Name: Modelo In Vitro de Angiogênese Coronariana (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Aprenda a desenvolver um modelo in vitro de angiogênese coronariana usando culturas de explantes de seio venoso e endocárdio de embriões de camundongo. Este método permite investigar os mecanismos moleculares da formação de vasos sanguíneos cardíacos e as respostas celulares ao VEGF-A em condições controladas.

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Os autores agradecem aos membros do laboratório Sharma por fornecer um ambiente de pesquisa de apoio. Gostamos de agradecer especialmente a Diane (Dee) R. Hoffman que mantém e cuida da nossa colônia de ratos. Também gostaríamos de agradecer aos Drs. Philip J. Smaldino e Carolyn Vann por revisarem completamente o manuscrito e fornecerem comentários úteis. Este trabalho foi apoiado por fundos do Ball State University Provost Office and Department of Biology to B.S, Indiana Academy of Sciences Senior Research Grant funds to B.S, e NIH (RO1-HL128503) e the New York Stem Cell Foundation fundos para K.R.

O uso de todos os animais neste protocolo seguiu as diretrizes do Comitê de Cuidado e Uso De Animais Institucionais da Ball State University (IACUC).
1. Estabelecer criadores de ratos e detectar plugues vaginais para gravidez espartífica
<ol><li>Montar uma gaiola de criação de ratos com camundongos do tipo selvagem e camundongos fêmeas. Certifique-se de que a idade dos camundongos reprodutores é entre 6-8 semanas. Configure um par (1 macho e 1 fêmea) ou como trio (1 macho e 2 fêmea) para reprodução.</li>
	<li>Verifique se há um plugvaginal na manhã seguinte. Use uma sonda metálica angular para detectar um plugue profundo inserindo-o na abertura vaginal. Designe a manhã de um plugue vaginal positivo como embrionária dia 0.5 (e0.5). NOTA: Um plugue vaginal pode ser superficial (que é facilmente visível, ver Figura 1) ou profundo (que não é facilmente visível). A presença de um plugue profundo bloqueará a inserção total da sonda, enquanto a ausência de um plugue permitirá a inserção total sem resistência.</li>
	<li>Manter a gravidez cronometrada até que os embriões atinjam e11,5 nos quais serão colhidos. Para confirmar a gravidez antes da colheita dos embriões, registre o peso de camundongos fêmeas entre e7,5 e e11,5. NOTA: O aumento diário do peso da mãe indicará uma gravidez bem sucedida, enquanto nenhuma mudança de peso indicará uma gravidez fracassada.</li>
</ol>2. Colheita de embriões de camundongos gestantes
NOTA: Antes de começar, certifique-se de ter os seguintes equipamentos e reagentes: uma câmara de eutanásia CO2, 70% etanol, toalhas de papel, fórceps regulares, fórceps finos, 1x salino tampão de fosfato estéril (PBS), 10 cm placas de Petri estéril, recipiente com gelo, colher perfurada, estereomicroscópio dissecção.
<ol><li>Coloque um rato e11.5 em uma câmara de eutanásia co2 limpa para sacrificá-lo. Feche a tampa da câmara para evitar que o rato escape.</li>
	<li>Depois que o mouse estiver preso na câmara de eutanásia, ligue o CO2. Certifique-se de regular a taxa de fluxo de CO2 por recomendações da IACUC (ou seja, deslocamento de 10-30% por minuto). Depois que o camundongo é completamente eutanizado, realize a luxação cervical para garantir a morte.</li>
	<li>Borrife o rato com 70% de etanol. Levante a pele sobre a barriga usando fórceps, faça uma pequena incisão usando uma tesoura e estenda a incisão lateralmente. Aumente a incisão anteriormente até o diafragma e exponha o chifre uterino contendo os embriões (Figura 2).</li>
	<li>Puxe a corda de embriões (chifre uterino + embriões) agarrando o útero e cortando-o livremente. Coloque a corda de embriões em 1x PBS estéril gelado.</li>
	<li>Disseque os embriões individuais do chifre do útero descascando o músculo uterino, saco de gema e amnion um por um(Figura 3A-F) um microscópio estereomicroscópio. Transfira os embriões limpos usando uma colher perfurada para uma placa de Petri contendo 1x PBS estéril no gelo. Certifique-se de manter os embriões frios.</li>
</ol>3. Isolando corações de e11.5 Embriões
NOTA: Antes de começar, certifique-se de ter os seguintes equipamentos e reagentes: fórceps regulares, fórceps finos, 1x PBS estéril, 10 cm de placa de Petri estéril, placa de Petri estéril de 6 cm, recipiente com gelo, colher perfurada, estereomicroscópio de dissecção.
<ol><li>Configure uma nova placa de Petri com gelo frio estéril 1x PBS um microscópio estereomicroscópio. Transfira um embrião do passo 2.5 para a placa de Petri para dissecar o coração.</li>
	<li>Remova a cabeça do embrião usando fórceps. Primeiro, aperte a cabeça entre os fórceps com uma mão e, em seguida, remova a cabeça raspando-a com a outra mão usando fórceps fechados(Figura 4A-C).</li>
	<li>Depois de remover a cabeça, oriente o embrião com seu lado ventral para cima, segurando o embrião com fórceps na barriga com uma mão(Figura 4D).</li>
	<li>Com a outra mão, abra a parede torácica do embrião fazendo primeiro uma pequena incisão no peito ligeiramente acima do diafragma usando fórceps finos. Em seguida, aumente a incisão com muito cuidado, inserindo fórceps fechados e rasgando a parede torácica abrindo os fórceps. Certifique-se de não empurrar muito fundo, o que pode danificar o coração. Com a ajuda dos fórceps, mantenha a parede torácica aberta para expor o coração e os pulmões na cavidade torácica(Figura 4E).</li>
	<li>Usando fórceps finos, mova suavemente o coração anteriormente (90°) e exponha a aorta/veia dorsal. Retire o coração/pulmões anteriormente capturando a aorta/veia dorsal na base do coração(Figura 4F-H). NOTA: Seja gentil ao retirar o coração/pulmões para evitar o rasgo do SV, que está localizado no lado dorsal do coração.</li>
	<li>Enxágüe o coração/pulmões com PBS frio 1x para remover as células sanguíneas.</li>
	<li>Repita as etapas 3.1-3.6 para remover o coração/pulmões dos embriões restantes. Certifique-se de manter o coração/pulmões isolados no gelo.</li>
</ol>4. Isolando SVs e Ventrículos de e11.5 Corações de Rato Embrionários
<ol><li>Coloque a placa de Petri com coração/pulmões do passo 3.7 um microscópio estereomicroscópio para isolar os SVs e ventrículos inteiros. Retire os lóbulos anexados dos pulmões um por um de suas raízes usando fórceps finos.</li>
	<li>Oriente o coração em seu lado dorsal e remova atria e o tecido adjacente que circunda o SV anteriormente sem rasgar o SV. Remova o atria esquerdo e direito do coração segurando-o em sua base e raspando-o usando fórceps finos(Figura 5B). Remova o tecido adjacente ao redor do SV usando uma técnica semelhante(Figura 5C). NOTA: Tenha em mente que o átrio direito está ligado ao SV, por isso tenha cuidado para apenas remover o átrio.</li>
	<li>Para isolar o SV, primeiro oriente o coração com seu lado dorsal voltado para cima (porque o SV está no lado dorsal) e mantenha o coração ainda nesta posição, segurando suavemente o coração em seus ventrículos com fórceps. NOTA: O SV é um órgão de entrada de um coração embrionário que fica entre o árto no lado dorsal do coração.</li>
	<li>Remova o SV tirando-o cuidadosamente do coração onde está preso ou segurando o SV na base do seu acessório com fórceps finos e raspando-o com fórceps fechados(Figura 5D,E).</li>
	<li>Transfira o SV isolado para uma nova placa de Petri de 6 cm com 1x PBS estéril e gelado no gelo usando uma pipeta de transferência estéril e rotule a placa de Petri como SV.</li>
	<li>Para isolar os ventrículos inteiros, remova o trato de saída (aorta e tronco pulmonar) do coração após a remoção do SV (Figura 5F,G).</li>
	<li>Transfira os ventrículos inteiros para uma nova placa de Petri de 6 cm contendo 1x PBS estéril no gelo usando uma pipeta de transferência estéril e rotule a placa de Petri como ventrículo. Mantenha o SV isolado e ventrículos no gelo.</li>
	<li>Repita as etapas 4.1-4.7 para isolar SVs e ventrículos dos corações restantes.</li>
</ol>5. Configuração de placas de cultura de tecido com inserções e revestimento de matriz extracelular
NOTA: Antes de começar, certifique-se de ter os seguintes equipamentos e reagentes: solução de matriz extracelular comercial (ECM; por exemplo, Matrigel), 8,0 μM de polietileno tereftalato (PET), 24 placas de poço, 37 °C, incubadora de 5% CO2.
<ol><li>Deixe a solução ECM descongelar no gelo. Mantenha a solução ECM no gelo para evitar solidificação.</li>
	<li>Coloque as pastilhas de cultura de membrana PET (tamanho dos poros = 8,0 μm, área de filtragem = 0,3 cm2, diâmetro do filtro = 6,5 mm) nos poços de cultura não tecidual tratados 24 placas de poço. Rotular as placas como SV ou ventrículos para os ensaios de angiogênese endocárdica ou endocárdica, respectivamente. NOTA: Configure as pastilhas em placas separadas para o SV e os ventrículos quando realizar ambas as culturas simultaneamente. Certifique-se de configurar poços suficientes para todas as amostras experimentais e controles.</li>
	<li>Depois que a solução ECM for descongelado, diluir imediatamente o ECM 1:2 no meio basal pré-refrigerado (ou seja, meio basal EBM-2, consulte Tabela de Materiais) para um volume suficiente (100 μL/inserir x número de inserções). NOTA: Por exemplo, se houver seis pastilhas, então o volume total será de 100 μL x 6 = 600 μL. Adicione 200 μL de ECM em 400 μL de meio basal.</li>
	<li>Cubra as pastilhas com 100 μL de ECM recém-diluído adicionando-o diretamente em cima da membrana. Incubar a placa a 37 °C por pelo menos 30 min para permitir que o ECM se solidifique. NOTA: Isto deve ser realizado uma capa de cultura de tecido de fluxo laminar para evitar contaminação.</li>
</ol>6. SVs e Culturas de Ventrículos Inteiros
NOTA: Antes de começar, certifique-se de ter os seguintes equipamentos e reagentes: 70% de etanol, pipeta de transferência, estereótipo, fórceps, capa de cultura de tecido de fluxo laminar, kit de suplemento celular endotelial microvascular(Tabela de Materiais),meio basal, 1x PBS estéril. A Figura 6 mostra o fluxo de trabalho da cultura SV e ventrículo.
<ol><li>Descongele o conteúdo do kit de suplemento suplementar no gelo. Prepare o meio completo adicionando todo o conteúdo do kit de suplemento em 500 mL de meio basal uma capa de cultura de tecido de fluxo laminar certificada. Misture bem o meio e distribua em alíquotas de 50 mL.</li>
	<li>Esterilizar a base do microscópio estereomicroscópio e área de trabalho circundante com 70% de etanol.</li>
	<li>Obter as placas de cultura de tecido a partir do passo 5.4. Com o auxílio de uma pipeta de transferência, transfira cuidadosamente as explantas do passo 4.7 em cima da membrana de inserção. um microscópio estereomicroscópio e com o auxílio de fórceps limpos, posicione as plantas no centro das pastilhas para garantir que não fiquem presas no canto das pastilhas ou presas às paredes laterais.</li>
	<li>Depois que as explantas forem colocadas e centradas nas pastilhas, remova cuidadosamente qualquer PBS extra das pastilhas e feche as tampas das placas.</li>
	<li>uma capa de cultura de tecido de fluxo laminar, adicione 100 μL do meio completo pré-aquecido em cima das pastilhas e 200 μL nos poços para cultivar as explantas na interface ar-líquido de tal forma que a superfície basal da inserção esteja em contato com o meio , mas a superfície superior está exposta ao ar. NOTA: Certifique-se de ajustar o volume para obter uma interface ar-líquido se utilizar diferentes inserções de tamanho/placas de poço.</li>
	<li>Adicione 300 μL de PBS nos poços não utilizados das 24 placas de poço e cubra com a tampa. Incubar a placa em uma incubadora de 37 °C, 5% CO2, e cultivar as culturas por 5 dias.</li>
	<li>Nos dias seguintes, observe rotineiramente as culturas um microscópio de luz invertida para avaliar o estado das culturas explantes. Certifique-se de que as explantas exibem batida contraída e que todas as explantas estão presas à parte inferior da membrana embutida com ECM. Tome nota de qualquer explante flutuante. NOTA: A contração periódica das explantas indica que elas estão vivas. Explantas flutuantes devem ser omitidas da análise.</li>
	<li>Depois de avaliar o status da cultura, coloque a placa de cultura de volta na incubadora e continue a cultivar a cultura por até 5 dias.</li>
</ol>7. Tratamento de Culturas com VEGF-A (Controle Positivo)
NOTA: Antes de começar, certifique-se de ter os seguintes equipamentos e reagentes: capa de cultura de tecido de fluxo laminar, 1x PBS, meio basal + 1% de soro bovino fetal (FBS), meio basal + VEGF-A, pipetas e pontas de pipeta.
<ol><li>Prepare o meio basal + 1% FBS e o meio basal + VEGF-A.<ol>
<li>Para preparar o meio basal + 1% FBS, primeiro determine o número de poços de controle necessários. Por exemplo, se houver três poços de controle, então 300 μL/poço x 3 = 900 μL é o volume total necessário. Adicione 9 μL de FBS em 891 μL de meio basal para fazer o meio basal + 1% FBS.</li>
		<li>Para preparar o meio basal + VEGF-A, primeiro determine o número total de poços que necessitam do meio VEGF-A. Se houver três poços, então 300 μL/poço x 3 = 900 μL é o volume total e 50 ng/well x 3 = 150 ng VEGF-A. Adicione 150 ng de VEGF-A em 900 μL de meio basal para fazer o meio basal + VEGF-A. NOTA: Monte esta solução em um volume maior do que o calculado para assegurar um número suficiente de alíquotas menores para cada experimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>No dia 2, retire a mídia de ambas as câmaras (as pastilhas e os poços). Lave culturas com 300 μL de 1x PBS adicionando 100 μL às pastilhas e 200 μL nos poços. Gire firmemente as placas algumas vezes e remova o PBS.</li>
	<li>Adicione 300 μL de meio basal + 1% FBS (100 μL na inserção e 200 μL nos poços) para matar de fome as culturas por 24 horas.</li>
	<li>No dia 3, após a fome, adicione 300 μL de meio basal + 1% FBS (100 μL na inserção e 200 μL nos poços) nos poços de controle e meio basal + VEGF-A (50 ng/well) nos poços de tratamento, respectivamente.</li>
	<li>Após o tratamento, continue a cultivar as culturas na incubadora.</li>
</ol>8. Fixação e Imunocoloração
NOTA: Antes de começar, certifique-se de ter os seguintes equipamentos e reagentes: 4% de paraformaldeído (PFA), 1x PBS, anticorpos primários e secundários, um shaker, 0,5% surfactante nonionico em PBS (PBT).
<ol><li>No sexto dia de cultivo, remova as culturas médias e de lavagem com 1x PBS à temperatura ambiente (RT).<ol>
<li>Corrija as culturas adicionando 200 μL de solução PFA de 4% nos poços e 100 μL nas pastilhas. Fixar culturas em 4 °C por 20 min enquanto balança.</li>
		<li>Após 20 min de fixação, remova pfa das culturas em uma capa de fumaça e lave as culturas com 1x PBS adicionando 200 μL nos poços e 100 μL nas pastilhas.</li>
		<li>Repita as lavadas 3x, 10 min cada, enquanto balança. Em seguida, proceder à realização de imunocoloração. NOTA: Todas as etapas de lavagem são realizadas em uma bancada no RT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diluir anticorpos primários (anti-VE-Cadherin, anti-ERG 1/2/3) na solução de bloqueio (5% de soro de burro, 0,5% PBT). Adicione 300 μL de solução de anticorpos primários (200 μL nos poços inferiores e 100 μL nas pastilhas). Incubar culturas em anticorpos primários durante a noite a 4 °C enquanto balança. NOTA: Anti-VE-Cadherin é usado para rotular a membrana celular endotelial e anti-ERG 1/2/3 é usado para rotular o núcleo celular endotelial, a fim de visualizar os brotos angiogênicos de células endoteliais.</li>
	<li>No dia seguinte, lave e balance as placas de cultura 10x em 0,5% de PBT, mudando PBT a cada 10 min.</li>
	<li>Diluir os anticorpos secundários (burro anti-rato Alexa Fluor 488 e burro anti-coelho Alexa Fluor 555) na solução de bloqueio. Adicione 300 μL do anticorpo secundário como no passo 8.2 e incuba rastas as culturas durante a noite a 4 °C enquanto balança. No dia seguinte, lave os anticorpos secundários 10x em PBT, mudando PBT a cada 10 min. NOTA: Lave um mínimo de 10x, mas mais lavelas são melhores. Depois que as lavadas são completas, as culturas podem ser armazenadas com 1x PBS até que sejam montadas em slides.</li>
</ol>9. Culturas de montagem em slides, imagens e análises
NOTA: Antes de começar, certifique-se de ter os seguintes equipamentos e reagentes: pinças finas, lâminas, meio de montagem com 4′,6-diamidino-2-fenillindole (DAPI), tampas e microscópio confocal. Após a coloração de anticorpos secundários, monte as culturas em slides para imagens usando as seguintes etapas.
<ol><li>Retire a membrana cuidadosamente da inserção usando fórceps finos e transfira-a para as lâminas colocando o lado da membrana para baixo e colocando as culturas explantem para cima. Coloque as amostras de réplica nos mesmos slides e rotule os slides como controle ou VEGF-A. Adicione algumas gotas de meio de montagem com DAPI diretamente na membrana e cubra os slides com deslizamentos de cobertura. NOTA: Certifique-se de evitar bolhas de ar enquanto coloca as tampas.</li>
	<li>Feche as bordas dos slides com esmalte claro e deixe secar. NOTA: Os slides podem ser armazenados em -20 °C para armazenamento a longo prazo.</li>
	<li>Slides de imagem usando um microscópio confocal.</li>
	<li>Realizar análises para medir o comprimento do crescimento angiogênico. Quantifique o comprimento de crescimento angiogênico medindo a distância das células endoteliais (Ve-Cadherin+/ERG 1/2/3+) estendidas do limite interno das células ERG 1/2/3+ nas culturas do ventrículo e do centro das explantas SV nas culturas SV.<ol>
<li>Para realizar a quantificação usando FIJI/ImageJ, primeiro baixe o software FIJI.</li>
		<li>Abrir arquivos de imagem em FIJI: vá para File | Aberto | Pasta | Nome do arquivo | Abra.</li>
		<li>Vá analisar | Definir medidas | Selecione Perímetro.</li>
		<li>Selecione a ferramenta Linha reta na janela principal.</li>
		<li>Desenhe uma linha através do comprimento de um broto, conforme sugerido na etapa 9.4.</li>
		<li>Vá analisar | Medida. NOTA: As medidas de comprimento são exibidas na nova janela.</li>
		<li>Realize quantificação em imagens que representam pelo menos três campos de exibição selecionados aleatoriamente. Média das medidas de comprimento de broto e reportá-las como média ± desvio padrão.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Rhee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+deletion+of+Ino80+disrupts+coronary+angiogenesis+and+causes+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Endothelial deletion of Ino80 disrupts coronary angiogenesis and causes congenital heart disease.</a> Nature Communications. 9 (1), 368(2018).</li>
</ol>

Os autores não declaram conflito de interesses.

Algumas das etapas mais críticas para o crescimento com sucesso de vasos coronários dos tecidos progenitores SV e Endo são: 1) Identificar e isolar corretamente o tecido SV para a cultura SV; 2) utilizar ventrículos de embriões entre as idades de e11-11,5 para cultura endo precisa; 3) manter as condições estéreis durante todo o período de dissecção e manter os tecidos frios o tempo todo; e 4) manter as explantas presas à membrana revestida de ECM para evitar que o tecido flutuasse no meio.
Pri...

Vasos sanguíneos do coração são comumente chamados vasos coronários. Esses vasos são compostos por artérias, veias e capilares. Durante o desenvolvimento, primeiro são estabelecidos capilares altamente ramificados, que depois se remodelam em artérias coronárias e veias1,2,3,4,5. Estes capilares iniciais são construídos a partir de células progenitoras endoteliais encontradas nos tecidos proepicárdio, sinus venoso (SV) e endocárdio (Endo)1,6,7,8. SV é o órgão de entrada do coração embrionário e Endo é o revestimento interno do lúmen do coração. As células progenitoras endoteliais encontradas no SV e no Endo constroem a maioria da vasculatura coronária, enquanto o proepicárdio contribui para uma porção relativamente pequena dela2. O processo pelo qual a rede capilar de vasos coronários cresce no coração a partir de suas células precursoras pré-existentes é chamado angiogênese coronariana. A doença arterial coronariana é uma das principais causas de morte em todo o mundo e ainda falta um tratamento eficaz para esta doença. Compreender os mecanismos celulares e moleculares detalhados da angiogênese coronariana pode ser útil na concepção de terapias novas e eficazes para reparar e regenerar artérias coronárias danificadas.
Recentemente, uma onda de compreensão de como os vasos coronários se desenvolvem tem sido, em parte, alcançada através do desenvolvimento de novas ferramentas e tecnologias. Em particular, a rotulagem de linhagem in vivo e tecnologias avançadas de imagem têm sido muito úteis para descobrir a origem celular e as vias de diferenciação dos vasos coronários9,10,11,12. Apesar das vantagens dessas ferramentas in vivo, há limitações em termos de velocidade, flexibilidade e acessibilidade. Portanto, sistemas robustos de modeloin vitro podem complementar sistemas in vivo para elucidar os mecanismos celulares e moleculares da angiogênese coronariana de forma de alta duração.
Aqui, descrevemos um modelo in vitro de angiogênese coronariana. Desenvolvemos um sistema de cultura de explante in vitro para cultivar vasos coronários a partir de dois tecidos progenitores, SV e Endo. Com este modelo, mostramos que as culturas de tecido in vitro explantam brotam de vasos coronários quando estimuladas pelo meio de crescimento. Além disso, as culturas explantes crescem rapidamente em comparação com o controle quando estimuladas pelo fator de crescimento endotelial vascular A (VEGF-A), uma proteína angiogênica altamente potente. Além disso, verificou-se que os brotos angiogênicos da cultura SV sofrem desdiferenciação venosa (perda da expressão COUP-TFII), mecanismo semelhante à angiogênese SV in vivo1. Esses dados sugerem que o sistema de cultura in vitro explanta fielmente restabelece eventos angiogênicos que ocorrem in vivo. Coletivamente, modelos in vitro de angiogênese descritos aqui são ideais para sondar mecanismos celulares e moleculares de angiogênese coronariana de forma de alto nível e acessível.

<table><tbody><tr><td>Placa de cultura de tecidos de 100 x 20 MM</td><td>Fisher Scientific</td><td>877222</td><td>Referido no protocolo como placa</td></tr><tr><td>de Petri Placas de 24 poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-51</td><td></td></tr><tr><td>Inserções de cultura de membrana PET de 8,0 uM</td><td>Millipore Sigma</td><td>MCEP24H48</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-coelho 555</td><td>Fisher Scientific</td><td>A31572</td><td>Anticorpo secundário</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-rato 488</td><td>Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td>Anticorpo secundário</td></tr><tr><td>Sonda de metal angular</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>10088-15</td><td>Angular 45 graus, usado para detectar plugues profundos</td></tr><tr><td>Anti- ERG 1/2/3 anticorpo</td><td>Abcam</td><td>Ab92513</td><td>Anticorpo primário</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-VE caderina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BDB550548</td><td>Anticorpo primário, fabricante BD BioSciences</td></tr><tr><td>Tanque de gás CO2</td><td>Vários fornecedores</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubadora</td><td>Fisher Scientific</td><td>13998223</td><td>Para 37 &deg; C, 5% CO2 incubação</td></tr><tr><td>Estereomicrosope de dissecção</td><td>Leica</td><td>S9i</td><td>Leica S9i Estereomicroscópio</td></tr><tr><td>EBM-2 meio basal</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td> Solução de ECM de <td>meio basal de crescimento de células endoteliais</td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Comercialmente conhecido como Matrigel</td></tr><tr><td>EGM-2 MV Singlequots Kit</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td>Kit de suplemento de células endoteliais microvasculares; Isso é misturado ao EBM-2 para tornar o EGM-2 meio completo</td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal (FBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3007003IR</td><td></td></tr><tr><td>FiJi</td><td>NIH</td><td>NA</td><td>Software de processamento de imagem (<a href="https://imagej.net/Fiji/Downloads" target="_blank">https://imagej.net/Fiji/Downloads</a>)</td></tr><tr><td>Fórceps Fino</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>11412-11</td><td>Usado para embrião tesoura</td></tr><tr><td>de operação de lâmina reta Fisherbrand Fisher</td><td>Scientific</td><td>13-808-4</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH-302-5601LR</td><td></td></tr><tr><td>Capuz de cultura de tecidos de fluxo laminar</td><td>Fisher Scientific</td><td>vários modelos disponíveis</td><td></td></tr><tr><td>Montagem Medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Vectashield com DAPI</td></tr><tr><td>Microscopia Eletrônica de Paraformaldeído (PFA)</td><td>/Fisher</td><td>50-980-494</td><td>Está disponível a 32%; precisa ser diluído a 4%</td></tr><tr><td>Colher perfurada</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>10370-18</td><td>Útil na remoção de embriões/tecidos de uma solução</td></tr><tr><td>Murino recombinante VEGF-A 165</td><td>PeproTech</td><td>450-32</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps padrão, Dumont #5</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de rato/rato Sure-Seal</td><td>Easysysteminc</td><td>EZ-1785</td><td>Câmara de eutanásia</td></tr></tbody></table>

modelo in vitro de angiogênese coronariana

In Vitro Model of Coronary Angiogenesis

Aqui, descrevemos um ensaio de cultura in vitro para estudar angiogênese coronariana. Vasos coronários alimentam o músculo cardíaco e são de importância clínica. Defeitos nesses vasos representam graves riscos à saúde, como na aterosclerose, que podem levar a infartos do miocárdio e insuficiências cardíacas em pacientes. Consequentemente, a doença arterial coronariana é uma das principais causas de morte em todo o mundo. Apesar de sua importância clínica, relativamente pouco progresso foi feito sobre como regenerar artérias coronárias danificadas. No entanto, avanços recentes foram feitos na compreensão da origem celular e das vias de diferenciação do desenvolvimento de vasos coronários. O advento de ferramentas e tecnologias que permitem aos pesquisadores rotular fluorescentemente células progenitoras, seguir seu destino e visualizar progêias in vivo têm sido fundamentais na compreensão do desenvolvimento de vasos coronários. Estudos in vivo são valiosos, mas têm limitações em termos de velocidade, acessibilidade e flexibilidade no design experimental. Alternativamente, modelos in vitro precisos de angiogênese coronariana podem contornar essas limitações e permitir que os pesquisadores interroguem questões biológicas importantes com rapidez e flexibilidade. A falta de sistemas de modelo in vitro adequados pode ter dificultado o progresso na compreensão dos mecanismos celulares e moleculares do crescimento de vasos coronários. Aqui, descrevemos um sistema de cultura in vitro para cultivar vasos coronários a partir do sinus venosus (SV) e endocárdio (Endo), os dois tecidos progenitores dos quais muitos dos vasos coronários surgem. Também confirmamos que as culturas recapitulam com precisão alguns dos mecanismos in vivo conhecidos. Por exemplo, mostramos que os brotos angiogênicos na cultura a partir de SV para baixo regulam a expressão COUP-TFII semelhante ao observado in vivo. Além disso, mostramos que o VEGF-A, um conhecido fator angiogênico in vivo, estimula robustamente a angiogênese das culturas SV e Endo. Coletivamente, criamos um modelo preciso de cultura in vitro para estudar angiogênese coronariana.

Uma das características mais marcantes da angiogênese sv in vivo é que ela segue um caminho específico e envolve eventos de desdiferenciação celular e rediferenciação que ocorrem em tempos etinitários e posições1. À medida que as células SV iniciais crescem no ventrículo cardíaco, elas param de produzir marcadores venosos como o COUP-TFII(Figura 7). Posteriormente, brotos coronários tomam dois caminhos de migração, seja sobre a superfí...

Modelos in vitro de angiogênese coronariana podem ser utilizados para a descoberta dos mecanismos celulares e moleculares da angiogênese coronariana. Culturas in vitro explantam tecidos sinus venosos e endocárdios mostram crescimento robusto em resposta ao VEGF-A e apresentam um padrão semelhante de expressão COUP-TFII como in vivo.

Modelo In Vitro de Angiogênese Coronariana

Here, we describe an in vitro culture assay to study coronary angiogenesis. Coronary vessels feed the heart muscle and are of clinical importance. Defects ...

Nosso protocolo é significativo porque permite que os pesquisadores investiguem o mecanismo molecular da angiogênese coronária fora de um organismo. A principal vantagem dessa técnica é que ela modela com precisão o processo de angiogênese coronária dentro de um organismo, facilitando o estudo dos mecanismos da angiogênese coronariana. Comece pulverizando um rato grávida carregando embriões embrionários de 11,5 dias com 70% de etanol.Levantando a pele sobre a barriga com fórceps, use uma tesoura para fazer uma pele abdominal e incisão peritoneal lateralmente e anteriormente até o diafragma para expor o chifre uterino. Agarrando o útero, corte o tecido livre e puxe o chifre uterino. Coloque a sequência de embriões em PBS estéreis gelados sob um microscópio estéreo, e retire o músculo uterino, saco de gema e cobertura de amnion de cada embrião.Como cada embrião é isolado, use uma colher perfurada para transferir os tecidos para uma nova placa de Petri contendo PBS estéril no gelo. Para colher o tecido cardíaco embrionário, transfira o primeiro embrião a ser dissecado em uma nova placa de Petri sob o microscópio, e coloque o embrião no lado ventral para cima. Use fórceps finos para fazer uma pequena incisão no peito, ligeiramente acima do diafragma, e insira os fórceps fechados na incisão para ampliar a incisão.Usando os fórceps para manter a parede torácica aberta para expor o coração e os pulmões, use um segundo par de fórceps para mover suavemente o coração anteriormente 90 graus para expor a aorta dorsal e a veia. Em seguida, agarrando esses vasos na base do coração, puxe cuidadosamente o coração e os pulmões anteriormente e enxágue os tecidos com PBS frio. Quando todo o tecido cardíaco tiver sido colhido, coloque as amostras do coração sob o microscópio e remova os lóbulos pulmonares de cada coração.Oriente o primeiro coração em seu lado dorsal, e segurando o coração em sua base, use fórceps finos para raspar a ária esquerda e direita no tecido adjacente ao redor do SV do coração. Para isolar o SV, oriente o lado dorsal do coração para cima. Remova cuidadosamente o SV do coração e use uma pipeta de transferência estéril para colocar o tecido isolado em uma nova placa de Petri de seis centímetros contendo PBS estéril gelado no gelo.Para isolar todos os ventrículos, remova o trato de saída e use uma nova pipeta de transferência estéril para colocar os ventrículos em uma placa de Petri separada de seis centímetros contendo PBS estéril gelado no gelo. Para configurar culturas de SV e ventrículos inteiros, primeiro cubra as membranas de um poro de oito micrômetros de cultura PET inseridas por poço de uma placa de cultura de 24 poços, com 100 microliters de matriz extracelular recém-diluída por cultura por pelo menos 30 minutos a 37 graus Celsius. Quando a matriz se solidificar, use uma pipeta de transferência para transferir uma explanta em cada inserção e mova a placa sob o microscópio.Usando fórceps limpos, posicione as explanações no centro de cada inserção para garantir que elas não estejam presas às paredes laterais e remova cuidadosamente qualquer PBS extra. Em seguida, transfira a placa com a tampa fechada sob uma capa de cultura de tecido de fluxo laminar, e adicione 100 microliters de meio completo pré-aquecido para cada inserção, e 200 microliters para o poço abaixo de cada inserção. Em seguida, adicione 300 microliters de PBS a quaisquer poços nãousados, e coloque a placa na incubadora de cultura celular por cinco dias.Para o tratamento VEGF-A no segundo dia de cultura, remova o meio de ambas as câmaras de cada cultura e adicione 100 microliters de PBS a cada inserção, e 200 microliters de PBS a cada poço. Depois de rodar a placa algumas vezes, substitua o PBS por 300 microliters de meio basal suplementado com soro bovino 1% fetal para iniciar as culturas, e devolva a placa à incubadora. No terceiro dia após a fome, adicione 300 microliters de meio basal fresco mais soro aos poços de controle e meio basal mais 50 nanogramas por mililitro de VEGF-A aos poços de tratamento, e devolva a placa à incubadora de cultura celular.No sexto dia de cultura, lave as câmaras com PBS como demonstrado, e fixe as culturas com 200 microliters de 4%paraformaldeído em cada poço, e 100 microliters de fixação em cada inserção. Depois de 20 minutos a 4 graus Celsius com balanço, lave as culturas com 300 microliters de PBS por 10 minutos por lavagem com balanço em temperatura ambiente. Após a última lavagem, adicione 300 microliters de solução de anticorpos primários aos poços e inserções para uma cultura noturna a quatro graus Celsius com balanço.Na manhã seguinte, lave as culturas 10 vezes em surfactante não iônico na PBS com balanço, mudando a solução de lavagem a cada 10 minutos antes de rotular as culturas com 300 microliters de um anticorpo secundário fluoróvo apropriado conjugado a quatro graus Celsius durante a noite com balanço. No dia seguinte, lave as culturas 10 vezes em PBS fresco com surfactante não iônico como demonstrado. Após a última lavagem, use fórceps finos para descascar cuidadosamente a membrana de cada inserção e colocar as membranas em lâminas individuais de microscópio de vidro, explanta lateral para cima.Cubra as amostras com meio de montagem suplementado da DAPI em um deslizamento de cobertura e sele as bordas dos deslizamentos da tampa com esmalte claro. Quando o esmalte secar, imagem os slides por microscopia confocal. À medida que as células SV iniciais crescem no ventrículo cardíaco, elas param de produzir marcadores venosos como o Coup-TF2.Após cinco dias de cultura, as células endoteliais SV brotam e migram para a membrana. Como no coração embrionário, a expressão Coup-TF2 é reduzida à medida que os vasos migram para longe do SV. Culturas estimuladas com VEGF-A exibem um crescimento crescente de brotos angiogênicos tanto em densidade quanto em comprimento. Outras culturas de SV estimuladas pelo VEGF-A demonstram um aumento de quase três vezes no comprimento do broto em comparação com os controles, sugerindo que os brotos endoteliais de SV e endocardium respondem ao VEGF-A.É importante não perder o tecido SV enquanto puxa o coração e os pulmões, removendo a atria e limpando o tecido adjacente ao redor do SV. Experimentos de imagem ao vivo podem ser realizados para visualizar a angiogênese coronária e capturar os detalhes da dinâmica celular e molecular durante o processo. Esta técnica é extremamente útil para avaliar potenciais mecanismos moleculares da angiogênese coronária e como um sistema modelo para estudar angiogênese em geral.

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este vídeo demonstra o protocolo de um ensaio in vitro angiogênese que recapitula vários estágios de angiogênese. Lapso de tempo imagens de germinação, formação de lúmen, ramificação e anastomose - características-chave da angiogênese - são mostrados.

Otimizado de fibrina Gel Assay Bead para o Estudo da angiogênese

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Ensaio de germinação de grânulos para avaliação da angiogênese em estágio inicial: um modelo in vitro baseado em grânulos para estudar o brotamento endotelial na presença de pericitos

A retina de murino neonatal fornece um modelo fisiológico bem caracterizado da angiogénese, que permite investigações dos papéis dos diferentes genes ou drogas que modulam a angiogénese...

Whole Mount coloração de imunofluorescência do Rato Retina Neonatal para investigar angiogênese<em&gt; In vivo</em

O protocolo descreve o ensaio de microbolsa corneal conforme desenvolvido em ratinhos.

A córnea microbolsa Ensaio: Um modelo de angiogênese no mouse Eye

Descrevemos uma abordagem microcirúrgico para a geração de um circuito arteriovenoso (AV) como um modelo para analisar a vascularização in vivo num ambiente isolado e bem caracterizado. Este modelo não só é útil para a investigação de angiogênese, mas também é perfeitamente adaptado para a engenharia axial vascularizado e tecidos transplantáveis.

The Loop arteriovenosa (AV) em um modelo animal pequeno para estudar angiogénese e Engenharia de tecido vascularizado

Aqui, apresentamos uma aplicação nova do ensaio do anel aórtico onde prelabelled as células mesenquimais são co cultivadas com redes endotelial derivado de aorta de ratos. Este novo método permite a visualização de células estromais mesenquimais (MSCs) homing e integração com redes endoteliais, quantificação das propriedades de rede e avaliação de expressão de gene e immunophenotypes MSC.

O ensaio de co-cultura anel aórtico: Uma ferramenta conveniente para avaliar o potencial angiogênico das células estromais mesenquimais em Vitro

Este apresenta protocolo um grânulo de romance em vitro ensaio que mais apropriadamente modela o processo na vivo brotando angiogênese incorporando pericitos. Esta modificação permite que o ensaio de grânulo mais fielmente recapitular as interações heterotypic celulares entre células endoteliais e células murais que são críticas para a angiogênese.

Incorporando um grânulo de célula endotelial brotando ensaio pericitos

Este ensaio utiliza células-tronco embrionárias de camundongos diferenciadas em corpos embrionários cultivadas em gel de colágeno 3D para analisar os processos biológicos que controlam a angiogênese brotada in vitro. A técnica pode ser aplicada para testar drogas, modelar doenças e estudar genes específicos no contexto de deleções embrionariamente letais.

In vitro Ensaio Tridimensional de Angiogênese Utilizando Células-Tronco Embrionárias de Camundongos para Modelagem de Doenças Vasculares e Testes de Fármacos

O método aqui apresentado pode avaliar o efeito dos reagentes na angiogênese ou permeabilidade vascular in vivo sem coloração. O método utiliza injeção de dextran-FITC através da veia caudal para visualizar neovasos ou extravasamento vascular.

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A angiogênese germinativa, fundamental para o desenvolvimento e a doença, envolve processos moleculares e mecânicos complexos. Apresentamos um modelo ex vivo 2.5D versátil que analisa o brotamento celular das artérias carótidas suínas, revelando a angiogênese dependente da rigidez e a mecânica celular líder-seguidora distinta. Este modelo auxilia no avanço de estratégias de engenharia de tecidos e abordagens de terapia do câncer.

Modelo 2.5D para caracterização mecânica ex vivo da angiogênese germinada em tecido vivo

Aprenda a desenvolver um modelo in vitro de angiogênese coronariana usando culturas de explantes de seio venoso e endocárdio de embriões de camundongo. Este método permite investigar os mecanismos moleculares da formação de vasos sanguíneos cardíacos e as respostas celulares ao VEGF-A em condições controladas.

Modelo In Vitro de Angiogênese Coronariana

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