NF-κB-dependente Luciferase Ativação e Quantificação da Expressão Gênica em Salmonella Células Cultura dos Tecidos Infectados
12 de janeiro de 2020
Aqui, apresentamos um protocolo para medir rapidamente e facilmente o fator nuclear kappa-light-chain-enhancer de células B ativadas (NF-κB) ativação em linhas celulares expressando NF-κB::luciferase repórter constrói, através de medições de luminescência no lysate celular. Além disso, a expressão gênica é determinada via RT-qPCR isolada de células infectadas com Salmonella Typhimurium.
Este protocolo é útil para determinar mudanças na ativação NF-kappa-B em células expressando um repórter de luciferase NF-kappa-B. A principal vantagem desta técnica é que permite uma tela de alto rendimento de fatores ou condições que levam a mudanças na ativação NF-kappa-B. NF-kappa-B é um fator de transcrição para uma grande variedade de processos celulares.
Uma função bem conhecida de NF-kappa-B está na indução de respostas inflamatórias induzindo a expressão de várias citocinas e quimiocinas. Nosso laboratório está particularmente interessado na indução de NF-kappa-B induzida pelo patógeno Salmonella typhimurium. Aqui, usamos a linha de células HeLa que é stably transfectada com um repórter de luciferase NF-kappa-B plasmid.
Outras bactérias, ou mesmo vírus ou compostos químicos, podem ser usadas nesta linha celular para estudar a ativação do NF-kappa-B. Outras linhas de celular também podem ser usadas se você puder introduzir tal NF-kappa-B repórter de luciferase plasmid nessa linha celular. Alguém fazendo isso pela primeira vez pode ter problemas utilizando corretamente a técnica estéril que é necessária para a cultura celular e o trabalho bacteriano.
Um dia antes da estimulação celular, remova a mídia de crescimento das células HeLa 57A que foram cultivadas para cerca de 75% de confluência. Lave as células com um mililitro de 0,05% de trippsina EDTA. Substitua por outro mililitro de trippsina EDTA e transfira o frasco para uma incubadora de 37 graus Celsius por cinco minutos.
Depois que as células foram separadas do frasco, suspenda-as em 10 mililitros de mídia de crescimento. Combine 10 microliters de suspensão celular com 10 microliters de azul Trypan, pipeta para cima e para baixo para misturar, e transfira 10 microliters para um slide de contador celular. Conte células em suspensão usando um contador celular, e use mídia de crescimento para diluir as células a uma concentração final de 2,5 vezes 10 para as cinco células por mililitro em um tubo cônico de 50 mililitros.
Transfira 250 microliters da suspensão celular para cada poço de uma placa de 48 poços. Tampe e vire periodicamente o tubo cônico para garantir uma suspensão celular homogênea. Toque suavemente na placa ao lado para garantir que as células distribuam uniformemente nos poços.
Transfira a placa para 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% e permita que as células se conectem e cresçam durante a noite. Estrias congeladas de Salmonella em placas de ágar LB para produzir colônias únicas. Transfira as placas para uma incubadora a 37 graus Celsius e permita o crescimento durante a noite.
No dia seguinte, adicione três mililitros de LB aos tubos de cultura bacteriana estéreis, e adicione antibióticos apropriados à mídia. Usando um laço de inoculação estéril, escolha uma única colônia das culturas bacterianas listradas e toque o laço para a mídia LB. Tampe os tubos após a inoculação e descarte o laço.
Coloque os tubos em uma incubadora de agitação a 37 graus Celsius e 180 RPM, depois permita que as bactérias cresçam durante a noite. Pela manhã, recupere culturas bacterianas durante a noite da incubadora. Prepare tubos para subcultura adicionando três mililitros de LB frescos e antibióticos.
Transfira 30 microliters da cultura bacteriana da noite para o dia para a mídia recém-preparada. Coloque os tubos em uma incubadora de agitação a 37 graus Celsius por três horas. Após a incubação de três horas, transfira um mililitro de caldo LB estéril em uma cuvette de plástico para servir como o branco.
Transfira 900 microliters de LB para as outras cuvetas a serem utilizadas para a análise da amostra. Transfira 100 microliters de subcultura bacteriana para uma cuvette contendo 900 microliters de LB, e pipeta para cima e para baixo várias vezes para misturar. Repita isso para cada suspensão bacteriana.
Ligue o espectótmetro para medir a densidade óptica das culturas bacterianas em um comprimento de onda de 600 nanômetros. Coloque o branco no espectrômetro. Tome nota da orientação.
Feche a tampa e pressione o botão em branco no espectrômetro para obter a absorção de fundo. Substitua o cuvette em branco por uma colher de sopa na mesma orientação e pressione a leitura. Registo os valores OD600 dessas amostras.
Multiplique o valor por 10 para explicar o fator de diluição. Diluir a suspensão de 1 a 10 em uma cuvette e medir a absorvância, o que deve dar um valor de aproximadamente 0,1 que corresponde aproximadamente 1 vez 10 a nove UFC por mililitro. Em um novo tubo, adicione um volume apropriado da subcultura diluída à LB fresca para obter uma suspensão de uma vez 10 para a oito UFC por mililitro para ser usado como um inóculo.
Prepare diluições seriais do inóculo transferindo 50 microlitadores de suspensão bacteriana para um tubo contendo 450 microliters de PBS estéril até que uma diluição final de aproximadamente 100 UFC por mililitro seja feita. Transfira 100 microlitadores das duas diluições mais baixas, 100 e 1000 UFC por mililitro, para duas placas de ágar LB, e espalhe a suspensão com um espalhador de células para obter colônias únicas. Transfira essas placas para uma incubadora Celsius de 37 graus e incubar durante a noite.
No dia seguinte, conte as colônias e calcule a concentração bacteriana do inóculo inicial para determinar a concentração real do ânculo. No mesmo dia, rotule a tampa da placa de acordo com as condições de infecção que serão utilizadas para cada poço, com cada condição sendo feita em triplicado. Adicione 10 microlitadores do inóculo aos poços apropriados e adicione 10 microliters de LB estéreis a poços de controle não infectados.
Para sincronizar o tempo da infecção, coloque a placa em uma centrífuga de mesa e gire a 500 vezes G por cinco minutos, garantindo que a placa seja contrabalanceada. Em seguida, transfira as células infectadas para uma incubadora de dióxido de carbono de 5% a 37 graus Celsius por uma hora. Coloque um tubo cônico de 15 mililitros contendo uma alíquota de mídia de cultura celular em um banho de água de 37 graus Celsius para uso na próxima etapa.
Uma hora após o momento da infecção, remova o tubo cônico de 15 mililitros contendo mídia de cultura celular do banho de água e limpe o exterior com 70% de etanol. Transfira as placas de cultura tecidual da incubadora para um armário de biossegurança. Use dicas estéreis para aspirar mídia dos poços e substituir por 250 microliters de mídia fresca e quente da cultura celular.
Devolva as placas à incubadora de dióxido de carbono de 5% a 37 graus Celsius por mais quatro horas. Depois disso, remova as placas da incubadora de dióxido de carbono e aspire a mídia dos poços. Para análise da luciferase, adicione 100 microliters de tampão de lise celular 1X aos poços.
Transfira a placa para um freezer negativo de 80 graus Celsius e incubar por pelo menos 30 minutos para garantir uma lise celular eficiente. Em seguida, coloque a placa contendo lise celular congelada em um banco para descongelar e prepare reagentes de substrato de luciferase de acordo com as recomendações do fabricante. Permita que os reagentes do substrato da luciferase se equilibrem à temperatura ambiente.
Em seguida, ligue o leitor de placas e abra o programa de leitor correspondente. Defina a máquina para medir a luminescência. Transfira 10 microliters de cada célula lysate para um poço de uma placa opaca de 96 poços.
Usando uma pipeta multicanal, adicione 50 microliters do reagente de ensaio de luciferase a cada poço da placa opaca. Bata suavemente a placa na lateral para misturar poços e certifique-se de que a superfície inferior esteja coberta com líquido. Coloque a placa em um leitor de placas e inicie a leitura.
Copie os valores de luminescência em um programa de planilha e plote os resultados. Este protocolo se concentra na ativação do fator de transcrição NF-kappa-B usando um repórter de luciferase dependente de NF-kappa-B que é stably transfectado em uma linha de células HeLa. Esta figura mostra um experimento representativo da ativação da luciferase dependente NF-kappa-B e da expressão genética IL6 em células HeLA 57A infectadas com as cepas de typhimurium salmonella.
A infecção com a cepa SL1344 tipo selvagem induziu um forte sinal de luciferase tanto na expressão RLU quanto no IL6, que foi diminuída em células infectadas com o sipA sopB sopE2 mutante triplo e reduzida aos níveis de controle com o sipA sopB sopE2 sopE mutante quádruplo. Preste muita atenção ao fazer suas diluições e revestimentos em série. Isso garantirá que você tenha um inóculo consistente em suas cepas.
Após identificar fatores que contribuem para a ativação da NF-kappa-B e mudanças a jusante na expressão do mRNA, a técnica de mancha ocidental pode ser usada para identificar mudanças na expressão proteica. Este protocolo permitiu que nosso laboratório não só avaliasse a ativação NF-kappa-B induzida por Salmonella, mas outros compostos e proteínas implicados na ativação de NF-kappa-B. Salmonella typhimurium é um patógeno humano.
Empregue EPI adequado ao trabalhar com essas bactérias.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este protocolo permite a avaliação rápida da ativação de NF-魏B em linhagens celulares usando um repórter NF-魏B::luciferase. Também inclui análise de expressão gênica via RT-qPCR em células infectadas com Salmonella Typhimurium.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Imunologia
- Microbiologia
Fundamentos
- NF-魏B é um fator de transcrição crucial envolvido em vários processos celulares.
- Ele desempenha um papel significativo em respostas inflamatórias, regulando a expressão de citocinas e quimiocinas.
- Este estudo se concentra na ativação de NF-魏B induzida por Salmonella Typhimurium.
- A linhagem celular HeLa é utilizada para esta pesquisa devido à sua transfecção estável com um repórter NF-魏B luciferase.
Objetivo do Estudo
- Medir a ativação de NF-魏B em resposta a diferentes estímulos.
- Explorar os efeitos de Salmonella Typhimurium na sinalização de NF-魏B.
- Facilitar a triagem de alto rendimento de fatores que influenciam a ativação de NF-魏B.
Métodos Utilizados
- Medição de luminescência em lisados celulares para avaliar a ativação de NF-魏B.
- RT-qPCR para análise de expressão gênica em células infectadas.
- Uso de células HeLa que expressam de forma estável construtos repórteres NF-魏B::luciferase.
- Técnicas de triagem de alto rendimento para avaliar várias condições.
Principais Resultados
- Medição bem-sucedida dos níveis de ativação de NF-魏B em resposta à infecção por Salmonella.
- Identificação de fatores-chave que modulam as vias de sinalização de NF-魏B.
- Demonstrou a eficácia do sistema repórter luciferase para ensaios de alto rendimento.
- Forneceu insights sobre o papel de NF-魏B nas respostas inflamatórias.
Conclusões
- O protocolo oferece um método confiável para estudar a ativação de NF-魏B.
- Pode ser aplicado a vários contextos de pesquisa envolvendo inflamação e infecção.
- Esta abordagem melhora nossa compreensão do papel de NF-魏B nas respostas celulares a patógenos.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-throughput assessment of NF-κB activation in response to infectious agents, supporting target validation in inflammatory disease pathways. By linking pathogen-induced signaling to luciferase reporter output, it provides a quantitative, reproducible readout for de-risking mechanistic hypotheses early in discovery. The approach supports predictive confidence in target engagement and pathway modulation, particularly for anti-infective and immunomodulatory programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of NF-κB as a central node in inflammatory signaling cascades triggered by pathogen-associated molecular patterns.
- Operational Value: Provides a stable, luciferase-based reporter system for consistent, quantitative measurement of transcription factor activation across experimental conditions.
- Predictive Value: Supports functional validation of targets upstream or downstream of NF-κB by correlating pathogen strain genetics with signal output.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates dose-responsive luminescence signals that reflect NF-κB nuclear translocation and transcriptional activity, enabling compound or strain screening.
- Operational Value: Compatible with 96-well plate formats and standard luminometers, facilitating medium-to-high throughput screening of chemical libraries or microbial mutants.
- Assay Readiness: Produces a linear, luminescent readout that correlates with target gene expression, supporting assay standardization and inter-lab reproducibility.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Measures NF-κB-dependent gene expression (e.g., IL-6) via RT-qPCR, aligning reporter output with endogenous biomarker induction in relevant infection models.
- Mechanistic De-risking: Allows discrimination between bacterial virulence factors (e.g., SopE, SipA) that modulate NF-κB, informing target selection for immunomodulatory interventions.
- Disease Relevance: Models host-pathogen interactions that drive inflammatory responses, applicable to sepsis, gastroenteritis, and mucosal immunity programs.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, where pathway activation is assessed prior to lead identification, enabling prioritization of targets based on functional relevance in immune activation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of kinase inhibitors, adaptor proteins, or ubiquitin ligases that regulate IκB degradation and NF-κB nuclear translocation.
- Screening: Enables evaluation of compound libraries or pathogen mutants for modulatory effects on NF-κB activity in a controlled cellular context.
- Analytics: Delivers quantitative luminescence and mRNA expression data that allow normalization, statistical comparison, and EC50/IC50 estimation.
- Translational Research: Connects reporter activation to endogenous cytokine expression, supporting biomarker-aligned target validation.
- Enterprise Reuse: The HeLa-NF-κB-luciferase platform can be reused across projects involving TLR signaling, inflammasome activation, or cytokine storm models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct, real-time readout of transcription factor activation state.
- Operational Value: Standardizes NF-κB measurement across teams using a genetically encoded reporter, minimizing variability from antibody-based assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking target modulation to functional pathway output in a pathogen-relevant context.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immunomodulatory candidates based on their ability to attenuate pathogen-induced NF-κB signaling.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture, bacterial pathogenesis, and biosafety level 2 practices for Salmonella handling.
- Dependent on luminometer access and compatible plate reader software for luminescence acquisition and data export.
- Necessitates standardization of MOI, infection timing, and lysis procedures to ensure reproducible signal across experiments.
- Adaptation to primary immune cells or alternative cell lines requires successful transfection or transduction of the NF-κB-luciferase reporter construct.
- Signal interpretation must account for potential cytotoxicity or non-specific luciferase induction, necessitating parallel viability controls.
