Protocolos de bioimpressão 3D de bioinks baseados em hidrogel de gelatina
21 de dezembro de 2019
Apresentado aqui é um método para a bioimpressão 3D de gelatina methacriloyl.
A biônica à base de hidrogel GelMA tornou-se muito popular na bioimpressão 3D. No entanto, a baixa viscosidade restringe sua impressão. Aqui estamos compartilhando estratégias para imprimir o GelMA em nosso laboratório com outros pesquisadores.
Neste vídeo utilizamos plenamente as propriedades especiais deste bioma material e propomos diversos métodos de impressão para diferentes estruturas 3D que poderiam contribuir para outras aplicações biomédicas. Para tomar danos nos órgãos, por exemplo, implicações são potenciais para serem usadas na terapia correspondente, injetando incorporação ou rastreamento das estruturas de GelMA impressas. Não seria fácil dissolver totalmente o GelMA congelado em pouco tempo.
Para acelerar o processo de dissolução, um misturador de vórtice poderia ser usado. Todo bioma material usará propriedades especiais íntimas do GelMA. Eu sugeri que um novo chemer deve dar um passeio adequado do que está condicionando crítico ao imprimir.
Os detalhes da operação determinam o sucesso dos procedimentos de impressão. É por isso que escolhemos uma demonstração visual para compartilhar com outros pesquisadores. Para fabricar microesferas comece conectando os dois eletrodos de anel de metal com polos terra e positivos.
Coloque a placa metálica conectada com a alta tensão abaixo do eletrodo do anel e uma placa de Petri com óleo de silicone na placa de metal como receptor de gotícula. Prepare a bioindálula dissolvendo GelMA e LAP e DPBS filtrando-a através de filtro de 0,22 micrômetros para esterilidade e, em seguida, aqueça-a em um banho de água Celsius de 37 graus por 15 minutos. Despeitar células MDA-MB-231 com três mililitros de 0,25% de trippsina e 0,02% de solução EDTA por três minutos a 37 graus Celsius.
Transfira as células para um tubo de 15 mililitros e centrífugas a 100 vezes G durante cinco minutos. Remova o supernasce e misture as células com um mililitro de biointeca preparada, encanar lentamente para cima e para baixo, certificando-se de evitar bolhas de ar. Aspire um mililitro da bioindadeira e mistura celular em uma seringa estéril de três mililitros.
Alimente a bioindálida pela força do ar comprimido e coloque a seringa na luminária. Ligue a potência de alta tensão e coloque a tensão de zero a quatro quilovolts. Ligar simultaneamente a luz de comprimento de onda de 405 nanômetros para cruzar as gotículas de GelMA em cinco mililitros de óleo de silício.
Decante a placa de Petri para se livrar da maior parte do óleo de silício e use uma colher para transferir o óleo restante e microesferas para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Adicione cinco mililitros de DPBS e agite a mistura centrífuga do tubo a 100 vezes G e remova o supernasce. Transfira as microesferas para uma placa de Petri com DMEM e cultue-as a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por três dias.
Após três dias descarte o meio e lave as microesferas com DPBS. Fixá-los com dois mililitros de 4% pfa por 30 minutos em temperatura ambiente, em seguida, descartar o PFA e repetir a lavagem. Permeabilize as células com dois mililitros de 0,5% surfactante não iônico por cinco minutos à temperatura ambiente descarte o surfactante e lave as microesferas com DPBS.
Em seguida, colorir as células com TRITC-phalloidin por 30 minutos e depois DAPI por 10 minutos no escuro descartando os corantes e lavando as esferas com DPBS após cada coloração. Imagem das microesferas com um microscópio de fluorescência confocal. Dissolver pó de alginato de sódio esterilizado em água deionizada a uma razão de peso para volume de dois por cento.
Prepare a solução de bio tinta estéril como descrito anteriormente, aqueça o alginato de bio tinta e sódio em um banho de água de 37 graus Celsius por 15 minutos. O trypsinize e a centrífuga bMSCs de acordo com o procedimento descrito anteriormente para células MDA-MB 231, em seguida, remova o fluido sobrenanante e resuspenque a pelota celular com 2 mililitros da biointegação do GelMA. Aspire dois mililitros da mistura de células de bioindina em uma seringa de 10 mililitros e dois mililitros da mistura de alginato de sódio em outra seringa.
Alimente as soluções com duas bombas de seringa bioindólia a 50 micrômetros por minuto e alginato de sódio a 350 micrômetros por minuto. Ligue a luz de comprimento de onda de 405 nanômetros para irradiar o tubo transparente e cruzar as fibras GelMA. Use uma placa de Petri para receber as fibras e recolhê-las com uma colher.
Transfira as fibras para um prato com DMEM/F12 e cultue-as por três dias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após a cultura das células seguem as instruções descritas anteriormente para observar as fibras sob um microscópio de fluorescência confocal. Dissolva o GelMA ácido e o LAP e o DPBS e adicione pigmento comestível magenta à solução para melhorar a precisão da impressão.
Filtre a solução através de um filtro de 0,22 micrômetro para esterilidade e aqueça-a em um banho de água de 37 graus Celsius por 15 minutos. Construa os modelos 3D com software CAD e importe os documentos do modelo para o software superior da bioimpressora DLP aplicada. Adicione dez mililitros da bioindadeira preparada ao cocho da bioimpressora.
Defina os parâmetros de impressão de acordo com as instruções do manuscrito e comece a imprimir. Quando estiver completo, remova a estrutura impressa da bioimpressora e mergulhe-a em DPBS em uma placa de Petri. Desapegar e pelotas células MDA-MB 231 como descrito anteriormente.
Resuspensá-los com dois mililitros de DMEM e adicionar a suspensão à estrutura impressa. Cultuem as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por três dias e depois preparem as estruturas para observação com um microscópio de fluorescência confocal, como descrito anteriormente. Prepare um peso de 10% para o volume GelMA e 0,5% de peso para a solução LAP de volume e depois filtre-o através de um filtro de 0,22 micrômetros.
Esterilize o pó de gelatina sob luz UV por 30 minutos e adicione-o à solução GelMA LAP a uma razão de peso para volume de 5%. Aqueça a mistura em um banho de água de 37 graus Celsius por 15 minutos. Encha os moldes com a bioindálida preparada e coloque-os em uma geladeira de quatro graus Celsius por 30 minutos.
Use uma lâmina para remover as folhas de hidrogel parcialmente cruzadas dos moldes. Combine folhas de hidrogel moldado 2D e uni-las ao GelMA irradiando a 405 nanômetros por um minuto. Despegar e pelotas HUVECs misturam as células com dois mililitros de DMEM e injetam a suspensão no microcanal com o bocal e a seringa.
Durante as próximas três horas, vire o chip de cabeça para baixo a cada 15 minutos para conseguir assentos uniformes e completos. Cultue os chips em uma placa de Petri por três dias em DMEM a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, em seguida, prepare-os para observação morfológica. Quando as gotículas de GelMA caíram no óleo de silicone receptor, elas mantiveram uma forma esferoide padrão sem caudas.
As células encapsuladas que experimentavam a força de campo elétrico de alta tensão mantiveram sua capacidade de disseminação que verificou a biocompatibilidade do método de fabricação eletro assistida. Uma impressora biográfica DLP foi escolhida para fabricar estruturas DeMa com formas mais complexas, como orelha de nariz e câmara multi. HuveCs semeados ligados aos materiais GelMA e espalhados na superfície das estruturas de GelMA transversais demonstrando que esta aplicação tem potencial para a engenharia de tecidos.
Uma estratégia de ligação cruzada duas vezes foi usada para fabricar chips microfluídicos baseados em GelMA. Chips com vários microcanais foram construídos projetando diferentes moldes sob demanda e huvecs foram semeados nos canais e anexados à parede do canal formando a forma de vaso macroscópico. A fonte de alta tensão é aplicada ao fabricar microesferas.
Os pesquisadores devem examinar o circuito antes e não tocar em milibas expostos protegendo os operadores ou fazer as células de um dano por curto-circuito. A base de água ultrassônica pode ser outra opção para acelerar a velocidade merecida. Definitivamente, essa contribuição resumiu os métodos de bioimpressão 3D do GelMA em nosso laboratório.
Os pesquisadores poderiam se referir ao vídeo e melhorar ou expandir estratégias de impressão para atender a outras exigências biomédicas.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método para a bioimpressão 3D de gelatina metacrilol (GelMA). Discute estratégias para melhorar a capacidade de impressão da GelMA, o que é crucial para diversas aplicações biomédicas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Bioprintagem 3D
- Biomateriais
- Engenharia Biomédica
Contexto
- Os hidrogéis de GelMA estão ganhando popularidade na bioprintagem 3D.
- A baixa viscosidade da GelMA limita sua capacidade de impressão.
- São necessárias estratégias para melhorar sua aplicação em áreas biomédicas.
- Aplicações potenciais incluem terapia para danos em órgãos.
Objetivo do Estudo
- Compartilhar estratégias eficazes de impressão para GelMA.
- Explorar as propriedades especiais do GelMA para diversas estruturas tridimensionais.
- Contribuir para o desenvolvimento de aplicações biomédicas.
Métodos Utilizados
- Utilização das propriedades únicas do GelMA.
- Desenvolvimento de diversos métodos de impressão.
- Estratégias para incorporar ou rastrear estruturas impressas.
- Abordagem de desafios na dissolução do GelMA liofilizado.
Resultados Principais
- Demonstrou técnicas eficazes de impressão para GelMA.
- Apresentou aplicações potenciais em terapia.
- Identificou desafios na dissolução de GelMA.
- Fornecer insights para pesquisas futuras em bioprintagem 3D.
Conclusões
- Métodos aprimorados para bioprintagem 3D de GelMA podem aumentar as aplicações biomédicas.
- São necessárias mais pesquisas para otimizar a capacidade de impressão da GelMA.
- Potencial para contribuições significativas na terapia de órgãos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A bioprintagem 3D de hidrogéis de GelMA permite a fabricação de estruturas complexas contendo células, para aplicações em engenharia de tecidos e medicina regenerativa. O protocolo aborda desafios de impressão por meio da formação eletroassistida de gotas, extrusão de fibras e padronização baseada em DLP, possibilitando a fabricação reprodutível de microesferas, fibras e chips microfluídicos. Esses métodos aumentam a confiabilidade preditiva de modelos pré-clínicos ao fornecer scaffolds biocompatíveis e ajustáveis que imitam sinais da matriz extracelular.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação das interações célula-matriz por meio de motivos sensíveis a RGD e MMP na GelMA, apoiando a desmistificação mecanicista de alvos terapêuticos.
- Valor Operacional: Oferece formatos padronizados de microesferas e fibras para triagem em alta taxa de comportamento celular sob estímulos biofísicos controlados.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera microambientes tridimensionais quantificáveis para avaliar a expansão celular, viabilidade e morfogênese em resposta a perturbações farmacológicas ou genéticas.
- Valor Operacional: Permite a padronização de ensaios por meio de formulações de GelMA fotoconectáveis por UV com rigidez e taxas de degradação ajustáveis.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Facilita a fabricação de chips microfluídicos perfusáveis revestidos com HUVECs, permitindo modelos de tecidos vascularizados para estudos de transporte e toxicidade de fármacos.
- Valor Operacional: Permite a produção escalonável de arquiteturas 3D complexas (por exemplo, nariz, orelha, múltiplas câmaras) para validação pré-clínica de terapias regenerativas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O fluxo de trabalho integra a preparação de bio-tinta, a encapsulação celular e a reticulação assistida por tensão ou luz para produzir construtos de hidrogel funcionais adequados para avaliação biológica posterior.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre adesão mediada por integrinas e remodelação dependente de proteases em contextos tridimensionais.
- Triagem: Permite a fabricação reprodutível de microesferas e fibras de hidrogel para triagem padronizada de compostos em matrizes tridimensionais fisiologicamente relevantes.
- Análises: Fornece leituras estruturais e fluorescentes (por exemplo, imagem confocal de actina e núcleos) para quantificar respostas celulares em diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas a estudos pré-clínicos por meio da geração de chips microfluídicos vascularizados que modelam a formação e função de microvasos humanos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma modular adaptável a diversos tipos celulares e geometrias, reduzindo o esforço de re-desenvolvimento em diferentes projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aprimora a validação de alvos ao permitir a avaliação funcional de células em hidrogéis degradáveis e adesivos que recapitulam características-chave do microambiente.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio da padronização da formulação do bio-tinta, filtração estéril e parâmetros controlados de reticulação.
- Valor Estratégico: Reduz os prazos de desvio de riscos biológicos ao fornecer modelos preditivos em estágios iniciais de integração tecidual e vascularização.
- Impacto no Portfólio: Apoia decisões de prosseguimento ou interrupção em programas de medicina regenerativa ao permitir iterações rápidas de designs de scaffolds e interações célula-material.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em química de hidrogéis, preparação estéril de bio-tintas e sistemas de reticulação elétrica ou óptica.
- Necessita de instrumentação incluindo fontes de alta tensão, bombas de seringa, fontes de luz de 405 nm e bioplotadoras DLP.
- Exige padronização entre equipes da viscosidade da bio-tinta, densidade celular e duração da reticulação para reprodutibilidade entre laboratórios.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes tipos celulares (por exemplo, MDA-MB-231, bMSCs, HUVECs) e cinética de gelificação em diferentes concentrações de GelMA.
- Inclui limitações práticas, como a baixa viscosidade do GelMA, que exige métodos auxiliares (por exemplo, impressão eletro-hidrodinâmica, coextrusão com alginato) para fidelidade de forma.
