Name: Produção de plataforma de entrega de vacinas de vacinação de infravermelho próximo e infravermelho (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Aprenda a fabricar polibolhas com PLGA e PCL para entrega de vacinas com liberação controlada por laser infravermelho próximo. Esta plataforma melhora a estabilidade do produto e a acessibilidade em regiões com recursos limitados.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gostaríamos de agradecer ao Dr. Bryan E. Tomlin afiliado ao laboratório de análise elementar dentro do departamento de química da TAMU que ajudou na análise de ativação de nêutrons (NAA).

1. Síntese de triacrilato de policalicona (PCLTA)
<ol><li>Seque 3,2 mL de 400 Do polycaprolacyone (PCL) triol durante a noite a 50 °C em um frasco traseiro redondo aberto de 200 mL e K2CO3 em um frasco de vidro a 90 °C.</li>
	<li>Misture o triol com 6,4 mL de diclorometano (DCM) e 4,246 g de carbonato de potássio (K2CO3) sob argônio.</li>
	<li>Misture 2,72 mL de cloreto de acriloyl em 27,2 mL de DCM e adicione dropwise à mistura de reação no frasco acima de 5 min.</li>
	<li>Cubra a mistura de reação com papel alumínio e deixe-a intacta à temperatura ambiente por 24 h sob argônio.</li>
	<li>Após 24 horas, filtre a mistura de reação usando um papel filtro em um funil Buchner sob vácuo para descartar o excesso de reagentes.</li>
	<li>Filtragem precipitada a partir da etapa 1.5 que contém o polímero endcapped em éter dietil em um 1:3 (vol/vol) e rotovape a 30 °C para remover o éter dietil.</li>
</ol>2. Formação do polibole
NOTA: Injetar polímero na água desionizada (DI) faria com que os polibolhas migrassem para o fundo do frasco, resultando em fundo achatado. Use 10% (wt/vol) celulose carboximetil (CMC) encha o frasco de vidro para evitar o achatamento do polibole.
<ol><li>Prepare a solução CMC de 10% (wt/vol) em água DI.</li>
	<li>Encha um frasco de vidro de 0,92 mL com 0,8 mL de 10% CMC usando uma tubulação de transferência de 1 mL.</li>
	<li>Misture 1000 mg/mL de 14 kDa PCL em DCM e sintetize PCLTA em um 1:3 (vol/vol) para um volume total de 200 μL ou prepare 200 μL de 1000 mg/mL de 5 kDa poly (ácido lactico-coglicólico) dialílate (PLGADA) em clorofórmio.</li>
	<li>Misture a mistura 2-hidroxi-4′-(2-hidroxietoxi)-2-metilpropiofenona (fotoinitiador) com a mistura de polímero (PLGADA ou PCL/PCLTA) em 0,005:1 (vol/vol).</li>
	<li>Carregue 200 μL de mistura de polímero em uma seringa de vidro de 1 mL montada em uma bomba de seringa que está conectada a um tubo de aço inoxidável de distribuição com um diâmetro interno de 0,016 polegadas.</li>
	<li>Use um micromotor para controlar o movimento dianteiro e para trás do tubo de polímero para injetar polímero no frasco de 10% CMC no frasco de vidro para formar o polibole.</li>
	<li>Cure os polibolhas sob ultravioleta (UV) a 254 nm de comprimento de onda para 60 s a 2 W/cm2.</li>
	<li>O flash congele as polibolhas em nitrogênio líquido e liofilize durante a noite a vácuo de 0,010 mBar e a -85 °C.</li>
	<li>Separe os polibolhas do CMC seco usando fórceps e lave as polibolhas com água DI para remover qualquer CMC residual. Observe que outros polímeros podem ser usados provavelmente com modificações para alterar a cinética de liberação.</li>
</ol>3. Modulação do diâmetro do polibole
<ol><li>Encha um frasco de vidro de 0,92 mL com 10% cmc usando uma tubulação de transferência de 1 mL.</li>
	<li>Misture PCL/PCLTA em um 1:3 (vol/vol) com 1000mg/mL 14kDa PCL e sintetize PCLTA. Misture o fotoinitiador com a mistura de polímero em 0,005:1 (vol/vol).</li>
	<li>Carregue a mistura de polímero em uma seringa de vidro de 1 mL montada em uma bomba de seringa que está conectada a um tubo de aço inoxidável de distribuição com um diâmetro interno de 0,016 polegadas.</li>
	<li>Use um micromotor para controlar o movimento dianteiro e para trás do tubo de polímero para injetar polímero no frasco de 10% CMC no frasco de vidro para formar o polibole.</li>
	<li>Para obter polibolhas com vários diâmetros, variando a taxa de distribuição de 0,0005 a 1 μL/s.</li>
	<li>Tire imagens do frasco com os polibolhas com diâmetro variado.</li>
	<li>Use ImageJ para quantificar o diâmetro dos polibolhas e usar o tamanho do frasco como escala.</li>
</ol>4. Centralizando a carga dentro do polibole
<ol><li>
Modulação da viscosidade PCL/PCLTA utilizando K2CO3: NOTA: A viscosidade do PLGADA não precisa ser modificada usando K2CO3 porque a viscosidade de 5 kDa PLAGDA a 1000 mg/mL é suficiente para centralizar a carga.<ol>
<li>Adicione K2CO3 (que foi isolado após a reação do PCLTA) à PCLTA em concentrações variadas, incluindo 0 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL, 40 mg/mL e 60 mg/mL.</li>
		<li>Meça as viscosidades dinâmicas das soluções alterando a taxa de corte de 0 para 1000 1/s usando reometria.</li>
		<li>Injete manualmente a carga no meio (consulte a etapa 4.2 para preparar a mistura de carga) dos poliboles que foram formados utilizando as soluções PCL/PCLTA com diferentes concentrações de K2CO3 (etapa 4.1.1). Determine a concentração ideal de K2CO3 observando qual solução da etapa 4.1.1 pode resultar na retenção da carga no meio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Centralizar a carga (já demonstrada viabilidade com pequenas moléculas) com CMC
	<ol>
<li>Misture a carga com 5% (wt/vol) CMC em um rotador durante a noite para aumentar a viscosidade da carga.</li>
		<li>Injete manualmente 2 μL de mistura de carga no polibole e proceda com a cura uv a 254 nm comprimento de onda para 60 s a 2 W/cm2.</li>
		<li>O flash congele as polibolhas em nitrogênio líquido para 30 s e liofilize durante a noite a vácuo de 0,010 mBar e a -85 °C.</li>
		<li>Separe os polibolhas do CMC seco usando fórceps e lave com água DI para remover qualquer CMC residual.</li>
		<li>Corte o polibole ao meio e imagem as metades usando microscopia confocal para garantir que a carga esteja centrada (consulte a etapa 6 para excitação e comprimentos de onda de emissão utilizados).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Formulação de Carga
NOTA: A formulação de polibolhas pode abrigar vários tipos de carga, incluindo pequenas moléculas, proteínas e ácidos nucleicos.
<ol><li>Com base em estudos anteriores, no caso da carga proteica, utilizam excipientes incluindo polietileno glicol (PEG)6, polivinylpyrrolidone (PVP) e glycopolímeros6 para melhorar a estabilidade da proteína durante a formulação de poliboco.</li>
	<li>Formar polibolhas com base no protocolo na etapa 2.</li>
	<li>Prepare a solução de antígeno adicionando 17,11 g de trehalose a 625 μL de antígeno HIV gp120/41.</li>
	<li>Injete manualmente 1 μL de solução de antígeno no meio da polibole.</li>
	<li>Abra os polibolhas nos dias 0, 7, 14 e 21, e regise a fluorescência do antígeno com comprimentos de onda de excitação e emissão de 497 nm e 520 nm, respectivamente.</li>
	<li>Determine a funcionalidade do antígeno usando o ensaio imunosorbente ligado à enzima (ELISA) e use 5% de leite sem gordura como tampão de bloqueio.</li>
</ol>6. Liberação de carga
NOTA: Molécula pequena ou antígeno pode ser usado como o tipo de carga
<ol><li>
Molécula pequena
	<ol>
<li>Incubar polibolhas com acriflavina centrada em 400 μL de soro fisiológico tampão fosfato (PBS) a 37 °C, 50 °C para poliboles PLGADA e a 37 °C, 50 °C, 70 °C para polibobbles PCL/PCLTA. NOTA: A razão pela qual recomendamos testar acima das temperaturas do corpo é a) simular a temperatura (50 °C) na qual o polibole atinge ao laser os nanorods de ouro (AuNRs) dentro de PCL e PLGA; e b) acelerar o processo de degradação da PCL (50 °C, 70 °C).</li>
		<li>Em cada ponto de tempo, colete os supernantes e substitua por 400 μL de PBS fresco.</li>
		<li>Use um leitor de placas para quantificar as intensidades de fluorescência nos supernantes coletados. NOTA: Use ex/em de 416 nm/514 nm para acriflavina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Antígeno
	<ol>
<li>Incubar polibolhas com soro de albumina bovina centrado (BSA)-488 em 400 μL de PBS a 37 °C, 50 °C para poliboles PLGADA e a 37 °C, 50 °C para poliboles PCL/PCLTA.</li>
		<li>Em cada ponto de tempo, colete os supernantes e substitua por PBS fresco de 400 μL.</li>
		<li>Use um leitor de placas para quantificar as intensidades de fluorescência nos supernantes coletados. Use ex/em de 497 nm/520 nm para BSA-488. NOTA: O estudo de liberação a 70 °C para polibolhas PCL/PCLTA não deve ser realizado para evitar expor o antígeno a temperatura extrema.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Toxicidade
<ol><li>
Quantificando o teor de cloro em polibolhas usando a análise de ativação de nêutrons (NAA)
	<ol>
<li>Use polibolhas que foram liofilizadas para 2, 4, 6, 20 e 24 h para este estudo a vácuo de 0,010 mBar e a -85 °C.</li>
		<li>Meça 5-9 mg de polibolhas e coloque-as em frascos de irradiação LDPE.</li>
		<li>Prepare 1000 g/mL de solução de calibração de cloro do Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (NIST) solução de calibração rastreável.</li>
		<li>Use 1-megawatts reator Triga para realizar irradiações de nêutrons em cada amostra a uma taxa de fluência de nêutrons de 9,1 × 1012 /cm2·s para 600 s.</li>
		<li>Transfira os polibolhas para frascos unirradiados.</li>
		<li>Use o detector HPGe para obter espectros de raios gama para 500 s após intervalos de decomposição de 360 s.</li>
		<li>Use o software NAA pelas Indústrias Canberra para analisar os dados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Quantificando o teor de cloro liberado de polibolhas usando NAA
	<ol>
<li>Incubar polibolhas que foram liofilizadas durante a noite (a 0,010 mBar vácuo e a -85 °C) em 400 μL de PBS a 37 °C.</li>
		<li>Colete os supernantes nas semanas 1, 2 e 3 após a incubação.</li>
		<li>Analise os supernantes para teor de cloro usando NAA usando o mesmo método descrito acima na etapa 7.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Síntese AuNR por Kittler, S., et al.8
<ol><li>Prepare a solução de sementes AuNR misturando 250 μL de ácido cloroaurico de 10 mM (HAuCl4), 7,5 mL de brometo de cetrimonium de 100 mM (CTAB) e 600 μL de boroidido de sódio frio de 10 mM (NaBH4).</li>
	<li>Prepare a solução de crescimento misturando 40 mL de 100 mM CTAB, 1,7 mL de 10 mM HAuCl4, 250 μL de nitrato de prata (AgNO3),e 270 μL de ácido ascórbico de 17,6 mg/mL a um tubo.</li>
	<li>Misture vigorosamente 420 μL de solução de sementes com a solução de crescimento a 1200 rpm por 1 min. Em seguida, deixe a mistura imperturbável para reagir por 16 h.</li>
	<li>Remova o excesso de reagentes da mistura centrifugando a 8000 × g por 10 min e descarte o supernasce.</li>
</ol>9. Hidroofobização de AuNRs por Soliman, M.G., et al.9
<ol><li>Ajuste o pH de 1,5 mL de AuNRs estabilizados ctab sintetizados para 10 usando hidróxido de sódio de 1 mM (NaOH).</li>
	<li>Mexa a solução com 0,1 mL de 0,3 mM de tido PEG metilado (mPEG) a 400 rpm durante a noite.</li>
	<li>Misture AuNRs LCslilated com 0,4 M de dodecylamina (DDA) em clorofórmio a 500 rpm por 4 dias.</li>
	<li>Encanar a camada orgânica superior contendo AuNRs hidrofóbicas e armazenar a 4 °C até o uso futuro.</li>
</ol>10. Ativação nir de polibolhas
<ol><li>Misture a solução de polímero (PLGADA ou PCL/PCLTA) com AuNRs hidrofóbicas em um 1:9 (vol/vol).</li>
	<li>Adicione fotoinitiador à mistura polímero-AuNR em um 0,005:1 (vol/vol).</li>
	<li>Formar polibolhas injetando a mistura polímero-AuNR em um frasco de vidro de 0,92 mL com 10% CMC (wt/vol) (consulte o passo 2).</li>
	<li>Cure os polibolhas a 254 nm de comprimento de onda para 60 s a 2 W/cm2.</li>
	<li>O flash congele em nitrogênio líquido para 30 s e liofilize durante a noite a 0,010 mBar vácuo e a -85 °C.</li>
	<li>Separe os polibolhas secas usando fórceps e lave com água DI para remover qualquer CMC residual.</li>
	<li>Incubar as polibolhas em 400 μL de PBS a 37 °C.</li>
	<li>Ative as polibolhas usando laser NIR de 801 nm a 8A por 5 minutos todas as segundas, quartas e sextas-feiras.</li>
	<li>Pegue imagens infravermelhas prospectivas (FLIR) do polibole antes e depois da ativação do laser para obter valores de temperatura.</li>
	<li>Calcule as diferenças de temperatura entre antes e depois da ativação do laser com base nos valores de temperatura das imagens FLIR.</li>
</ol>

<ol><li>World Health Organization. Global Immunization: Worldwide Disease Incidence. , Children's Hospital of Philadelphia. https://www.chop.edu/centers-programs/vaccine-education-center/global-immunization/diseases-and-vaccines-world-view (2018).</li>
<li>Paul, A., Bera, M., Gupta, P., Singh, N. D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((o-Hydroxycinnamate+for+sequential+photouncaging+of+two+different+functional+groups+and+its+application+in+releasing+cosmeceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+and+Biomolecular+Chemistry%22%5BJournal%5D)">o-Hydroxycinnamate for sequential photouncaging of two different functional groups and its application in releasing cosmeceuticals.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 17 (33), 7689-7693 (2019).</li>
<li>Kumari, A., Yadav, S. K., Yadav, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+polymeric+nanoparticles+based+drug+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Biodegradable polymeric nanoparticles based drug delivery systems.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 75 (1), 1-18 (2010).</li>
<li>Dai, C., Wang, B., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microencapsulation+peptide+and+protein+drugs+delivery+system%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Microencapsulation peptide and protein drugs delivery system.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 41 (2-3), 117-120 (2005).</li>
<li>Souery, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+and+quantifying+the+stability+of+amino+acid-based+cargo+within+polymeric+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Controlling and quantifying the stability of amino acid-based cargo within polymeric delivery systems.</a> Journal of Control Release. 300, 102-113 (2019).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+protein+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Advanced protein formulations.</a> Protein Science. 24 (7), 1031-1039 (2015).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultraviolet-curable%2C+core-shell+vaccine+formed+via+phase+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">An ultraviolet-curable, core-shell vaccine formed via phase separation.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. , (2019).</li>
<li>Kittler, S., Hickey, S. G., Wolff, T., Eychmüller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+and+Fast+Phase+Transfer+of+CTAB+Stabilised+Gold+Nanoparticles+from+Water+to+Organic+Phase%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+f%C3%BCr+Physikalische+Chemie%22%5BJournal%5D)">Easy and Fast Phase Transfer of CTAB Stabilised Gold Nanoparticles from Water to Organic Phase.</a> Zeitschrift für Physikalische Chemie. 229, 235(2015).</li>
<li>Soliman, M. G., Pelaz, B., Parak, W. J., del Pino, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+Transfer+and+Polymer+Coating+Methods+toward+Improving+the+Stability+of+Metallic+Nanoparticles+for+Biological+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+of+Materials%22%5BJournal%5D)">Phase Transfer and Polymer Coating Methods toward Improving the Stability of Metallic Nanoparticles for Biological Applications.</a> Chemistry of Materials. 27 (3), 990-997 (2015).</li>
<li>Arun Kumar, S., Good, J., Hendrix, D., Yoo, E., Kim, D., Deo, K. A., Jhan, Y. Y., Gaharwar, A. K., Bishop, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoengineered+Light-Activatable+Polybubbles+for+On%3FDemand+Therapeutic+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Nanoengineered Light-Activatable Polybubbles for On?Demand Therapeutic Delivery.</a> Adv. Funct. Mater. , 2003579(2020).</li>
<li>Wuthrich, P., Ng, S. Y., Fritzinger, B. K., Roskos, K. V., Heller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsatile+and+delayed+release+of+lysozyme+from+ointment-like+poly%28ortho+esters%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Pulsatile and delayed release of lysozyme from ointment-like poly(ortho esters).</a> Journal of Controlled Release. 21 (1), 191-200 (1992).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability%2C+stabilization%2C+and+formulation+of+liquid+protein+pharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals.</a> International Journal of Pharmaceutics. 185 (2), 129-188 (1999).</li>
<li>Wong, D. Y., Hollister, S. J., Krebsbach, P. H., Nosrat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28epsilon-caprolactone%29+and+poly+%28L-lactic-co-glycolic+acid%29+degradable+polymer+sponges+attenuate+astrocyte+response+and+lesion+growth+in+acute+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Poly(epsilon-caprolactone) and poly (L-lactic-co-glycolic acid) degradable polymer sponges attenuate astrocyte response and lesion growth in acute traumatic brain injury.</a> Tissue Engineering. 13 (10), 2515-2523 (2007).</li>
<li>Davoodi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+delivery+systems+for+programmed+and+on-demand+release%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Drug delivery systems for programmed and on-demand release.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 132, 104-138 (2018).</li>
<li>Huang, Y. C., Lei, K. F., Liaw, J. W., Tsai, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+laser+intensity+activated+plasmonic+gold+nanoparticle-generated+photothermal+effects+on+cellular+morphology+and+viability%3A+a+real-time%2C+long-term+tracking+and+monitoring+system%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemical+and+Photobiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The influence of laser intensity activated plasmonic gold nanoparticle-generated photothermal effects on cellular morphology and viability: a real-time, long-term tracking and monitoring system.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 18 (6), 1419-1429 (2019).</li>
<li>Link, S., Burda, C., Nikoobakht, B., El-Sayed, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-Induced+Shape+Changes+of+Colloidal+Gold+Nanorods+Using+Femtosecond+and+Nanosecond+Laser+Pulses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Laser-Induced Shape Changes of Colloidal Gold Nanorods Using Femtosecond and Nanosecond Laser Pulses.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 104 (26), 6152-6163 (2000).</li>
<li>U.S. Environmental Protection Agency. Chlorine. , https://www.epa.gov/sites/production/files/2016-09/documents/chlorine.pdf (2000).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Tecnologias e desafios atuais Micro e nanopartículas baseadas em emulsão têm sido comumente usadas como portadores de medicamentos. Embora a cinética de liberação da carga desses dispositivos tenha sido extensivamente estudada, controlar a cinética de liberação de rajadas tem sido um grande desafio11. A versatilidade e funcionalidade da carga também é limitada em sistemas baseados em emulsão devido à exposição da carga a solventes aquosos e orgânicos em excesso. A carga à base ...

A cobertura vacinal limitada resulta na morte de 3 milhões de pessoas especificamente causadas por doenças preveníveis por vacinas1. Condições inadequadas de armazenamento e transporte levam ao desperdício de vacinas funcionais e, portanto, contribuem para a redução da imunização global. Além disso, a vacinação incompleta por não aderir aos calendários vacinais necessários também causa cobertura vacinal limitada, especificamente nos países em desenvolvimento2. São necessárias múltiplas visitas ao pessoal médico dentro do período recomendado para o recebimento de vacinas de reforço, limitando assim o percentual da população com vacinação completa. Por isso, é necessário desenvolver novas estratégias para a entrega controlada de vacinas para contornar esses desafios.
Os esforços atuais para o desenvolvimento de tecnologias de entrega de vacinas incluem sistemas poliméricos baseados em emulsão3,,4. No entanto, a carga é frequentemente exposta a uma maior quantidade de solvente orgânico que pode potencialmente causar agregação e desnaturação, especificamente no contexto da carga à base deproteínas 5,6. Desenvolvemos uma nova plataforma de entrega de vacinas, "polibolhas", que pode potencialmente abrigar vários compartimentos de carga, minimizando o volume de carga que está exposta ao solvente7. Por exemplo, em nossa plataforma de concha-núcleo de polibole, um bolsão de carga de diâmetro de 0,38 mm (SEM) é injetado no centro de um polibole de 1 mm. Neste caso, a superfície da carga exposta ao solvente orgânico seria de aproximadamente 0,453 mm2. Depois de considerar a densidade de embalagem de esferas (micropartículas) dentro de uma esfera (depósito de carga), o volume real de micropartículas (10 μm de diâmetro) que poderia caber no depósito é de 0,17 mm3. O volume de uma micropartícula é de 5,24x10-8 mm3 e, portanto, o número de partículas micropartículas que podem se encaixar no depósito é ~3.2x106 partículas. Se cada micropartícula tiver 20 bolsões de carga (como resultado de dupla emulsão) de 0,25 μm de diâmetro, então a área superficial de carga exposta ao solvente orgânico é de 1274 mm2. O depósito de carga dentro do polibole teria, portanto, ~2800 vezes menos área de superfície exposta a solvente orgânico em comparação com a carga orgânica exposta a solventes em micropartículas. Nossa plataforma baseada em poliéster pode, assim, reduzir potencialmente a quantidade de carga exposta a solvente orgânico que pode causar agregação e instabilidade de carga.
Os polibolhas são formados com base no princípio da separação de fases onde o poliéster em fase orgânica é injetado em uma solução aquosa resultando em uma bolha esférica. A carga na fase aquosa pode então ser injetada no centro do polibole. Outro compartimento de carga pode potencialmente ser alcançado dentro do polibole misturando uma carga diferente com a concha do polímero. O polibole nesta fase será maleável e, em seguida, será curado para resultar em uma estrutura de polibole sólida com carga no meio. Polibolhas esféricas foram escolhidas em vez de outras formas geométricas para aumentar a capacidade de carga dentro do polibole, minimizando o tamanho geral do polibole. Polibolhas com carga no centro foram escolhidas para demonstrar a liberação de rajadas atrasadas. Os polibolhas também foram incorporados com o agente quase infravermelho (NIR) sensível (ou seja, teranostico-habilitador), ou seja, nanorods de ouro (AuNR), para causar aumento na temperatura das polibolhas. Esse efeito poderia potencialmente facilitar a degradação mais rápida e poderia ser usado para controlar cinéticas em aplicações futuras. Neste artigo, descrevemos nossa abordagem de formar e caracterizar polibolhas, para alcançar a liberação de estouro retardada dos polibolhas, e incorporar AuNR dentro dos polibubbles para causar ativação de NIR.

<table><tbody><tr><td>Solução de substrato de ensaio imunoenzimático de ultra tetrametilbezidina (TMB) (ELISA) de 1 etapa</td><td>Thermo scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>2-Hidroxi-2-metilpropiofenona</td><td>TCI AMERICA</td><td>H0991</td><td></td></tr><tr><td>Solução de parada de 450 nm para substrato TMB</td><td>Abcam</td><td>ab17152</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de acriloil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A24109-100G</td><td></td></tr><tr><td>Acriflavina</td><td>Chem-Impex International</td><td>22916</td><td></td></tr><tr><td>Éter etílico anidro</td><td>Fisher Chemical</td><td>E138-500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-HIV1 gp120 anticorpo conjugado à peroxidase de rábano (HRP)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td> <td>Fisher BioReagents</td><td>BP9700100</td><td></td></tr><tr><td>BSA-CF488 conjugados de corante</td><td>Invitrogen</td><td>A13100</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bromossalicílico</td><td>Acros Organics</td><td>AC162142500</td><td></td></tr><tr><td>Carboximetilcelulose (CMC)</td><td>Millipore Sigma</td><td>80502-040</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de Centrmônio (CTAB)</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN19400480</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Fisher Chemical</td><td>C2984</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de revestimento</td><td>Abcam</td><td>ab210899</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano (DCM)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270997-1L</td><td></td></tr><tr><td>Éter dietílico</td><td>Fisher Chemical</td><td>E1384</td><td></td></tr><tr><td>Dodeacil Amina</td><td>Acros Organics</td><td>AC117665000</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de doxorrubicina</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP251610</td><td></td></tr><tr><td>ácido L-ascórbico</td><td>Acros Organics</td><td>A61 100</td><td></td></tr><tr><td>Legato 100 Bomba de seringa</td><td>KD Scientific</td><td>14 831 212</td><td></td></tr><tr><td>mPEG tiol</td><td>Laysan Bio</td><td>NC0702454</td><td></td></tr><tr><td>Leite em pó desnatado</td><td>Andwin Scientific</td><td>NC9022655</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de potássio</td><td>Acros Organics</td><td>AC424081000</td><td></td></tr><tr><td>Tampão salino fosfato</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP3991</td><td></td></tr><tr><td>(Poli(caprolactona)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440744-250G</td><td></td></tr><tr><td>(Poli(caprolactona) triol</td><td>Acros Organics</td><td>AC190730250</td><td></td></tr><tr><td>Poli (ácido lático-co-glicólico) diacrilato</td><td>CMTec</td><td>280050</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato</td><td>de potássio Acros Organics</td><td>AC424081000</td><td></td></tr><tr><td>HIV1 recombinante gp120 + gp41 proteína</td><td>Abcam</td><td>ab49054</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de prata</td><td>Acros Organics</td><td>S181 25</td><td></td></tr><tr><td>Sódio Borohidreto</td><td>Fisher Chemical</td><td>S678-10</td><td></td></tr><tr><td>Ácido tetracloroáurico</td><td>Fisher Chemical</td><td>G54-1</td><td></td></tr><tr><td>Trealose</td><td>Acros Organics</td><td>NC9022655</td><td></td></tr><tr><td>Trietilamina</td><td>Acros</td><td>Organics AC157910010</td><td></td></tr></tbody></table>

produção de plataforma de entrega de vacinas de vacinação de infravermelho próximo e infravermelho

Production of Near-Infrared Sensitive, Core-Shell Vaccine Delivery Platform

Estratégias de entrega de vacinas que podem limitar a exposição da carga a solventes orgânicos, ao mesmo tempo em que permitem novos perfis de liberação, são cruciais para melhorar a cobertura vacinal em todo o mundo. Aqui, uma nova plataforma de liberação de vacinas injetável, ultravioleta e retardada, que permite a entrega de vacinas chamada polibolhas, é introduzida. A carga foi injetada em polibolhas à base de poliéster que foram formadas em uma solução aquosa baseada em carboxymethycellulose de 10%. Este artigo inclui protocolos para manter a forma esférica dos polibolhas e otimizar a colocação e retenção de carga para maximizar a quantidade de carga dentro dos polibolhas. Para garantir a segurança, o teor de solventes clorados dentro dos polibolhas foi analisado por meio da análise de ativação de nêutrons. Os estudos de liberação foram realizados com pequenas moléculas como carga dentro do polibole para confirmar a liberação retardada da explosão. Para mostrar ainda mais o potencial de entrega sob demanda da carga, nanorods de ouro foram misturados dentro da concha de polímero para permitir a ativação a laser quase infravermelha.

Os polibolhas foram amplamente caracterizados por MEIO DE SEM e NAA. A carga foi centrada com sucesso para resultar em uma liberação de explosão atrasada. Os polibolhas também foram ativados com sucesso a laser devido à presença de AuNRs dentro dos polibolhas.
Caracterização de poliboles Os polibolhas injetados em uma solução aquosa sem CMC resultaram em um polibole achatado devido ao seu contato com a parte ...

Este artigo descreve os protocolos usados para produzir uma nova plataforma de entrega de vacinas, "polibolhas", para permitir a liberação de estouro atrasada. Poliésteres incluindo poli (ácido láctico-coglicólico) e policaprolactona foram usados para formar os polibolhas e pequenas moléculas e antígenos foram usados como carga.

Produção de plataforma de entrega de vacinas de vacinação de infravermelho próximo e infravermelho

Vaccine delivery strategies that can limit the exposure of cargo to organic solvent while enabling novel release profiles are crucial for improving ...

Este protocolo pode ajudar a manter a estabilidade da carga, que pode ser tanto pequenas moléculas quanto proteínas, através do uso do polibole, que por sua vez pode reduzir as interações de carbono com o solvente. Esta nova técnica pode ser usada para melhorar a cobertura vacinal nos países em desenvolvimento, uma vez que as funcionalidades vacinais podem ser muitas vezes comprometidas devido a instalações de transporte e armazenamento ineficientes. Para fabricar os polibolhas, primeiro use uma pipeta de transferência de um mililitro para adicionar 800 microliters de 10% CMC em um frasco de vidro de 0,92 mililitro.Para sintetizar o PCLTA, misture 1.000 gramas por mililitro de 14 kilodalton PCL em 200 microliters de DCM. Para sintetizar PLGADA, misture 1.000 gramas por mililitro de cinco kilodalton PLGADA em 200 microliters de clorofórmio. Misture o fotoinitiador com a mistura de polímero de interesse a uma proporção de 0,005 a 1 e carregue 200 microliters da solução resultante em uma seringa de vidro de um mililitro montada em uma bomba de seringa conectada a um tubo de aço inoxidável de distribuição com diâmetro interno de 0,016 polegadas.Usando um micromotor para controlar o movimento dianteiro e para trás do tubo de polímero, injete o polímero no frasco de 10%CMC no frasco de vidro para formar os polibolhas e curar os polibolhas sob luz ultravioleta em um comprimento de onda de 254 nanômetros por 60 segundos a dois watts por centímetro quadrado, em seguida, o flash congele os polibolhas em nitrogênio líquido por 30 segundos e liofilize os portadores durante a noite a 0,01 milibarbar de vácuo em menos 85 graus Celsius. Para centralizar a carga de interesse dentro de um polibole, misture a carga com 5% cmc em um rotador durante a noite para aumentar a viscosidade da carga antes de injetar manualmente dois microliters da mistura de carga no polibole. Quando toda a carga tiver sido injetada, re-curar, congelar flash e liofilizar o polibole injetado como apenas demonstrado.Na manhã seguinte, use fórceps para separar o polibole do CMC seco e lavar o polibole com água deionizada para remover qualquer CMC residual. Em seguida, corte o polibole ao meio e imagem as metades por microscopia confocal para garantir que a carga esteja centrada. Para a liberação de carga de pequenas moléculas, incubar os polibolhas com acriflavina centrada em 400 microliters de PBS a 37 graus Celsius para o comprimento de incubação apropriado.A cada ponto de tempo experimental, colete o supernascer e adicione 400 microliters de PBS fresco ao frasco. Em seguida, use um leitor de placas para quantificar a intensidade de fluorescência do supernatante coletado. Para ativação infravermelha próxima, misture a solução de polímero com nano hastes de ouro hidrofobicizadas a uma proporção de um a nove e adicione o iniciador fotográfico a uma proporção de 0,005 a 1.Injete a mistura resultante em um frasco de vidro de 0,92 mililitro contendo 800 microliters de 10% CMC e cure os polibolhas sob luz ultravioleta, como demonstrado. Após o congelamento e a liofilização como demonstrado, lave os polibolhas com água deionizada e incuba os portadores em 400 microlitadores de PBS a 37 graus Celsius para o período de incubação adequado. No final da incubação, obtenha uma imagem infravermelha prospectiva do polibole antes e depois de ativar os polibolhas com um laser infravermelho de 801 nanômetros em oito amperes por cinco minutos três vezes por semana durante quatro semanas para polibolhas PLGADA e 14 semanas para polibolhas PCL-PCLTA.A cada ponto de tempo experimental, colete o supernascer e adicione 400 microliters de PBS fresco ao frasco. Em seguida, calcule as diferenças de temperatura entre os polibolhas antes e depois da ativação do laser com base nos valores de temperatura das imagens infravermelhas prospectivas. A adição de uma solução aquosa baseada em 10% CMC resulta em uma suspensão completa de polibobo para uma manutenção bem sucedida da esferoférico de poliboles.A injeção de carga no polibole na ausência de CMC resulta em vazamento e consequente falta de retenção de carga dentro do polibole. Para lidar com esse vazamento, a viscosidade do PCLTA pode ser aumentada usando carbonato de potássio isolado após o corte final de policaprolactona com triacrilato e a viscosidade da carga pode ser aumentada misturando a carga com 5%CMC. A viscosidade dos polibolhas PLGADA é suficiente para facilitar o centro da carga e não requer modulação via carbonato de potássio.Note que nenhuma diferença estatisticamente significativa na eficiência vinculante do anticorpo é observada após a mistura do antígeno HIV gp120/41 com e sem trehalose antes da injeção de polibole. Liberações de rajadas são observadas em polibolhas PLGADA com acriflavina no meio do dia 19 para polibolhas incubadas a 37 graus Celsius e no quinto dia para polibolhas incubadas a 50 graus Celsius. Além disso, os polibolhas PLGADA e os polibolhas PCL e PCLTA contendo nanoducos de ouro podem ser ativados com sucesso a laser várias vezes.Ao formar os polibolhas, tome cuidado para proteger os reagentes da luz e também para usar as soluções imediatamente. Depois de desenvolver essa tecnologia, também queríamos explorar a automatização desse processo para ampliar a produção de polibolhas.

production-near-infrared-sensitive-core-shell-vaccine-delivery

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo descreve um procedimento geral para o estudo de ligação aos receptores recombinantes de domínio (RBD) com base em vacinas de subunidade contra a SARS. Ele inclui métodos para transfecção e expressão da proteína em células RBD 293T, a imunização de camundongos com RBD e detecção de atividade de neutralização dos soros do mouse usando um ensaio de neutralização estabelecida SARS pseudovirus.

Protocolo para vacinas recombinantes RBD baseado SARS: Preparação de proteínas, Vacinação Animal e Detecção de Neutralização

Este vídeo demonstra um método para gerar vacinas de vesícula de membrana externa (OMV) com exibição multivalente. As células de mamíferos são transfectadas para expressar e secretar antígenos virais fundidos a um SpyTag e a uma etiqueta de poli-histidina. Esses antígenos são então purificados usando uma coluna de afinidade de ácido nitrilotriacético (Ni-NTA). O antígeno purificado é misturado com vesículas de membrana externa que expressam a proteína SpyCatcher (SC) ligada à superfície. Vários...

Gerando uma vacina de vesícula de membrana externa de exibição multivalente

Este vídeo demonstra um método para a geração de uma nova plataforma baseada em bolha de polímero ou polibolha que permite a liberação retardada de explosão. Polímeros à base de poliéster são usados para formar as polibolhas com estrutura núcleo-casca, e pequenas moléculas e antígenos podem ser usados como carga.

Uma técnica para gerar uma nova plataforma de entrega para uma liberação de explosão retardada de moléculas

Este vídeo demonstra um método para gerar uma vacina candidata de mRNA usando nanopartículas poliméricas. O polímero catiônico interage com o mRNA carregado negativamente, formando poliplexos. A formação de poliplexos estabiliza o mRNA, tornando-o um candidato potencial para futuras vacinas de mRNA em aplicações imunoterapêuticas.

Formulação de nanopartículas carregadas de mRNA para fins de vacinação

Um método detalhado é fornecido aqui descrevendo a purificação, o redobramento, e a caracterização de nanopartículas de proteína Self-montagem (SAPNs) para o uso no desenvolvimento da vacina.

Produção de E. coli-expressa auto-montagem de nanopartículas de proteína para vacinas que requerem Trimeric epitope apresentação

Este protocolo descreve o uso de kits comerciais de expressão de proteínas livres de células para produzir proteínas de membrana suportadas em nanodiscos que podem ser usadas como antígenos em vacinas de subunidades.

Produção em Escala Livre de Células e Adição de Adjuvante a uma Proteína Recombinante da Membrana Externa Principal de Chlamydia muridarum para o Desenvolvimento de Vacinas

O presente protocolo descreve a bioengenharia de vesículas de membrana externa como uma plataforma de vacina "Plug-and-Display", incluindo produção, purificação, bioconjugação e caracterização.

Uma plataforma de vacina de nanopartículas "plug-and-display" baseada em vesículas de membrana externa exibindo o domínio de ligação ao receptor SARS-CoV-2

Aqui, apresentamos métodos detalhados para a preparação e avaliação da vacina tumoral em nanoemulsão auto-montada nasal in vitro e in vivo.

Preparação, características, toxicidade e avaliação da eficácia da vacina contra tumores em nanoemulsão automontada nasal in vitro e in vivo

Este método descreve a encapsulação do antígeno da raiva em micropartículas poliméricas biodegradáveis com propriedades estruturais e materiais que permitem a liberação pulsátil após um atraso pré-determinado. A avaliação ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) do antígeno recuperado do núcleo da partícula confirma a presença de glicoproteína intacta do vírus trimérico da raiva através da fabricação de partículas.

Fabricação de Micropartículas Poliméricas Pulsáteis Encapsulando o Antígeno Rábico

Neste protocolo, desenvolvemos um ácido retinóico (AR) encapsulado em nanoemulsão catiônica para ser usado como adjuvante para promover respostas sistêmicas e mucosas específicas do antígeno. Ao adicionar o RA aprovado pela FDA à nanoemulsão, a sIgA específica do antígeno foi promovida na vagina e no intestino delgado após a injeção intramuscular da nanoemulsão.

Ácido retinóico encapsulado em nanoemulsão catiônica como adjuvante para promover respostas sistêmicas e mucosas específicas do OVA

Aprenda a fabricar polibolhas com PLGA e PCL para entrega de vacinas com liberação controlada por laser infravermelho próximo. Esta plataforma melhora a estabilidade do produto e a acessibilidade em regiões com recursos limitados.

Produção de plataforma de entrega de vacinas de vacinação de infravermelho próximo e infravermelho

Explorar mais vídeos