma demonstração visual para compartilhar com outros pesquisadores. Para fabricar microesferas comece conectando os dois eletrodos de anel de metal com polos terra e positivos.Coloque a placa metálica conectada com a alta tensão abaixo do eletrodo do anel e uma placa de Petri com óleo de silicone na placa de metal como receptor de gotícula. Prepare a bioindálula dissolvendo GelMA e LAP e DPBS filtrando-a através de filtro de 0,22 micrômetros para esterilidade e, em seguida, aqueça-a em um banho de água Celsius de 37 graus por 15 minutos. Despeitar células MDA-MB-231 com três mililitros de 0,25% de trippsina e 0,02% de solução EDTA por três minutos a 37 graus Celsius.Transfira as células para um tubo de 15 mililitros e centrífugas a 100 vezes G durante cinco minutos. Remova o supernasce e misture as células com um mililitro de biointeca preparada, encanar lentamente para cima e para baixo, certificando-se de evitar bolhas de ar. Aspire um mililitro da bioindadeira e mistura celular em uma seringa estéril de três mililitros.Alimente a bioindálida pela força do ar comprimido e coloque a seringa na luminária. Ligue a potência de alta tensão e coloque a tensão de zero a quatro quilovolts. Ligar simultaneamente a luz de comprimento de onda de 405 nanômetros para cruzar as gotículas de GelMA em cinco mililitros de óleo de silício.Decante a placa de Petri para se livrar da maior parte do óleo de silício e use uma colher para transferir o óleo restante e microesferas para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Adicione cinco mililitros de DPBS e agite a mistura centrífuga do tubo a 100 vezes G e remova o supernasce. Transfira as microesferas para uma placa de Petri com DMEM e cultue-as a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por três dias.Após três dias descarte o meio e lave as microesferas com DPBS. Fixá-los com dois mililitros de 4% pfa por 30 minutos em temperatura ambiente, em seguida, descartar o PFA e repetir a lavagem. Permeabilize as células com dois mililitros de 0,5% surfactante não iônico por cinco minutos à temperatura ambiente descarte o surfactante e lave as microesferas com DPBS.Em seguida, colorir as células com TRITC-phalloidin por 30 minutos e depois DAPI por 10 minutos no escuro descartando os corantes e lavando as esferas com DPBS após cada coloração. Imagem das microesferas com um microscópio de fluorescência confocal. Dissolver pó de alginato de sódio esterilizado em água deionizada a uma razão de peso para volume de dois por cento.Prepare a solução de bio tinta estéril como descrito anteriormente, aqueça o alginato de bio tinta e sódio em um banho de água de 37 graus Celsius por 15 minutos. O trypsinize e a centrífuga bMSCs de acordo com o procedimento descrito anteriormente para células MDA-MB 231, em seguida, remova o fluido sobrenanante e resuspenque a pelota celular com 2 mililitros da biointegação do GelMA. Aspire dois mililitros da mistura de células de bioindina em uma seringa de 10 mililitros e dois mililitros da mistura de alginato de sódio em outra seringa.Alimente as soluções com duas bombas de seringa bioindólia a 50 micrômetros por minuto e alginato de sódio a 350 micrômetros por minuto. Ligue a luz de comprimento de onda de 405 nanômetros para irradiar o tubo transparente e cruzar as fibras GelMA. Use uma placa de Petri para receber as fibras e recolhê-las com uma colher.Transfira as fibras para um prato com DMEM/F12 e cultue-as por três dias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após a cultura das células seguem as instruções descritas anteriormente para observar as fibras sob um microscópio de fluorescência confocal. Dissolva o GelMA ácido e o LAP e o DPBS e adicione pigmento comestível magenta à solução para melhorar a precisão da impressão.Filtre a solução através de um filtro de 0,22 micrômetro para esterilidade e aqueça-a em um banho de água de 37 graus Celsius por 15 minutos. Construa os modelos 3D com software CAD e importe os documentos do modelo para o software superior da bioimpressora DLP aplicada. Adicione dez mililitros da bioindadeira preparada ao cocho da bioimpressora.Defina os parâmetros de impressão de acordo com as instruções do manuscrito e comece a imprimir. Quando estiver completo, remova a estrutura impressa da bioimpressora e mergulhe-a em DPBS em uma placa de Petri. Desapegar e pelotas células MDA-MB 231 como descrito anteriormente.Resuspensá-los com dois mililitros de DMEM e adicionar a suspensão à estrutura impressa. Cultuem as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por três dias e depois preparem as estruturas para observação com um microscópio de fluorescência confocal, como descrito anteriormente. Prepare um peso de 10% para o volume GelMA e 0,5% de peso para a solução LAP de volume e depois filtre-o através de um filtro de 0,22 micrômetros.Esterilize o pó de gelatina sob luz UV por 30 minutos e adicione-o à solução GelMA LAP a uma razão de peso para volume de 5%. Aqueça a mistura em um banho de água de 37 graus Celsius por 15 minutos. Encha os moldes com a bioindálida preparada e coloque-os em uma geladeira de quatro graus Celsius por 30 minutos.Use uma lâmina para remover as folhas de hidrogel parcialmente cruzadas dos moldes. Combine folhas de hidrogel moldado 2D e uni-las ao GelMA irradiando a 405 nanômetros por um minuto. Despegar e pelotas HUVECs misturam as células com dois mililitros de DMEM e injetam a suspensão no microcanal com o bocal e a seringa.Durante as próximas três horas, vire o chip de cabeça para baixo a cada 15 minutos para conseguir assentos uniformes e completos. Cultue os chips em uma placa de Petri por três dias em DMEM a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, em seguida, prepare-os para observação morfológica. Quando as gotículas de GelMA caíram no óleo de silicone receptor, elas mantiveram uma forma esferoide padrão sem caudas.As células encapsuladas que experimentavam a força de campo elétrico de alta tensão mantiveram sua capacidade de disseminação que verificou a biocompatibilidade do método de fabricação eletro assistida. Uma impressora biográfica DLP foi escolhida para fabricar estruturas DeMa com formas mais complexas, como orelha de nariz e câmara multi. HuveCs semeados ligados aos materiais GelMA e espalhados na superfície das estruturas de GelMA transversais demonstrando que esta aplicação tem potencial para a engenharia de tecidos.Uma estratégia de ligação cruzada duas vezes foi usada para fabricar chips microfluídicos baseados em GelMA. Chips com vários microcanais foram construídos projetando diferentes moldes sob demanda e huvecs foram semeados nos canais e anexados à parede do canal formando a forma de vaso macroscópico. A fonte de alta tensão é aplicada ao fabricar microesferas.Os pesquisadores devem examinar o circuito antes e não tocar em milibas expostos protegendo os operadores ou fazer as células de um dano por curto-circuito. A base de água ultrassônica pode ser outra opção para acelerar a velocidade merecida. Definitivamente, essa contribuição resumiu os métodos de bioimpressão 3D do GelMA em nosso laboratório.Os pesquisadores poderiam se referir ao vídeo e melhorar ou expandir estratégias de impressão para atender a outras exigências biomédicas.

protocols-3d-bioprinting-gelatin-methacryloyl-hydrogel-based

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

O vídeo demonstra o processo de criação de uma construção bioimpressa em 3D usando astrócitos suspensos em uma solução de bioink. A construção bioimpressa, após a reticulação, facilita a adesão dos astrócitos e sua disseminação, formando tecido semelhante a neurais.

Um método para bioimpressão 3D de astrócitos corticais murinos

Nós descrevemos um conjunto de protocolos que, juntos, oferecem uma bioink hidrogel que imita o tecido com o qual construções de tecido 3-D funcionais e viáveis ​​podem ser bioprinted para uso em aplicações in vitro de rastreio.

Bioprinting celularizado Constrói Usando um específico do tecido Hidrogel Bioink

Desenvolvemos um modelo de câncer de mama heterogênea consistindo de células de tumor e fibroblasto imortalizadas incorporadas em um bioink de alginato/gelatina de bioprintable. O modelo recapitula o microambiente do tumor na vivo e facilita a formação de esferoides tumor multicelulares, produzindo insights sobre os mecanismos de condução tumorigênese.

Hidrogel Bioprintable alginato/gelatina 3D em Vitro sistemas modelo induzem a formação de esferoide de célula

Aqui, desenvolvemos uma nova estratégia modificada multicamadas para bioinks semelhantes a líquidos (gelatina methacryloyl com baixa viscosidade) para evitar a sedimentação de células encapsuladas.

Usando bioink de hidrogel multicamadas em bioimpressão tridimensional para distribuição celular homogênea

Aqui relatamos um método de bioimpressão 3D de astrócitos cortical de murina para biofabricagem de tecidos neurais para estudar a funcionalidade dos astrócitos no sistema nervoso central e os mecanismos que envolvem células gliais em doenças neurológicas e tratamentos.

Bioimpressão 3D de astrócitos cortical de murina para engenharia de tecido neural

Este protocolo descreve uma técnica de impressão 3D para fabricar estruturas semelhantes a ossos, depositando uma tinta de fosfato de cálcio em um suporte granular à base de gelatina. Os análogos ósseos impressos são depositados em forma livre, com flexibilidade para a colheita direta da impressão ou reticulação dentro de uma matriz celular viva para construções multifásicas.

Bioimpressão Cerâmica Omnidirecional em Suspensões Carregadas de Células para a Geração de Análogos Ósseos

O processamento de cisalhamento durante a formação de hidrogel resulta na produção de suspensões de microgel que se reestruturam rapidamente, mas rapidamente após a remoção das forças de cisalhamento. Tais materiais têm sido utilizados como matriz de suporte para bioimpressão de estruturas complexas carregadas de células. Aqui, são descritos os métodos utilizados para a fabricação do leito de suporte e das biotintas compatíveis.

Géis fluidos de agarose formados por processamento de cisalhamento durante gelificação para bioimpressão 3D em suspensão

Este artigo descreve protocolos para a fabricação de microgel de metacriloíla de gelatina de alto rendimento usando dispositivos microfluídicos, conversão de microgéis em pó ressuspendível (micro-aerogéis), montagem química de microgéis para formar arcabouços de hidrogel granular e desenvolvimento de biotintas de hidrogel granulares com microporosidade preservada para bioimpressão 3D.

Suportes de hidrogel granular de metacriloíla de gelatina: fabricação de microgel de alto rendimento, liofilização, montagem química e bioimpressão 3D

Este artigo descreve como bioimprimir hidrogéis fototáveis em 3D para estudar o enrijecimento da matriz extracelular e a ativação de fibroblastos.

Bioimpressão 3D de hidrogéis fototáveis para estudo da ativação de fibroblastos

Este estudo apresenta um novo banho de suspensão de submicrogel de κ-carragenina, exibindo notáveis propriedades reversíveis de transição de interferência-desobstrução. Esses atributos contribuem para a construção de tecidos e órgãos biomiméticos em bioimpressão 3D embarcada. A impressão bem-sucedida de tecidos semelhantes ao coração/esôfago com alta resolução e crescimento celular demonstra aplicações de bioimpressão e engenharia de tecidos de alta qualidade.

Bioimpressão Incorporada de Estruturas Semelhantes a Tecidos Usando Meio Submicrogel κ-Carragenana

Aprenda protocolos de bioimpressão 3D usando hidrogéis de GelMA para engenharia de tecidos e aplicações biomédicas. Este método demonstra estratégias eficazes para melhorar a impressibilidade e criar estruturas complexas.

Protocolos de bioimpressão 3D de bioinks baseados em hidrogel de gelatina

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