Name: Apoptose indução e detecção em uma cultura primária de células intestinais de pepino do mar (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Aprenda a induzir e detectar apoptose em células intestinais primárias de pepino do mar Apostichopus japonicus. Este protocolo simplificado permite cultivo de longo prazo para pesquisas em biologia marinha.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores gostariam de agradecer ao Prof. Naiming Zhou da Universidade de Zhejiang por seu conselho técnico e por disponibilizar o equipamento de seu laboratório para uso. Este trabalho foi apoiado financeiramente pela National Natural Science Foundation of China (números de subvenção 41876154, 41606150 e 41406137) e os Fundos fundamentais de pesquisa para universidades e institutos de pesquisa provinciais de Zhejiang [número de subvenção 2019JZ00007 ].

1. Preparação média da cultura celular
<ol><li>
Preparação de fluidocomicos
	<ol>
<li>
Coleta de fluidos coelomicos: Em condições estéreis, dissecar um pepino do mar saudável (peso molhado de 85-105 g), coletar líquido coelomic, e armazená-lo em um frasco de vidro estéril.</li>
		<li>
Remoção de células coelomicas: Centrífuga o fluido coelomicem-se em tubos de centrífuga de 50 mL a 1.700 x g por 5 min e transfira o supernatant para um novo frasco de vidro estéril; Em seguida, recolher o líquido coelomic livre de células do pepino do mar.</li>
		<li>
Complemente a inativação de componentes: Incubar o frasco de vidro estéril, contendo o líquido coelomic o pepino do mar, em um banho de água de 40-50 °C por 20-40 min para obter fluido coelomic inativado por componentes complementares.</li>
		<li>
Remoção de micróbios: Remover bactérias e clamídia por filtragem através de filtros de membrana de 0,22 μm. Em seguida, retire o micoplasma e outras partículas finas por filtragem usando filtros de membrana de 0,1 μm para obter solução de pré-tratamento de fluido coelomico.</li>
		<li>
Ajuste da salinidade: Ajuste a salinidade da solução de pré-tratamento coelomico fluido para 30(medida por salinometer) adicionando 20% de alta concentração pré-esterilizada e filtrada solução NaCl (diluída por fluido coelomico pré-tratado) ou DDW (água destilada dupla). Transfira o líquido coelomic do pepino do mar em um frasco estéril, sela o frasco, e armazene o líquido em 4 °C para umas experiências mais adicionais.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Otimização média de cultura celular L-15 de Leibovitz
	<ol>
<li>Pesar 5,05 g de NaCl, 0,135 g de KCl, 0,15 g de CaCl2, 0,25 g de Na2SO4, 0,975 g de MgCl2, 0,25 g de glicose, e 6,25 mg de taurina e diluí-los em 40 mL de L-15 de Leibovitz médio em um tubo de 50 mL estéril centeri. Agitao o tubo em um shaker por 1 h para garantir que os sais tenham dissolvido completamente.</li>
		<li>Adicione 2,5 mL de L-glutamina (100 mg/mL) e 500 μL da solução VE (1,75 mg/L) no l-15 médio de Leibovitz previamente preparado e filtrar ainda mais o meio através de filtros de membrana de 0,22 μm.</li>
		<li>Ajuste o volume médio total para 500 mL com o l-15 médio fresco de Leibovitz e com 100 mL de fluido coelomico previamente preparado; Em seguida, ajuste o pH para 7,6 usando a solução NaOH. Mantenha o processo de operação em um ambiente estéril. A relação de composição do líquido coelomic pode ser 10%-50%, e 20% é suficiente para a cultura das pilhas intestinais do japonicus de A..</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparação de células intestinais
<ol><li>
Processamento do intestino do pepino do mar
	<ol>
<li>Anestesie pepinos saudáveis do mar em uma caixa de gelo. Dissecar e coletar os intestinos anteriores, em seguida, seção as amostras de tecido verticalmente e remover o conteúdo interno.</li>
		<li>Lave as amostras de tecido em soro lógico tampão de fosfato (PBS) duas vezes e desinfete-as por imersão em uma solução de etanol aquoso (75% em volume) por não mais de 2 s.</li>
		<li>Lave as amostras de tecido na PBS três vezes para remover etanol e transferir cerca de 100 mg de amostra de tecido em um tubo de microcentrífuga estéril de 2,0 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Coleção celular
	<ol>
<li>Adicione 1,5 mL do meio de cultura pré-otimizado ao bloco de tecido intestinal de pepino do mar e pique o bloco com tesoura cirúrgica esterilizada até que a solução esteja turva. NOTA: Para protocolo simplificado opcional, adicione 0,5 mL de meio de cultura pré-otimizada ao bloco de tecido intestinal de pepino do mar e corte o bloco com tesoura cirúrgica esterilizada em 1 mm3. Transferir diretamente as amostras para pratos de cultura seguido sincubação subseqüentes passos.</li>
		<li>Adicione 400 μL de trippsina (0,25%), misture a solução por inversão e incuba-a por 5 min à temperatura ambiente; então, filtre a solução usando um filtro de célula de 100 μm. NOTA: É opcional adicionar tripsina para dispersão celular ao tratar diferentes amostras de tecido. O ácido tetraacecético (EDTA) deve ser contido na solução de tripsina para reduzir a atividade inibidora de Ca2+ e Mg2+ em meio cultural.</li>
		<li>Colete o filtrado para um novo tubo estéril de microcentrífuga de 2,0 mL, centrífuga a 1.700 x g por 3 min, descarte o supernatant e, em seguida, resuspenda a pelota em meio de cultura (complementada com antibióticos) e lavá-la duas vezes. NOTA: Prepare o meio de cultura pré-otimizado fresco complementado com 2% de solução penicilina-estreptomicina (10.000 u/mL penicilina e 10 mg/mL estreptomicina) e 1% gentamicina (4 mg/mL) antes do início do experimento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Cultura celular
<ol><li>
Predefinição da incubadora: Predefinir a incubadora para a cultura celular e executá-lo com antecedência por pelo menos 24 h com temperatura de 18 °C e umidade saturada. NOTA: Feed CO2 na incubadora, dependendo da cultura celular propriedades médias; nenhum CO2 precisa ser fornecido ao usar o meio básico do L-15 de Leibovitz.</li>
	<li>
Cultura celular do primeiro estágio
	<ol>
<li>Para inibir o crescimento de micróbios e promover a proliferação durante o estágio inicial da cultura celular, adicione 10 mL de solução penicilina-estreptomicina (10.000 u/mL penicilina e 10 mg/mL estreptomicina) e 0,5 mL de gentamicina (40 mg/mL) em cada 500 mL de meio de cultura pré-otimizada. Além disso, complemente cada meio de cultura de 500 mL com 0,6 mL de insulina (10 mg/mL), 100 μL de fator de crescimento semelhante à insulina (0,1 μg/μL) e 25 μL de fator de crescimento do fibroblasto (0,1 μg/μL).</li>
		<li>Colete as células em tubos de 1,5 mL, resuspendê-los usando 200 μL de meio indicado, e pipet-los em φ 4 cm pratos.</li>
		<li>Cultura as células em uma incubadora e adicionar 2,0 mL de meio indicado para a célula pratos de cultivo após 6 h. Mudar metade do meio a cada 12 h até chegar à próxima fase. NOTA: Segure a mudança média suavemente, porque as células não estão ligadas aos pratos firmemente. Os pratos revestidos de poli-D-lisina podem ser usados para anexar vagamente as células do prato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cultura celular de segunda fase
	<ol>
<li>Para reduzir os efeitos adversos dos antibióticos para as células cultivadas, reduzir a concentração de antibióticos indicados (penicilina, estreptomicina e gentamicina) na cultura média pela metade. NOTA: O uso de insulina e fatores de crescimento depende das condições de cultura celular e é opcional.</li>
		<li>Substituir o meio de cultura celular; conduzir mudanças médias a cada dois a três dias, dependendo da densidade celular. NOTA: Observe as células cultivadas diariamente um microscópio e registre as condições de crescimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passagem celular NOTA: Passagem e subcultura as células, quando a densidade celular primária atinge 60%.<ol>
<li>Lave as células cultivadas duas vezes usando PBS à temperatura ambiente. Adicionar 200 μL de solução de tripsina (0,25%) para cada prato e agitam manualmente o prato garantindo que todo o fundo é coberto. Descarte a solução de trippsina e incubar as células por 5 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Lave as células com 1,0 mL de meio de cultura fresca por pipetting e resuspender as células. Transfira 0,5 mL de suspensão celular para um novo prato, adicione 1,5 mL de meio fresco e incubar as células a 18 °C. NOTA: Raspadores de células podem ser usados para coleta de células quando a solução de tripsina não consegue digerir e separar as células dos pratos (algumas linhas celulares são muito adesivo). No entanto, não conduza ambos os métodos simultaneamente.</li>
		<li>Mude o meio após 12 h e observe as células um microscópio para avaliar as condições. Cultura as células para ensaios experimentais.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Apoptose Indução e Detecção em Células Intestinais A. japonicus
<ol><li>
Cultura celular e tratamento de dexametasona
	<ol>
<li>Prepare as células intestinais seguindo o protocolo previamente introduzido e adicione as células dropwise a uma placa de 12 poços em um volume celular de 2 x 106 por poço.</li>
		<li>Após três dias na cultura, seguindo os passos da "cultura celular de primeiro estágio", lave as células três vezes com PBS e substitua o meio por meio otimizado (sem antibióticos e fatores de crescimento).</li>
		<li>Dexamethasone diluída (DXMS) no meio da cultura para preparar soluções frescas de 2 μM e 200 μM DXMS antes de começar as experiências.</li>
		<li>Adicionar soluções DXMS em diferentes concentrações às células cultivadas cultivadas com o mesmo volume de culturing médio; definir três grupos experimentais, incluindo controle (CTL), 1 μM e 100 μM DXMS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mancha de Hoechst 
	<ol>
<li>Lave as células com PBS três vezes após a incubação com/sem DXMS para os períodos de tempo indicados (0 h, 24 h e 48 h).</li>
		<li>Adicione 300 μL de Solução Hoechst 33258 por poço a uma placa de 12 poços e incubar a 18 °C por 30 minutos. Gentilmente agita a placa para cobrir todas as células garantindo sua coloração.</li>
		<li>Retire a solução de coloração Hoechst e corrigir as células, adicionando 300 μL de uma solução de paraformaldeído de 4% (em PBS) para cada poço. Agitar suavemente por 15 min. CUIDADO: O paraformaldeído é moderadamente tóxico pelo contato ou inalação da pele, e é designado como um provável agente cancerígeno humano. Capas químicas de fumaça, compartimentos de equilíbrio ventilados ou outras medidas de proteção devem ser usadas durante a pesagem e manuseio do paraformaldeído.</li>
		<li>Lave as células fixas três vezes na PBS. Não descarte o PBS após a lavagem para manter as células cobertas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análise da microscopia fluorescente
	<ol>
<li>Ligue o hardware do microscópio fluorescente, incluindo o poder da lâmpada de mercúrio, energia de luz fluorescente e PC. Faça login na conta do sistema operacional, inteça o software e verifique sua configuração.</li>
		<li>Coloque a placa preparada no estágio do microscópio. Posicione a amostra sobre a lente objetiva usando o controlador de palco.</li>
		<li>Encontre as células de interesse o microscópio de luz, mude para microscopia fluorescente e capture as imagens ajustando os parâmetros. NOTA: Para observar o sinal fluorescente Hoechst 33258 vinculado ao DNA dos núcleos, a microscopia de fluorescência deve ser conduzida com excitação e emissão de aproximadamente 352 nm e 461 nm, respectivamente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenesis+in+primary+cell+cultures+from+larvae+of+the+abalone%2C+Haliotis+rufescens%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Marine+Biology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens.</a> Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).</li>
<li>Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+regeneration+and+biomineralization+in+sea+urchins%3A+role+of+Notch+signaling+and+presence+of+stem+cell+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Tissue regeneration and biomineralization in sea urchins: role of Notch signaling and presence of stem cell markers.</a> Plos One. 10 (8), 0133860(2015).</li>
<li>Schaffer, A. A., Bazarsky, M., Levy, K., Chalifa-Caspi, V., Gat, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptional+time-course+analysis+of+oral+vs.+aboral+whole-body+regeneration+in+the+Sea+anemone+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Bmc+Genomics%22%5BJournal%5D)">A transcriptional time-course analysis of oral vs. aboral whole-body regeneration in the Sea anemone Nematostella vectensis.</a> Bmc Genomics. 17, 718(2016).</li>
<li>Chiaramonte, M., Inguglia, L., Vazzana, M., Deidun, A., Arizza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+and+immune+response+to+bacterial+LPS+in+the+sea+urchin+Paracentrous+lividus+%28Lamarck%2C+1816%29%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+and+Shellfish+Immunology%22%5BJournal%5D)">Stress and immune response to bacterial LPS in the sea urchin Paracentrous lividus (Lamarck, 1816).</a> Fish and Shellfish Immunology. 92, 384-394 (2019).</li>
<li>Meng, J., Wang, T., Li, L., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+variation+in+anaerobic+energy+metabolism+reflects+hypoxia+tolerance+across+the+intertidal+and+subtidal+distribution+of+the+Pacific+oyster+%28Crassostrea+gigas%29%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Environmental+Research%22%5BJournal%5D)">Inducible variation in anaerobic energy metabolism reflects hypoxia tolerance across the intertidal and subtidal distribution of the Pacific oyster (Crassostrea gigas).</a> Marine Environmental Research. 138, 135-143 (2018).</li>
<li>Han, G., Zhang, S., Dong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaerobic+metabolism+and+thermal+tolerance%3A+The+importance+of+opine+pathways+on+survival+of+a+gastropod+after+cardiac+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Zoology%22%5BJournal%5D)">Anaerobic metabolism and thermal tolerance: The importance of opine pathways on survival of a gastropod after cardiac dysfunction.</a> Integrative Zoology. 12 (5), 361-370 (2017).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sea+cucumber+genome+provides+insights+into+morphological+evolution+and+visceral+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">The sea cucumber genome provides insights into morphological evolution and visceral regeneration.</a> PLoS Biology. 15 (10), 2003790(2017).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iTRAQ+reveals+proteomic+changes+during+intestine+regeneration+in+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+Part+D%3A+Genomics+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">iTRAQ reveals proteomic changes during intestine regeneration in the sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 22, 39-49 (2017).</li>
<li>Xu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+loss+by+apoptosis+is+involved+in+the+intestinal+degeneration+that+occurs+during+aestivation+in+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+Part+B%3A+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell loss by apoptosis is involved in the intestinal degeneration that occurs during aestivation in the sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 216, 25-31 (2018).</li>
<li>Yang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+characteristics+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+%28Selenka%29+during+aestivation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Marine+Biology+and+Ecology%22%5BJournal%5D)">Metabolic characteristics of sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) during aestivation.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 330 (2), 505-510 (2006).</li>
<li>Xiang, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycolytic+regulation+in+aestivation+of+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus%3A+evidence+from+metabolite+quantification+and+rate-limiting+enzyme+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+biology%22%5BJournal%5D)">Glycolytic regulation in aestivation of the sea cucumber Apostichopus japonicus: evidence from metabolite quantification and rate-limiting enzyme analyses.</a> Marine biology. 163 (8), 1-12 (2016).</li>
<li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+feedback+loop+involving+FREP+and+NF-kappaB+regulates+the+immune+response+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">A feedback loop involving FREP and NF-kappaB regulates the immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 135, 113-118 (2019).</li>
<li>Zhou, X., Chang, Y., Zhan, Y., Wang, X., Lin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+mRNA-miRNA+interaction+analysis+associate+with+immune+response+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+based+on+transcriptome+database%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+and+Shellfish+Immunology%22%5BJournal%5D)">Integrative mRNA-miRNA interaction analysis associate with immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus based on transcriptome database.</a> Fish and Shellfish Immunology. 72, 69-76 (2018).</li>
<li>Cai, X., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+invertebrate+cell+culture%3A+a+decade+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Marine invertebrate cell culture: a decade of development.</a> Journal of Oceanography. 70 (5), 405-414 (2014).</li>
<li>Maselli, V., Xu, F., Syed, N. I., Polese, G., Di Cosmo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Approach+to+Primary+Cell+Culture+for+Octopus+vulgaris+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Novel Approach to Primary Cell Culture for Octopus vulgaris Neurons.</a> Frontiers in Physiology. 9, 220(2018).</li>
<li>Pinsino, A., Alijagic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sea+urchin+Paracentrotus+lividus+immune+cells+in+culture%3A+formulation+of+the+appropriate+harvesting+and+culture+media+and+maintenance+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Sea urchin Paracentrotus lividus immune cells in culture: formulation of the appropriate harvesting and culture media and maintenance conditions.</a> Biology Open. 8 (3), (2019).</li>
<li>Odintsova, N. A., Dolmatov, I. Y., Mashanov, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+holothurian+tissues+as+a+source+of+cells+for+long-term+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Biology%22%5BJournal%5D)">Regenerating holothurian tissues as a source of cells for long-term cell cultures.</a> Marine Biology. 146 (5), 915-921 (2005).</li>
<li>Rastogi, R. P., Richa, R. P., Sinha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+Molecular+Mechanisms+and+Pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Excli+Journal%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: Molecular Mechanisms and Pathogenicity.</a> Excli Journal. 8, 155-181 (2009).</li>
<li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+proliferation%2C+and+morphology+during+vein+graft+remodeling+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+and+Molecular+Research%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, proliferation, and morphology during vein graft remodeling in rabbits.</a> Genetics and Molecular Research. 15 (4), (2016).</li>
<li>Kasibhatla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+of+suspension+cells+with+hoechst+33258+to+detect+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Staining of suspension cells with hoechst 33258 to detect apoptosis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (3), (2006).</li>
<li>Mikiewicz, M., Otrocka-Domagala, I., Pazdzior-Czapula, K., Rotkiewicz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+long-term%2C+high-dose+dexamethasone+administration+on+proliferation+and+apoptosis+in+porcine+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Influence of long-term, high-dose dexamethasone administration on proliferation and apoptosis in porcine hepatocytes.</a> Research in Veterinary Science. 112, 141-148 (2017).</li>
<li>Rinkevich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cultures+from+marine+invertebrates%3A+new+insights+for+capturing+endless+stemness%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell cultures from marine invertebrates: new insights for capturing endless stemness.</a> Marine Biotechnology. 13 (3), 345-354 (2011).</li>
<li>Bello, S. A., Abreu-Irizarry, R. J., Garcia-Arraras, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cell+cultures+of+regenerating+holothurian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary cell cultures of regenerating holothurian tissues.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 283-297 (2015).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+water+temperature+on+the+growth+and+fatty+acid+profiles+of+juvenile+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+%28Selenka%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thermal+Biology%22%5BJournal%5D)">Impact of water temperature on the growth and fatty acid profiles of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka).</a> Journal of Thermal Biology. 60, 155-161 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Extensos esforços de pesquisa têm sido dedicados ao estabelecimento de linhas celulares nas últimas décadas, no entanto, ainda é difícil fazer um progresso na cultura de longo prazo das células de invertebrados marinhos14,22. Tem sido relatado que as células cultivadas de regeneração de tecidos holothurian foram viáveis por um longo período de tempo e alta atividade de proliferação pode ser detectada em células específicas17,<su...

Cultivar células condições artificialmente controladas, e não em seu ambiente natural, fornece materiais experimentais uniformes para estudos biológicos, especialmente para espécies que não podem ser facilmente cultivadas em um ambiente de laboratório. Os invertebrados marinhos são responsáveis por mais de 30% de todas as espécies animais1,e fornecem inúmeros materiais biológicos para a realização de pesquisas sobre os mecanismos regulatórios de processos biológicos específicos, como regeneração2,3,resposta ao estresse4,e adaptação ambiental5,6.
O pepino do mar, Apostichopus japonicus,é uma das espécies mais estudadas echinoderm que habitam águas temperadas ao longo da costa do Pacífico Norte. É bem conhecido como uma espécie comercialmente importante e maricultured em grande escala no Leste Asiático, especialmente na China7. Inúmeras questões científicas sobre A. japonicus, incluindo os mecanismos regulatórios subjacentes regeneração intestinal após a evisceração8 e degeneração na aestivation9, controle metabólico10,11, e resposta imune12,13 estresses térmicos ou patogênicos, têm atraído a atenção dos pesquisadores. No entanto, em comparação com animais modelo bem estudados, a pesquisa básica, especialmente no nível celular, é limitada por gargalos técnicos, como a falta de métodos avançados de cultura celular.
Os pesquisadores têm dedicado muito esforço para estabelecer linhas celulares, mas eles também enfrentaram muitos desafios e nenhuma linha celular de qualquer invertebrado marinho foi estabelecida ainda14. No entanto, as culturas celulares primárias de invertebrados marinhos avançaram nas últimas décadas15,16,e eles proporcionaram uma oportunidade para a experimentação no nível celular. Por exemplo, a intesina regenerante de A. japonicus tem sido utilizada como uma fonte de células para culturas celulares de longo prazo que forneceu um método prático para a cultura celular primária de invertebrados marinhos17. Este protocolo combinou e otimizou abordagens da cultura de células invertebradas e desenvolveu um método de cultura primária amplamente adequado para pepino do mar ou outros invertebrados marinhos.
A poptose é um programa de suicídio de células intrínsecas desencadeado por vários estímulos exógenos e endógenos. A apoptose coordenada é crucial para muitos sistemas biológicos18,19,e tem sido implicada na regressão intestinal de pepino do mar durante a aestivation9. Para investigar o processo apoptotesco em organismos de interesse, uma série de métodos, incluindo a coloração Hoechst e ensaios microscopia, foram estabelecidos e aplicados com sucesso20. Aqui, realizamos aindução e detecção de apoptose em células intestinais primárias de pepino do mar para avaliar a usabilidade das células primárias em estudos biológicos de invertebrados marinhos. A dexametasona, um dos glicocorticosteroides sintéticos comumente usados21,foi usada para induzir apoptose em células intestinais cultivadas a partir de pepino do mar, e o sinal hoechst 33258 significativo foi detectado com sucesso nas células manchadas por microscopia fluorescente.

<table><tbody><tr><td>0,1 &mu; m filtro</td><td>Millipore</td><td>SLVV033RS</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mu; m filtro</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsin</td><td>Genom</td><td>GNM25200</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m filtro</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>pratos de 4 cm</td><td>ExCell Bio</td><td>CS016-0124</td><td></td></tr><tr><td>solução de paraformaldeído a 4%</td><td>Sinopharm 80096618 de reagentes químicos</td><td></td><td>em centrífugas de bancada PBS</td></tr><tr><td></td><td>Beckman</td><td>Allegra X-30R</td><td></td></tr><tr><td>BeyoClick EdU-488 kit</td><td>Beyotime</td><td>C0071S</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Incubadora</td> de temperatura constante <td>de 10005817</td><td></td>de reagentes químicos Sinopharm</tr><tr><td></td><td>Lucky Riptile</td><td>HN-3</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Reagente químico Sinopharm</td><td>XW00500221</td><td></td></tr><tr><td>banho-maria termostático elétrico</td><td>senxin17</td><td>DK-S28</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Reagente químico Sinopharm</td><td>80176961</td><td>75%</td></tr> <tr><td>Fator de crescimento de fibroblastos (FGF)</td> Microscópio fluorescente <td>PEPROTECH</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica DMI3000B</td><td>DMI3000B</td><td></td></tr><tr><td>Garamicina</td><td>Sinopharm Reagente químico</td><td>XW14054101</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sinopharm Reagente químico</td><td>63005518</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst33258 Solução de coloração</td><td>Beyotime</td><td>C1017</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sinopharm Reagente químico</td><td></td><td></td>XW1106168001</tr><tr><td>Fator de crescimento semelhante à insulina (IGF)</td> <td>PEPROTECH</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Reagente químico Sinopharm</td><td>10016308</td><td></td></tr><tr><td>L-15</td><td>Genom</td><td>GNM41300</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina de Leibovitz (100 mg / mL)</td> <td>Genom</td><td>GNM-21051</td><td></td></tr><tr><td>MgCl 2 </td> <td>Sinopharm Reagente</td> <td>químico</td><td></td>XW77863031</tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Sinopharm</td><td>Reagente Químico 10020518</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Reagente Químico Sinopharm</td><td>10019308</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Reagente Químico Sinopharm</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td>P1020</td><td>pH7.2-7.4</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Genom</td><td></td><td></td>GNM15140</tr><tr><td>medidor de PH</td><td>Bante</td><td>A120</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>SIGMA</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>VE</td><td>Seebio</td><td>185791</td><td></td></tr></tbody></table>

apoptose indução e detecção em uma cultura primária de células intestinais de pepino do mar

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

As células cultivadas primárias são usadas em uma variedade de disciplinas científicas como ferramentas excepcionalmente importantes para a avaliação funcional de substâncias biológicas ou caracterização de atividades biológicas específicas. No entanto, devido à falta de meios e protocolos de cultura celular universalmente aplicáveis, métodos de cultura celular bem descritos para organismos marinhos ainda são limitados. Enquanto isso, a contaminação microbiana que ocorre comumente e as propriedades polítas das células marinhas de invertebrados impedem ainda mais o estabelecimento de uma estratégia eficaz de cultura celular para invertebrados marinhos. Aqui, descrevemos um método fácil de manusear para cultivar células intestinais do pepino do mar Apostichopus japonicus; além disso, fornecemos um exemplo de in vitro apoptose indução e detecção em células intestinais de cultura primária. Além disso, este experimento fornece detalhes sobre o método de coleta de células e meio de cultura apropriado. O protocolo descrito é compatível com uma variedade de amostras de tecido amplamente disponíveis de organismos marinhos, incluindo Echinodermata, Mollusca e Crustáceo, e pode fornecer células suficientes para múltiplas aplicações experimentais in vitro. Esta técnica permitiria aos pesquisadores manipular eficientemente culturas de células primárias a partir de invertebrados marinhos e facilitar a avaliação funcional de materiais biológicos direcionados nas células.

Aqui, estabelecemos a cultura primária das células intestinais de A. japonicus e passamos as células. A Figura 1 mostra células redondas em diferentes estágios de cultivo. E os ensaios de coloração edu fornecer evidências diretas para revelar a atividade proliferativa dessas células redondas em fase posterior (Figura 2). Também ajustamos ligeiramente o protocolo, cultivando blocos de tecido picados em vez de células filtradas; além disso, um tipo de cél...

Este protocolo fornece um método fácil de manusear para cultura as células intestinais do pepino do mar Apostichopus japonicus e é compatível com uma variedade de amostras de tecido amplamente disponíveis de organismos marinhos, incluindo Echinodermata, Mollusca e Crustáceos.

Apoptose indução e detecção em uma cultura primária de células intestinais de pepino do mar

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

O protocolo fornece um método de cultura celular primária fácil de manusear e amplamente compatível para invertebrados marinhos. Essa técnica dá aos pesquisadores uma maneira de cultivar as células invertebrados marinhas por comparativamente longo tempo. Uma cultura de células deve ser fornecida com formação genética consistente para diferentes aplicações experimentais biológicas em pesquisas de biologia marinha.Para a nova pesquisa para este campo, acreditamos que o protocolo simplificado indicado deve ser a boa escolha para se exercitar. Após a anestesia, disseca e colete os intestinos anteriores, em seguida, selado as amostras de tecido verticalmente e remova o conteúdo interno. Lave as amostras de tecido em PBS duas vezes e desinfete-as por imersão em uma solução de 75% de etanol por não mais do que dois segundos.Em seguida, lave as amostras de tecido em PBS três vezes para remover o etanol, e transfira cerca de 100 miligramas de amostra de tecido para um tubo micro centrífuga estéril de dois mililitros. Adicione 1,5 mililitros de cultura pré-otimizada ao bloco de tecido intestinal de pepino marinho e pique o bloco com uma tesoura cirúrgica esterilizada até que a solução esteja

apoptosis-induction-detection-primary-culture-sea-cucumber-intestinal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Apresenta-se um protocolo simples de visualizar regiões de morte celular programada (PCD) em embriões de ratinho e de diferenciação estaminais embrionárias de culturas (ES) de células utilizando um corante altamente solúvel chamada Lyso Tracker.

Uso de Lyso Tracker para detectar a morte celular programada em embriões e diferenciação das células-tronco embrionárias

Certas perturbações genéticas ou exposição a toxinas podem interromper os processos normais de desenvolvimento, levando à morte de tipos específicos de células. A análise da Caspase 3 ativada por imunofluorescência total em embriões de peixe-zebra revela a localização específica do estágio e do tecido de células especificamente submetidas à apoptose.

Análise de apoptose em embriões Zebrafish por Whole-mount imunofluorescência para detectar Caspase 3 ativado

O termo anastase refere-se ao fenômeno no qual as células moribundas revertem um processo de suicídio celular em um estágio tardio, se reparam e, finalmente, sobrevivem. Aqui demonstramos protocolos para detectar e rastrear células que passam por anástase.

Estratégias para Rastreamento Anastasis, uma célula de sobrevivência Fenômeno que reverte apoptose

Aqui, apresentamos um protocolo para a determinação de eventos de sinalização intracelular induzidos em células viáveis por interação física com células mortas ou moribundas adjacentes. O protocolo se concentra em eventos de sinalização induzidos pelo reconhecimento mediado por receptor das células mortas, em oposição à sua captação fagocítica ou liberação de mediadores solúveis.

Identificação de sinalização intracelular Eventos induzida em células viáveis ​​pela interação com as células vizinhas Submetidos a apoptose celular Morte

Efferocytosis, a remoção fagocitária das células apoptóticas, é necessário para manter a homeostase e é facilitado por receptores e vias de sinalização que permitem o reconhecimento, a duração e internalização de pilhas apoptotic. Neste documento, apresentamos um protocolo de microscopia de fluorescência para a quantificação dos efferocytosis e a atividade das vias de sinalização de efferocytic.

Quantificação de Efferocytosis por microscopia de fluorescência de célula única

Um fluxo de trabalho usando a centrifugação diferencial ou citometria de fluxo é desenvolvido para detectar, quantificar e isolar corpos apoptotic de uma amostra de apoptotic de alta pureza.

Detecção e isolamento de corpos Apoptotic de alta pureza

Descrevemos aqui um protocolo para investigar a citotoxidade de CD8 pré-activated+ T células contra as células cancerosas através da detecção de apoptotic câncer células através do tempo real microscopia. Este protocolo pode investigar os mecanismos subjacentes mieloide induzida por células T cell supressão e avaliar compostos vistos reabastecer T células através do bloqueio de células mieloides supressivas do sistema imunológico.

Detecção de tempo real em Vitro Tumor celular apoptose induzida por CD8+ T células para estudar as funções imunológicas supressora de Tumor infiltrando células mieloides

Aqui, nós apresentamos um protocolo para preparar timócitos apoptóticos e macrófagos peritoneais e para analisar a eficiência do macrófagos e do bloqueio inibidor-negociado específico do engulfment apoptóticas dos timócitos. Este protocolo tem uma aplicação larga no afastamento Cell-negociado de outras partículas que incluem grânulos e bactérias artificiais.

Análise experimental do engulfment do Thymocyte de apoptotic por macrófagos

O protocolo apresentado utiliza citometria de fluxo para quantificar o número de células proliferantes e mortas em enteróides de camundongos cultivados. Este método é útil para avaliar os efeitos do tratamento medicamentoso sobre a proliferação organoide e a sobrevivência.

Quantificação de Células Proliferativas e Mortas em Enteróides

Este protocolo descreve um modelo de enterocolite necrosante a apical (NEC)-in-a-dish utilizando pequenos enteróides intestinais com polaridade invertida, permitindo o acesso à superfície apical. Fornecemos um protocolo de coloração imunofluorescente para detectar interrupção epitelial relacionada à NEC e um método para determinar a viabilidade de enteróides apical-out submetidos ao protocolo NEC-in-a-dish.

In vitro Modelo enteróide apical-out de enterocolite necrotizante

Este protocolo descreve um método simples e econômico para investigar e quantificar a morte celular em organoides colônicos humanos em resposta a perturbações citotóxicas, como citocinas. A abordagem emprega um corante de morte celular fluorescente (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), microscopia de fluorescência ao vivo e software de análise de imagem de código aberto para quantificar as respostas de um único organoide a estímulos citotóxicos.

Quantificação da morte celular induzida por citocinas em organoides colônicos humanos usando microscopia de fluorescência ao vivo

Aprenda a induzir e detectar apoptose em células intestinais primárias de pepino do mar Apostichopus japonicus. Este protocolo simplificado permite cultivo de longo prazo para pesquisas em biologia marinha.

Apoptose indução e detecção em uma cultura primária de células intestinais de pepino do mar

Explorar mais vídeos