Name: Uso do Análogo da Pirimidina 5-Iodo-2′-Desoxiuridina (IdU) com Marcadores do Ciclo Celular para Estabelecer Fases do Ciclo Celular em uma Plataforma de Citometria de Massa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprenda a analisar o ciclo celular em nível de célula única usando citometria de massa com IdU. Este método simples correlaciona propriedades do ciclo celular com resultados clínicos em leucemia mieloide aguda.

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Os autores gostariam de agradecer os esforços de Palak Sekhri, Hussam Alkhalaileh, Hsiaochi Chang e Justin Lyeberger por seu apoio experimental. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Bolsas Pelotonia. Quaisquer opiniões, descobertas e conclusões expressas neste material são do(s) autor(es) e não refletem necessariamente as do Programa de Bolsas Pelotonia."

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</ol>

Dr. Behbehani recebe apoio de viagem da Fluidigm. A Fluidigm também adquiriu reagentes e materiais para uso em laboratório.

Os exemplos aqui apresentados demonstram como usar uma plataforma MCM para analisar a distribuição do ciclo celular. Também foi demonstrado que a análise do ciclo celular é sensível a condições experimentais como tempo e temperatura, o que é uma consideração importante que os pesquisadores devem ter ao considerar a MCM para sua análise do ciclo celular14. As amostras deixadas em armazenamento por um curto período de tempo, não superior a uma hora, terão incorporação de IdU comparável ao seu estado...

A citometria de massa permite a detecção de aproximadamente 40 parâmetros, aproveitando a alta resolução e a natureza quantitativa da espectroscopia de massas. Anticorpos marcados com metais são usados em vez de anticorpos conjugados com fluoróforos que permitem um maior número de canais e produzem mínimo spillover 1,2. A MCM apresenta vantagens e desvantagens em relação à análise do ciclo celular em comparação à citometria de fluxo. Uma grande vantagem da MCM é que o grande número de parâmetros permite a medição simultânea do estado do ciclo celular em um grande número de tipos de células T imunofenotipicamente distintos em amostras altamente heterogêneas. A MCM tem sido usada com sucesso para medir o estado do ciclo celular durante a hematopoese normal na medula óssea humana3 e modelos murinos transgênicos de deficiência de telomerase4. A análise do estado do ciclo celular na leucemia mieloide aguda (LMA) mostrou que o ciclo celular correlacionou-se com respostas conhecidas a terapias clínicas, fornecendo uma visão in vivo das características funcionais que podem informar as seleções terapêuticas5. Uma segunda vantagem da análise do ciclo celular por citometria de massa é a capacidade de medir um grande número de outros marcadores funcionais que podem ser correlacionados com o estado do ciclo celular. Trabalhos recentes têm sido capazes de correlacionar a síntese de proteínas e RNA com o estado do ciclo celular através do uso de anticorpos marcados com IdU e metal para BRU e rRNA6. Esse tipo de análise altamente paramétrica medindo o estado do ciclo celular em várias populações em um continuum de diferenciação seria quase impossível com a tecnologia atual de citometria de fluxo. A principal desvantagem da MCM é a falta de colorações de DNA ou RNA comparáveis às usadas em citometria de fluxo fluorescente (por exemplo, DAPI, Hoechst, Pyronin Y, etc.). Corantes fluorescentes podem fornecer medidas relativamente precisas do conteúdo de DNA e RNA, mas essa precisão só é possível devido às mudanças nas propriedades fluorescentes desses corantes que ocorrem na intercalação entre bases nucleotídicas. A análise de MCM é, portanto, incapaz de medir o conteúdo de DNA ou RNA com precisão semelhante. Em vez disso, a análise do ciclo celular por citometria de massa baseia-se em medições de proteínas relacionadas ao estado do ciclo celular, como ciclina B1, proteína de retinoblastoma fosforilado (pRb) e histona H3 fosforilada (pHH3) combinadas com a medição direta do átomo de iodo da incorporação de IdU em células de fase S. Essas duas abordagens de medição produzem resultados altamente semelhantes durante a proliferação celular normal, mas podem ser potencialmente discordantes quando a progressão do ciclo celular é interrompida.
A medição do número de células em cada fase do ciclo celular é importante para entender o desenvolvimento normal do ciclo celular, bem como a interrupção do ciclo celular, que é comumente observada em cânceres e doenças imunológicas. MCM fornece medição confiável de fatores extracelulares e intracelulares usando anticorpos marcados com metal; no entanto, a medição da fase S foi limitada, pois o intercalador de DNA baseado em irídio foi incapaz de diferenciar entre DNA 2N e 4N. Para definir as fases do ciclo celular, Behbehani desenvolveu um método que utiliza IdU com massa de 127, que se enquadra na faixa do citômetro de massa e permite a medição direta de células na fase S3. Essa medição direta contorna a necessidade de anticorpos secundários ou o uso de agentes desnaturantes do DNA, como ácido ou DNase. Em conjunto com marcadores de ciclagem intracelular, permite alta resolução da distribuição do ciclo celular em modelos experimentais.
Este protocolo adapta medidas do ciclo celular de protocolos comuns de citometria de fluxo para MCM. Nossos métodos fornecem uma maneira conveniente e simples de incluir parâmetros do ciclo celular. A incorporação de amostras in vitro por IdU requer apenas 10 a 15 minutos de incubação a 37 °C, o que é mais curto do que a maioria dos protocolos de coloração de BrdU, que recomendam tempos de incubação de várias horas 3,7. As amostras incorporadas de IdU e BrdU podem ser fixadas usando um estabilizador proteômico e, em seguida, armazenadas por algum tempo em um freezer de -80 °C. Isso permite que um grande número de amostras coradas com IdU seja arquivado para análise em lote sem redução na qualidade da amostra.

<table><tbody><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td>Componente da</td></tr><tr><td>centrífuga</td> CSM <td>Thermo Scientific</td><td>75-217-420</td><td>Centrifugação de amostra</td></tr><tr><td>clivada-PARP (D214)</td><td>BD Biosciences</td><td>F21-852</td><td>Identificação de células apoptóticas</td></tr><tr><td>Ciclina B1</td><td>BD Biosciences</td><td>GNS-1</td><td>G2 Resolução</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>Cryopreservative</td></tr><tr><td>EQ Quatro Elementos Calibração Beads</td><td>Fluidigm</td><td>201078</td><td>Padrão metálico interno para desempenho CyTOF</td></tr><tr><td>FACS Tubo com filtro de malha</td><td>Corning</td><td>08-771-23</td><td>Filtro de células para remover aglomerados/detritos antes da execução do CyTOF</td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal (FBS)</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td>Suplemento de crescimento de cultura celular</td></tr><tr><td>Helios</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>CyTOF Sistema/Plataforma</td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td>Aditivo de coloração para evitar coloração inespecífica</td></tr><tr><td>IdU (5-Iodo-2&prime;-desoxiuridina)</td><td>Sigma</td><td>I7125</td><td>Incorpora na fase S</td></tr><tr><td>Ki-67</td><td>eBiosciences</td><td>SolA15</td><td>Confirmação do G0/G1</td></tr><tr><td>MaxPar Multi Label Kit</td><td>Fluidigm</td><td>201300</td><td>Kit de rotulagem de metais, anexa metais para anticorpos</td></tr><tr><td>Microplate Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880023</td><td>Mistura de amostras durante a coloração</td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td><td>Serviços de Microscopia Eletrônica</td><td>15710</td><td>Fixador</td></tr><tr><td>pentametilciclopentadienil-Ir(III)-dipiridofenazina</td><td>Fluidigm</td><td>201192</td><td>Identificação celular durante a aquisição de CyTOF</td></tr><tr><td>p-H2AX (S139)</td><td>Millipore</td><td>JBW301</td><td>Detecção de danos ao DNA</td></tr><tr><td>p-HH3 (S28)</td><td>Biolegend</td><td>HTA28</td><td>Solução</td></tr> salina <tr><td>tamponada com fosfato</td> de resolução de fase M (PBS)<td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Solução de lavagem para cultura de células e componente da solução fixadora</td></tr><tr><td>p-Rb (S807/811)</td><td>BD Biosciences</td><td>J112906</td><td>G0/G1</td></tr><tr><td>Estabilizador proteômico</td> de resolução <td>SmartTube Inc</td><td>PROT1</td><td>Fixador de amostra</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21870-076</td><td>Meio de crescimento de cultura celular</td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>Acros Organics</td><td>AC447810250</td><td>Componente de CSM / tampão de anticorpo, biocida</td></tr></tbody></table>

uso do análogo da pirimidina 5-iodo-2′-desoxiuridina (idu) com marcadores do ciclo celular para estabelecer fases do ciclo celular em uma plataforma de citometria de massa

Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2&prime;-Deoxyuridine (IdU) with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform

A regulação da fase do ciclo celular é um aspecto importante da proliferação celular e da homeostase. A interrupção dos mecanismos regulatórios que regem o ciclo celular é uma característica de uma série de doenças, incluindo o câncer. O estudo do ciclo celular requer a capacidade de definir o número de células em cada porção da progressão do ciclo celular, bem como delinear claramente entre cada fase do ciclo celular. O advento da citometria de massa (MCM) fornece um enorme potencial para análise de célula única de alto rendimento através de medições diretas de isótopos elementares, e o desenvolvimento de um método para medir o estado do ciclo celular por MCM amplia ainda mais a utilidade da MCM. Descrevemos aqui um método que mede diretamente a 5-iodo-2′-desoxiuridina (IdU), semelhante à 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU), em um sistema MCM. O uso desse MCM baseado em IdU oferece várias vantagens. Primeiro, o IdU é rapidamente incorporado ao DNA durante sua síntese, permitindo a medição confiável de células na fase S com incubações tão curtas quanto 10-15 minutos. Em segundo lugar, o IdU é medido sem a necessidade de anticorpos secundários ou a necessidade de degradação do DNA. Terceiro, a coloração de IdU pode ser facilmente combinada com a medição de ciclina B1, proteína fosforilada de retinoblastoma (pRb) e histona fosforilada H3 (pHH3), que coletivamente fornece delineamento claro das cinco fases do ciclo celular. A combinação desses marcadores de ciclo celular com o alto número de parâmetros possíveis com a MCM permite a combinação com inúmeras outras métricas.

Utilizando células HL-60 e um aspirado de medula óssea humana é possível mostrar como as condições experimentais podem afetar a distribuição e análise do ciclo celular. Primeiro, a estratégia de gating deve ser estabelecida para demonstrar como as fases do ciclo celular são derivadas. Na Figura 1 mostramos o estabelecimento da porta singlete, que é importante na separação de restos celulares e duplos, estabelecendo uma população de células únicas. Para linhagens celulares, a porta singlete é...

Este protocolo adapta medidas do ciclo celular para uso em uma plataforma de citometria de massa. Com as capacidades multiparamétricas da citometria de massa, a medição direta da incorporação de iodo permite a identificação de células em fase S, enquanto marcadores de ciclagem intracelular permitem a caracterização de cada estado do ciclo celular em uma variedade de condições experimentais.

Uso do Análogo da Pirimidina 5-Iodo-2′-Desoxiuridina (IdU) com Marcadores do Ciclo Celular para Estabelecer Fases do Ciclo Celular em uma Plataforma de Citometria de Massa

The regulation of cell cycle phase is an important aspect of cellular proliferation and homeostasis. Disruption of the regulatory mechanisms governing the ...

Este protocolo nos permite examinar o ciclo celular em nível de célula única usando o citômetro de massa, e isso permite que várias pesquisas e estudos clínicos novos sejam realizados. A principal vantagem desta técnica é a sua simplicidade. IdU é adicionado diretamente às células e não há necessidade de tratamento adicional ou anticorpos.Usamos essa técnica para investigar o estado do ciclo celular em pacientes com leucemia mieloide aguda dentro dos compartimentos das células-tronco e progenitoras. E isso demonstrou que as propriedades do ciclo celular desses tipos celulares específicos podem se correlacionar com o desfecho clínico de pacientes com essas doenças. Esta técnica pode ser útil para compreender as propriedades de crescimento de células cancerosas raras e compreender a proliferação de subgrupos de células imunes.Antes e depois de adicionar IdU às amostras celulares, manter as células nas condições de crescimento de interesse. Neste caso, uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius a 5% de CO2 para marcar as células com IdU, dilui a solução estoque de IdU concentrada de um a 50 no meio de crescimento das células. Em seguida, transfira as amostras para uma coifa de biossegurança e adicione 10 microlitros de IdU milimolar a cada mililitro de células.Retornar as células à incubadora por 10 a 15 minutos antes de transferir as amostras para tubos cônicos individuais. Coletar as células por centrifugação em tubos cônicos de 15 mililitros e ressuspender os pellets em 200 microlitros de PBS por tubo. Se necessário, rotule as células com uma coloração viva/morta apropriada para marcar as células mortas.Após coloração viva/morta, as células foram extintas com meio lavado com MSC antes de fixar as células com 25 microlitros de paraformaldeído a 16%. Após 10 minutos de incubação à temperatura ambiente, coletar as células por centrifugação. Adicione de cinco a 15 mililitros de CSM e centrífuga novamente.Ressuspender os pellets em 500 microlitros de meio corante celular suplementado com 10% de dimetilsulfóxido. Em seguida, transfira as células para tubos menores para armazená-las em 80 graus Celsius negativos. Para normalizar a análise do ciclo celular, importe os arquivos para um programa de software de análise de citometria de fluxo apropriado e crie um gráfico biaxial do comprimento do evento versus 191 irídio.As células formarão uma população distinta de irídio brilhante alto. Altere a escala de comprimento do evento para que as células pareçam mais proeminentes. Em seguida, crie um portão singlet para excluir 50 a 60% dos duplos e detritos e defina os parâmetros gaussianos residuais e deslocados para remover quaisquer duplos e detritos restantes.Para definir a porta da fase S, crie um gráfico biaxial de IdU versus um marcador de proliferação. As células IdU positivas em fase S formarão uma população distinta. Para G0/G1 e G2/M, estabeleça os portões em um gráfico IdU versus Cyclin B1.A fase G0/G1 será Ciclina B1 baixa, IdU negativa, e a fase G2/M será Ciclina B1 alta, IdU negativa. Para atender a tipos de células específicos, plote apenas as células de fase S no gráfico de ciclina B1 versus IdU para ajudar a estabelecer a separação entre as células de fase G0/G1 e as células de fase G2/M. Desenhe um portão em torno da alta população da ciclina B1.Em alguns casos, isso pode ser difícil de discernir, mas o nível de ciclina B1 de aproximadamente 5% da população da fase S é tipicamente o ponto de interrupção entre as portas de fase G0/G1 e G2/M. As células residentes dentro do portão anterior serão a população da fase G2/M, enquanto o restante será a população da fase G0/G1. Para estabelecer a população da fase G0, crie uma proteína de retinoblastoma fosforilada versus gráfico de IdU.A fase G0 será representada por uma população de baixa proteína de retinoblastoma fosforilada, IdU negativa. Como a população cicladora ativa demonstrará uma alta incorporação de proteína de retinoblastoma fosforilada e IdU, a porta de fase G0 pode ser desenhada neste limite, pois tipicamente se expressa em duas populações distintas. Se o portão G0 for difícil de definir, faça da população da fase S a população ativa e desenhe um portão incorporando os 90 a 100% superiores da proteína de retinoblastoma fosforilado alta população.A baixa população da proteína fosforilada do retinoblastoma fora do portão é tipicamente a população G0, enquanto as células G0/G1 com níveis de pRb que caem nesse portão são células G1. Para gating de fase M, crie um IdU versus histona fosforilada H3 por gráfico axial. A fase M será observada como a fração muito pequena de células dentro da população de histona H3 fosforilada.As células da população G2/M com menores níveis de pHH3 são as células G2. Se a incorporação de IdU falhou ou não foi possível, defina a ciclagem e não ciclagem das frações celulares usando Ki67 e proteína retinoblastoma fosforilada. A população duplamente positiva representará a população ciclável ativa correlacionando-se com as fases G1, S, G2 e M.A dupla população baixa representará a população não ciclável correlacionando-se com a fase G0. Uma vez que todos os portões tenham sido estabelecidos, exporte os valores numéricos dos portões. As porcentagens em cada ciclo podem ser obtidas subtraindo-se as populações individuais das populações combinadas para gerar valores numéricos para cada fase do ciclo celular individual para posterior análise gráfica e estatística.O estabelecimento da porta singlete é importante para separar os debris celulares e duplos para permitir o isolamento da população unicelular. A análise do ciclo celular das células individuais pode então ser realizada. A marcação de IdU e, portanto, a análise do ciclo celular a jusante podem ser significativamente afetadas pelo tempo e temperatura.Por exemplo, células que permanecem muito tempo em vasos fechados ou em transporte entre locais terão frações de fase S reduzidas e isso não será preciso para a análise do ciclo celular. Amostras celulares mantidas por curtos períodos de uma hora ou menos ainda demonstram uma distribuição normal do ciclo celular, indicando que um transporte rápido pode não impactar negativamente a análise. As células criopreservadas podem requerer um longo período de equilíbrio antes que as células retornem à ciclagem celular ativa, o que ainda pode não refletir o estado do ciclo celular pré-criopreservação.Diferentes tipos celulares também podem ser afetados diferencialmente pelas condições de manutenção. Por exemplo, nesta amostra de medula óssea humana, as células T demonstraram uma redução no número de células em comparação com os monoblastos da mesma amostra. Outro benefício da citometria de massa é a capacidade de discriminar células em parada do ciclo celular ou que têm uma distribuição anormal do ciclo celular.Uma grande vantagem desta técnica é que é facilmente compatível com outras medidas de citometria de massa, como fenotipagem de superfície, estrutura da cromatina, estimulado de citocinas intracelulares, que podem ser correlacionadas com o estado do ciclo celular. Usamos essa técnica para estudar a exaustão das células imunes, a senescência e mostrar que a resposta à quimioterapia em pacientes com leucemia aguda pode se correlacionar com as propriedades do ciclo celular das células leucêmicas.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Temos uma estratégia de derivados para detectar incorporação seqüencial de análogos da timidina (CldU e UDI) em tecidos de camundongos adultos para quantificar duas rodadas sucessivas de divisão celular. Esta estratégia é útil para detectar renovação celular de longa duração tecidos, transformação oncogênicos, ou de trânsito ampliando-células.

Detecção de imunofluorescência de dois análogos da timidina (CldU e UDI), em tecido primário

Determinar a posição do ciclo celular de uma população de células, ou a compreensão de como os sinais de afetar a proliferação, pode ser facilmente medido por citometria de fluxo usando esse protocolo. Relatamos uma abordagem simples experimental da coloração células e quantificar a sua posição no ciclo celular.

Análise da posição do ciclo celular em células de mamíferos

Controlando mudanças subtis na progressão e cinética de fases do ciclo celular pode ser conseguida pelo uso de uma combinação de marcação metabólica de ácidos nucleicos com BrdU e coloração do ADN genómico total de via iodeto de propídio. Este método evita a necessidade de sincronização química de células de bicicleta, impedindo assim que a introdução de não-específica danos no ADN, que por sua vez afecta a progressão do ciclo celular.

Medindo a progressão do ciclo celular Cinética com marcação metabólica e Citometria de Fluxo

Este vídeo descreve o protocolo para coloração de imunofluorescência BrdU. A técnica permite a identificação de células em diferentes fases do ciclo celular. A adição de corantes de DNA e marcação de anticorpos permite a análise detalhada do destino das células da fase S em momentos posteriores.

Coloração por imunofluorescência BrdU: uma técnica para identificar células em diferentes fases do ciclo celular

O vídeo demonstra uma abordagem baseada em imunofluorescência para quantificar o estresse de replicação em células cancerígenas. As células tratadas com hidroxiureia produzem DNA de fita simples, detectado por imunofluorescência. A contagem de focos de fluorescência verde indica o nível de estresse de replicação nas células cancerígenas.

Um método baseado em imunofluorescência para quantificar o estresse de replicação em células cancerígenas

Este protocolo descreve o uso de bromodesoxiuridina (BrdU) para permitir a absorção de seguimento temporais de células que estavam na fase S de um determinado ponto no tempo. A adição de corantes de ADN e rotulagem anticorpo facilita a análise detalhada do destino das células em fase S em momentos posteriores.

Acompanhamento Temporal de progressão do ciclo celular utilizando citometria de fluxo, sem a necessidade de sincronização

Aqui, descrevemos como estudar a localização mitocondrial de uma quinase (ciclo celular) e como determinar sua localização submitocondrial, bem como potenciais substratos/alvos mitocondriais. A expressão forçada de proteínas nas mitocôndrias fornece uma ferramenta útil para estudar as consequências funcionais da localização mitocondrial de uma proteína de interesse.

Abordagens experimentais para estudar mitocondrial Localização e função de um ciclo celular Nuclear Kinase, Cdk1

No presente protocolo, demonstramos como visualizar a ressecção final de dupla vertente de DNA durante a fase S/G2 do ciclo celular usando um método baseado em imunofluorescência.

Avaliação da ressecção final de duplo fio de DNA global usando rotulagem brdu-DNA juntamente com a discriminação do ciclo celular

A análise do ciclo celular com 5-ethynyl-2'-desoxyuridina (EdU) e rotulagem phospho-histone H3 (pH3) é um procedimento de várias etapas que pode exigir uma otimização extensiva. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado que descreve todas as etapas para este procedimento, incluindo análise de imagens e quantificação para distinguir células em diferentes fases do ciclo celular.

5-Ethynyl-2'-Desoxyuridine/Phospho-Histone H3 Protocolo de rotulagem dupla para análise de progressão do ciclo celular em células-tronco neurais Drosophila

Descrevemos dois protocolos complementares para determinar com precisão a duração da fase S em S. cerevisiae usando EdU, um análogo da timidina, que é incorporado in vivo e detectado usando a química Click por microscopia e citometria de fluxo. Ele permite a fácil caracterização da duração da replicação do DNA e defeitos de replicação negligenciados em mutantes.

Determinação da Duração da Fase S Usando a Incorporação de 5-Etil-2'-desoxiuridina em Saccharomyces cerevisiae

Aprenda a analisar o ciclo celular em nível de célula única usando citometria de massa com IdU. Este método simples correlaciona propriedades do ciclo celular com resultados clínicos em leucemia mieloide aguda.

Uso do Análogo da Pirimidina 5-Iodo-2′-Desoxiuridina (IdU) com Marcadores do Ciclo Celular para Estabelecer Fases do Ciclo Celular em uma Plataforma de Citometria de Massa (Vídeo) | JoVE Journal

Uso do Análogo da Pirimidina 5-Iodo-2′-Desoxiuridina (IdU) com Marcadores do Ciclo Celular para Estabelecer Fases do Ciclo Celular em uma Plataforma de Citometria de Massa

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