Name: Geração de ratos transgênicos usando uma abordagem vetorial lentiviral (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Aprenda a técnica de transgênese lentiviral em embriões de ratos para engenharia genética. Este método acessível permite a incorporação eficiente de transgenes no genoma, facilitando estudos de função gênica em organismos vivos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este estudo foi apoiado pelo projeto ANIMOD dentro do programa Team Tech Core Facility Plus da Fundação para a Ciência Polonesa, co-financiado pela União Europeia no âmbito do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional para a WK.

A produção e aplicação de vetores virais estava de acordo com as diretrizes do Nível 2 de Biossegurança e foi aprovada pelo Ministério do Meio Ambiente polonês. Todos os procedimentos experimentais em animais descritos abaixo foram aprovados pelo Comitê Deética Local. Os animais foram alojados em gaiolas ventiladas individualmente a uma temperatura estável (21-23 °C) e umidade (50-60%) com acesso a ad libitum à água e alimentos sob um ciclo de luz/escuridão de 12 h/12 h.
1. Produção de vetores lentivirais
<ol><li>Transfecção de células HEK 293T NOTA: O protocolo aqui apresentado é projetado para a transfecção de vinte pratos de cultura Ø10 cm que produz aproximadamente 200 mL de sobrenadante vetorial bruto.<ol>
<li>Células DE Cultura HEK 293T no meio DMEM que é suplementada com soro bovino fetal (10%, v/v) em uma incubadora de CO2 umidificada a 37 °C. Para a transfecção, prepare vinte placas de 10 cm de diâmetro e sementes 1,5-2 x 106 HEK 293T células por prato.</li>
		<li>Quando a confluência atinge ~70%, transfectas as células que utilizam reagente de polietilenoina (PEI), pH 7.0, a uma razão de 3 μg de PEI por 1 μg de DNA.<ol>
<li>Prepare a mistura de transfecção para cinco pratos (prepare o número de repetições de acordo com o número total de pratos). A 1 mL do Meio Águia Modificada de Dulbecco (DMEM; sem soro), adicione a mistura de três plasmídeos para que atinjam uma quantidade final de 25 μg de plasmídeo VSVg, 50 μg de delta R8.2 e 50 μg de plasmídeo de codificação.</li>
			<li>Pipeta para cima e para baixo, e adicione 125 μL de PEI a uma concentração de 3 μg/μL. Incubar em temperatura ambiente por 15 min, invertendo o tubo três vezes durante a incubação. Adicione 200 μL da mistura de transfecção por placa. Em seguida, incubar as placas em uma incubadora de CO2 umidificada a 37 °C.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Concentração de vetores lentivirais<ol>
<li>Quarenta e oito horas após a transfecção, colher o meio que contém partículas lv. Use tubos cônicos de 50 mL. NOTA: Ao usar um plasmídeo com uma etiqueta fluorescente, as células podem ser visualizadas neste momento para verificar a eficiência da transfecção. Uma nova porção do meio DMEM pode ser adicionada, e as células podem ser incubadas por mais 24 horas. O rendimento de LV é comparável quando coletado nos pontos de tempo de 48 e 72 h após a transfecção.</li>
		<li>Centrifugar o meio a 3.000 xg por 5 min e temperatura ambiente para remover células separadas.</li>
		<li>Filtre o sobrenadante (0,45 μm) e despeje-o em novos tubos. NOTA: Esta etapa pode ser omitida.</li>
		<li>Adicione DNase I (livre de RNase, 1 μg/mL) e MgCl2 (1 mM), e incubar em banho-maria a 37 °C por 15 min.</li>
		<li>Transfira os tubos de polietileno médio para descartáveis e a ultracentrífuga em um rotor oscilante a 115.000 x g e 4 °C por 1,5 h.</li>
		<li>Após o centrifugação, drene suavemente as paredes dos tubos dos resíduos médios.</li>
		<li>Mergulhe a pelota com solução salina tampoada por fosfato estéril (PBS; 70-80 μL por tubo).</li>
		<li>Incubar por 2 h a 4-8 °C.</li>
		<li>Resuspenda os vetores virais na PBS por pipetting suave. ATENÇÃO: Evite espumar.</li>
		<li>Transfira para um tubo de centrífuga de 1,5 mL e centrífuga a 7.000 x g e 4 °C por 30 s. Transfira o sobrenadante para um novo tubo. Repita este passo até que nenhuma pelota de detritos celulares esteja visível.</li>
		<li>Alíquota e congele a -80 °C. Evite recongelar a alíquota lv.</li>
	</ol></li>
	<li>Determinação do título de vírus usando reação quantitativa da cadeia de polimerase NOTA: A titulação dos vetores virais é realizada utilizando PCR quantitativo (qPCR). Este método baseia-se na amplificação de um fragmento de DNA de 84 bp de comprimento de dupla retinência dentro da longa região de repetição terminal do genoma viral15.<ol>
<li>Prepare a curva padrão fazendo diluições seriais do plasmídeo codificador de LV: 1:500, 1:1.000, 1:5.000, 1:10.000, 1:100.000 e 1:1.000.000. Determine o número de cópias do plasmídeo usado para a curva padrão. Use a seguinte fórmula: número de cópias/μL = (concentração [g/μL] x 6,02 x 1023 [número/mol]) / (660 [g/mol] x tamanho plasmídeo [bp]), onde 6,02 x 1023 número/mol é o número de Avogadro, e 660 g/mol é o peso da bp. NOTA: Podem ser utilizadas calculadoras de números de cópia on-line.</li>
		<li>Preparar diluições da suspensão lentiviral: 1:100, 1:500 e 1:1.000.</li>
		<li>Prepare a mistura de reação (volumes por poço): 10 μL de qPCR Mastermix, 1 μL de 10 μM Forward primer, 1 μL de 10 μM de primer reverso e 7 μL de H2O. Pipeette a mistura nos poços de 96-well placas. NOTA: Primer dianteiro: 5'-AGCTTGCCTTGAGTGCTTCa. Primer reverso: 5'-TGACTAAAAGGGTCTGAGGGA.</li>
		<li>Adicione 1 μL de cada diluição padrão e suspensão lentiviral em triplicado.</li>
		<li>Execute o qPCR de acordo com os seguintes parâmetros: 50 °C para 2 min, 96 °C para 5 min e 35 ciclos de 96 °C para 20 s, 60 °C para 40 s e 70 °C para 1 min, seguido de estágio de curva de derretimento: 95 °C para 1 min e 60 °C a 30 s.</li>
		<li>Analise os resultados comparando o número de moléculas recebidas para cada diluição à curva padrão. Determine a concentração de moléculas vetores como a média de três réplicas para cada diluição. NOTA: A quantificação apresentada proporciona a concentração física das partículas virais. Não deve ser tratado como um título funcional.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Geração de ratos transgênicos
<ol><li>Superovulação e coleta de embriões fertilizados<ol>
<li>Administre gonadotropinas. NOTA: Para aumentar o número de embriões coletados (aproximadamente 30 por fêmea), use fêmeas Wistar imaturas de 5 semanas de idade para estimulação hormonal.<ol>
<li>No dia 1 (12:00-1PM), injete intraperitoneicamente o soro de égua grávida gonadotropina (PMSG; 25 UI por fêmea). Preparar alíquotas de 1 mL de solução de trabalho em uma concentração de 125 UI/mL dissolvendo o pó hormonal em 0,9% naCl. Armazene a -20 °C por até 1 mês ou -80 °C por até 6 meses.</li>
			<li>No dia 3 (12 PM-1 PM), injete intraperitoneicamente gonadotrophina coriônica humana (hCG; 30 UI por fêmea). Preparar alíquotas de 1 mL de solução de trabalho (150 UI/mL) dissolvendo o pó hormonal em 0,9% de NaCl. Armazene a -20 °C por até 1 mês ou -80 °C por até 6 meses.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Após a administração do HCG, mate fêmeas 1:1 com machos sexualmente férteis (3-10 meses de idade).</li>
		<li>Na manhã seguinte (dia 4 às 8-10 am), verifique as fêmeas para a presença de um plug vaginal. Verifique a abertura vaginal para a presença de um plugue de acasalamento esbranquiçado, que para melhor visualização deve ser verificado no início da manhã após a noite de acasalamento. Para a coleta de embriões, utilize apenas fêmeas com um plugue visível.</li>
		<li>Coletar embriões às 10 da manhã. Sacrifique os animais para extirpar os ovidutos, e colete os ovidutos em um prato com meio M2 pré-aquecido.<ol>
<li>Transfira os ovidutos para um prato de 35 mm que contenha meio M2 pré-aquecido com hialuronidase de testículos bovinos a uma concentração de 0,5 mg/mL.</li>
			<li>Abra as paredes do oviduto usando pinças finas sob um microscópio enomicroscópio e pressione a ampulla (ou seja, a parte inchada do oviduto que contém embriões fertilizados que estão cercados por células cumulus) até que os embriões sejam liberados. NOTA: A hialuronidase digere enzimáticamente as células cumulus, liberando embriões. ATENÇÃO: A exposição prolongada à hialuronidase é deletério aos embriões; portanto, este passo não deve durar mais do que 5 min.</li>
			<li>Para facilitar a liberação de embriões de células cumulus, tubos suavemente para cima e para baixo usando uma pipeta de transferência de vidro que é conectada a um tubo aspirador operado pela boca.<ol>
<li>Para produzir a pipeta de transferência, puxe uma pipeta pasteur de vidro sobre uma chama para produzir uma ponta reta ~5-10 cm. Quebre a pipeta deixando uma ponta de ~4 cm.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Lave os embriões algumas vezes em meio M2 para remover os detritos hialuronidase e celular. Transfira os embriões para um prato de 60 mm que contenha (~50 μL) gotas de meio M16 pré-equilibrado, coberto por parafina líquida ou óleo mineral, em uma incubadora de 37 °C umidificada com uma atmosfera de 5% de CO2.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Microinjeção de vetores lentivirais em embrião em estágio unicelular sob a zona pellucida NOTA: Use embriões em estágio unicelular com duas pronucéis visíveis para microinjeção (Figura 1).<ol>
<li>Descongele a alíquota LV à temperatura ambiente e centrífuga a 10.000 x g e RT por 2 min para pellet quaisquer detritos celulares restantes.</li>
		<li>Configuração de microinjeção<ol>
<li>Prepare as pipetas de retenção de vidro (capilar de vidro borossilicato) usando uma microforge. Puxe o vidro capilar sobre uma chama para produzir uma ponta de 5 a 10 cm. Quebre a pipeta deixando uma ponta de ~4 cm. O diâmetro externo deve ser de ~80-120 μm. NOTA: Certifique-se de que a ponta da pipeta é perfeitamente reta e lisa.</li>
			<li>Monte a pipeta puxada em uma microforge com a ponta na frente do filamento de aquecimento. Aqueça o filamento muito perto da ponta da pipeta e deixe-o encolher para um diâmetro de ~15 μm (aproximadamente 20% do tamanho do embrião). Posicione a pipeta perpendicularmente ao filamento de aquecimento, a 2-3 mm da ponta da pipeta, e comece a aquecer. O vidro vai amolecer. Aqueça até atingir um ângulo de 15°.</li>
			<li>Prepare capilares de vidro borosilicato de microinjeção com um filamento usando um puxador de pipeta. Insira o capilar na câmara de puxar. Execute um teste de rampa (pela primeira vez para vidro novo e todas as vezes depois de trocar o filamento). Defina o Calor para o valor de rampa -10, Puxe para 100, Velocity para 150 e Time para 100. NOTA: Modifique os parâmetros para obter um capilar de injeção ideal.</li>
			<li>Sob uma coifa de fluxo laminar biossafety, carregue aproximadamente 2 μL da solução viral na pipeta de microinjeção com uma ponta de microcarregador.</li>
			<li>Prepare uma placa de microinjeção (tampa de placa de Petri de 60 mm) com uma gota de 100 μL de médio M2 (no meio), coberta por parafina líquida ou óleo mineral.</li>
			<li>Monte a pipeta de retenção e o capilar de microinjeção que é carregado com solução viral para um micromanipulador e microinjeção prato sob um microscópio invertido.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Faça a microinjeção.<ol>
<li>Transfira 15-20 embriões de estágio unicelular para a queda de M2 na antena de microinjeção. Segure o embrião usando uma pipeta de retenção.</li>
			<li>Utilizando a ampliação de 400x, injete a solução LV sob a zona pellucida para o espaço perivitelline usando o capilar de vidro que é conectado a um injetor automático. Segure o capilar sob a zona pellucida por um momento. NOTA: Usando pressão positiva suave, a solução viral fluirá continuamente para fora da capilar de injeção, mas o volume da suspensão que é entregue não pode ser controlado.</li>
			<li>Usando uma pipeta fina, devolva os embriões ao prato de cultura na incubadora a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2. O número de injeções de um zigoto pode variar e pode ser adaptado com base na concentração de vetores virais. NOTA: Os embriões injetados podem ser transferidos para mães adotivas em estágio unicelular ou O/N incubados em meio M16 antes de serem transferidos no estágio de duas células. A cultura in vitro prolongada dos embriões de ratos deve ser evitada.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Transferência de embriões injetados para mães adotivas<ol>
<li>Preparar mães adotivas acasalando fêmeas sd sexualmente maduras com machos fértil sd ou com machos sd vasectomizados (o procedimento de vasectomia é descrito na seção 3 abaixo) no dia 3 (para transferência de embriões em estágio de uma célula) ou dia 4 (para transferência de embriões no estágio de duas células). NOTA: Para a transferência de ovidutos, use 0,5 dias pós-coito (dpc) femininos.</li>
		<li>Na manhã seguinte, verifique as fêmeas da SD para um plugvaginal, e use apenas aquelas com um plugue visível.</li>
		<li>Realizar transferência de embriões. NOTA: Conduzir o procedimento cirúrgico com instrumentos estéreis sob um microscópio estereomicroscópio. Antes do dia da cirurgia, tesoura autoclave, fórceps finos, porta-agulhas e suporte de bisturi.<ol>
<li>Anestesiar uma fêmea com i.p. administração de cetamina (50 mg/kg) e medetomidina (0,5 mg/kg) solução. Teste para reflexos para confirmar a anestesia antes de iniciar o procedimento cirúrgico.</li>
			<li>Injete o animal subcutâneamente com ácido tolefenâmico (2 mg/kg), tarrato de butorphanol (1 mg/kg) e enrofloksacina (5-10 mg/kg) para prevenir inflamação, dor e infecção, respectivamente.</li>
			<li>Aplique lubrificação de pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar a secagem da córnea. Raspe a pele das costas e esterilize a pele com esfoliante cirúrgico seguido de 70% de álcool usando almofadas não aderentes estéreis. Deixe a pele secar.</li>
			<li>Injete o animal subcutâneamente com 100 μL de bupivacaína (anestésico local) no local da incisão. Transfira o animal em posição propensa a uma superfície limpa em uma almofada de aquecimento sob o objetivo de um microscópio cirúrgico. Cubra o rato com uma cortina estéril com um pequeno orifício cortado na parte inferior das costas.</li>
			<li>Realize uma incisão cutânea de aproximadamente 2 cm, paralela à coluna vertebral lombar.</li>
			<li>Usando uma tesoura afiada, faça um corte na parede abdominal. Pegue uma almofada de gordura ovariana usando fórceps, retire o ovário e o oviduto e coloque-os em gaze que é molhada com 0,9% de NaCl.</li>
			<li>Aspirar m2 médio, três bolhas de ar, e os embriões para a transferência capilar. Número total recomendado de embriões a serem transferidos (unilaterais ou bilaterais): fêmea grávida (≤ 15-16 embriões), fêmea pseudográvida (≤ 30 embriões).</li>
			<li>Faça uma pequena incisão no oviduto (entre o infíbulo e a ampulla) usando microtesoura, e insira a pipeta de transferência no oviduto.</li>
			<li>Expulse suavemente embriões e bolhas de ar da pipeta para o oviduto. Com fórceps contundentes, coloque o trato reprodutivo de volta na cavidade abdominal.</li>
			<li>Suturar a parede abdominal com suturas absorvíveis de ácido poliglicólico e fechar a incisão da pele com clipes de ferida. Dependendo do número de embriões disponíveis, repita este procedimento para o outro oviduto.</li>
			<li>Injete o animal intraperitonealmente com atipamezol (0,5 mg/kg) para reverter o efeito da anestesia.</li>
			<li>Transfira o animal para uma gaiola limpa e mantenha-o em uma placa de aquecimento para se recuperar totalmente da anestesia. A entrega em ratos ocorre após ~21 dias. NOTA: Quando os ratos BN machos são usados para acasalamento, apenas os filhotes brancos são potencialmente transgênicos; filhotes marrons são de gravidez natural.</li>
			<li>Coletar fragmentos de tecido (de preferência da orelha) para filhotes de 3 semanas de idade.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. Vasectomia
NOTA: Antes do dia da cirurgia, tesoura autoclave, fórceps finos e porta agulha.
<ol><li>Anestesiar um rato SD macho de 5 semanas de idade com administração i.p. de cetamina (50 mg/kg) e medetomidina (0,5 mg/kg) solução. Teste para reflexos para confirmar a anestesia antes de iniciar o procedimento cirúrgico.</li>
	<li>Administrar ácido tolfenamico (2 mg/kg), tartar butorphanol (1 mg/kg) e enrofloksacina (5-10 mg/kg) subcutâneamente para prevenir inflamação, dor e infecção, respectivamente.</li>
	<li>Aplique lubrificação de pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar a secagem da córnea. Coloque o supino de rato sobre uma superfície limpa em uma almofada de aquecimento, e esterilize a pele nos testículos com esfoliante cirúrgico seguido de 70% de álcool usando almofadas não aderentes estéreis. Deixe a pele secar. Cubra o rato com uma cortina estéril com um pequeno buraco cortado sobre os testículos. Pressione suavemente o abdômen para expor os testículos no saco escrotal.</li>
	<li>Usando uma tesoura cirúrgica, faça uma incisão de ~0,5 cm no meio do saco escrotal. Localize a parede da linha média (linha esbranquiçada) entre os testículos.</li>
	<li>Faça uma incisão de 5 mm na membrana de testículo perto do lado esquerdo da parede da linha média.</li>
	<li>Empurre cuidadosamente o testículo para a esquerda e localize vas deferens (entre o testículo e a linha média) como um ducto branco com um único vaso sanguíneo.</li>
	<li>Puxe suavemente os vasos deferentes do saco escrotal usando os fórceps de um relojoeiro. Segure os vasos deferentes com um par de fórceps, e corte-o com uma tesoura fina (ou cauterize com pontas vermelhas de um segundo par de fórceps). Remova um fragmento de ~1 cm do duto. NOTA: Se a cauterização for realizada, segure a ponta do segundo par de fórceps na chama.</li>
	<li>Repita o procedimento acima para os outros testículos. Suturar a pele com suturas absorvíveis de ácido poliglicólico e injetar o animal intraperitonealmente com atipamezol (0,5 mg/kg).</li>
	<li>Coloque o rato em uma gaiola limpa em uma placa de aquecimento até que o animal se recupere da anestesia. NOTA: Os machos podem ser usados nos acasalamentos de teste após um período de recuperação de ~2 semanas. Depois que a esterilidade for confirmada, eles podem ser usados para indução de pseudogravidez.</li>
</ol>

<ol><li>Lazar, J., Moreno, C., Jacob, H. J., Kwitek, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+genomics+on+research+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Impact of genomics on research in the rat.</a> Genome Research. 15 (12), 1717-1728 (2005).</li>
<li>Tarkowski, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+mouse+chimeras+developed+from+eggs+fused+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22National+Cancer+Institute+Monographs%22%5BJournal%5D)">Studies on mouse chimeras developed from eggs fused in vitro.</a> National Cancer Institute Monographs. 11, 51-71 (1963).</li>
<li>Gordon, J. W., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+and+stable+germ+line+transmission+of+genes+injected+into+mouse+pronuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei.</a> Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).</li>
<li>Gill, T. J., Smith, G. J., Wissler, R. W., Kunz, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rat+as+an+Experimental+Animal%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Rat as an Experimental Animal.</a> Science. 245 (4915), 269-276 (1989).</li>
<li>Aitman, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+prospects+in+rat+genetics%3A+a+community+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Progress and prospects in rat genetics: a community view.</a> Nature Genetics. 40 (5), 516-522 (2008).</li>
<li>Hammer, R. E., Maika, S. D., Richardson, J. A., Tang, J. P., Taurog, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+inflammatory+disease+in+transgenic+rats+expressing+HLA-B27+and+human+beta+2m%3A+an+animal+model+of+HLA-B27-associated+human+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous inflammatory disease in transgenic rats expressing HLA-B27 and human beta 2m: an animal model of HLA-B27-associated human disorders.</a> Cell. 63 (5), 1099-1112 (1990).</li>
<li>Mullins, J. J., Peters, J., Ganten, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fulminant+hypertension+in+transgenic+rats+harbouring+the+mouse+Ren-2+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fulminant hypertension in transgenic rats harbouring the mouse Ren-2 gene.</a> Nature. 344 (6266), 541-544 (1990).</li>
<li>Menoret, S., Remy, S., Usal, C., Tesson, L., Anegon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Transgenic+Rats+by+Microinjection+of+Short+DNA+Fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Rat+Genomics%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of Transgenic Rats by Microinjection of Short DNA Fragments.</a> Rat Genomics: Methods and Protocols. 597, 81-92 (2010).</li>
<li>Tesson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+modifications+of+the+rat+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Transgenic modifications of the rat genome.</a> Transgenic Research. 14 (5), 531-546 (2005).</li>
<li>Charreau, B., Tesson, L., Soulillou, J. P., Pourcel, C., Anegon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+rats%3A+Technical+aspects+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in rats: Technical aspects and models.</a> Transgenic Research. 5 (4), 223-234 (1996).</li>
<li>Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+embryos+and+mice+produced+from+low+titre+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors.</a> Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).</li>
<li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295 (5556), 868-872 (2002).</li>
<li>Pfeifer, A., Ikawa, M., Dayn, Y., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+by+lentiviral+vectors%3A+lack+of+gene+silencing+in+mammalian+embryonic+stem+cells+and+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2140-2145 (2002).</li>
<li>Koza, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+TDP-43+depletion+affects+activity-dependent+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Neuronal TDP-43 depletion affects activity-dependent plasticity.</a> Neurobiology of Disease. 130, 104499(2019).</li>
<li>Scherr, M., Battmer, K., Blomer, U., Ganser, A., Grez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+determination+of+lentiviral+vector+particle+numbers+by+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Quantitative determination of lentiviral vector particle numbers by real-time PCR.</a> Biotechniques. 31 (3), 520(2001).</li>
<li>Canseco, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+efficiency+during+gestation+and+the+influence+of+co-transfer+of+non-manipulated+embryos+on+production+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Gene transfer efficiency during gestation and the influence of co-transfer of non-manipulated embryos on production of transgenic mice.</a> Transgenic Research. 3 (1), 20-25 (1994).</li>
<li>Charreau, B., Tesson, L., Soulillou, J. P., Pourcel, C., Anegon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+rats%3A+technical+aspects+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in rats: technical aspects and models.</a> Transgenic Research. 5 (4), 223-234 (1996).</li>
<li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (13), 4438-4442 (1985).</li>
<li>Armstrong, D. T., Opavsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superovulation+of+immature+rats+by+continuous+infusion+of+follicle-stimulating+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Superovulation of immature rats by continuous infusion of follicle-stimulating hormone.</a> Biology of Reproduction. 39 (3), 511-518 (1988).</li>
<li>Popova, E., Krivokharchenko, A., Ganten, D., Bader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+PMSG-+and+FSH-induced+superovulation+for+the+generation+of+transgenic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Comparison between PMSG- and FSH-induced superovulation for the generation of transgenic rats.</a> Molecular Reproduction and Development. 63 (2), 177-182 (2002).</li>
<li>Johnson, L. W., Moffatt, R. J., Bartol, F. F., Pinkert, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+embryo+transfer+protocols+for+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Optimization of embryo transfer protocols for mice.</a> Theriogenology. 46 (7), 1267-1276 (1996).</li>
<li>van den Brandt, J., Wang, D., Kwon, S. H., Heinkelein, M., Reichardt, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirally+generated+eGFP-transgenic+rats+allow+efficient+cell+tracking+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Lentivirally generated eGFP-transgenic rats allow efficient cell tracking in vivo.</a> Genesis. 39 (2), 94-99 (2004).</li>
<li>Remy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+of+Lentiviral+Vectors+to+Obtain+Transgenic+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Rat+Genomics%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">The Use of Lentiviral Vectors to Obtain Transgenic Rats.</a> Rat Genomics: Methods and Protocols. 597, 109-125 (2010).</li>
</ol>

O autor (W.K.) tem direito à patente, "Método de produção de um animal transgênico", do escritório de patentes da República da Polônia (nº 355353; 21.03.2008).

Os avanços nas tecnologias transgênicas tornaram os modelos de roedores uma ferramenta inestimável na pesquisa biomédica. Eles oferecem a oportunidade de estudar relações genótipo-fenótipo in vivo. Aqui, apresentamos uma alternativa amplamente disponível para transgênese convencional por injeções pronucleares. O uso da transdução do gene lentiviral ignora a necessidade de exigir microinjeções porque vetores virais podem ser injetados sob a zona pellucida. Essa abordagem não afeta a integridade do embrião, o que essencial...

Por muitos anos, roedores de laboratório, como ratos e camundongos, têm sido usados para modelar condições fisiológicas e patológicas humanas. A pesquisa em animais levou a descobertas que eram inatingíveis por qualquer outro meio. Inicialmente, estudos genéticos se concentraram na análise de distúrbios e fenótipos de ocorrência espontânea que são considerados para imitar de perto a condição humana1. O desenvolvimento de métodos de engenharia genética permitiu a introdução ou exclusão de genes específicos para obter um fenótipo desejado. Portanto, a geração de animais transgênicos é reconhecida como uma técnica fundamental na pesquisa moderna que permite estudos da função genética em organismos vivos.
A tecnologia animal transgênica tornou-se possível através de uma combinação de realizações em embriologia experimental e biologia molecular. Na década de 1960, o embriologista polonês A. K. Tarkowski publicou o primeiro trabalho sobre manipulação de embriões de camundongos durante os estágios iniciais do desenvolvimento2. Além disso, biólogos moleculares desenvolveram técnicas para gerar vetores de DNA (ou seja, portadores) para a introdução entre outros de DNA estranho no genoma do animal. Esses vetores permitem a propagação de genes selecionados e sua modificação apropriada, dependendo do tipo de pesquisa que é realizada. O termo "animal transgênico" foi introduzido por Gordon e Ruddle3.
A primeira espécie amplamente aceita que foi usada em neurobiologia, fisiologia, farmacologia, toxicologia e muitos outros campos das ciências biológicas e médicas foi o rato norueguês Rattus norvegicus4. No entanto, devido à dificuldade em manipular embriões de ratos, o rato musculus da casa tornou-se a espécie animal dominante na pesquisa genética5. Outra razão para a primazia do camundongo em tal pesquisa foi a disponibilidade de tecnologia de células-tronco embrionárias para gerar animais eliminados para esta espécie. A técnica mais utilizada de transgênese (2-10% dos descendentes transgênicos em relação a todos os animais nascidos) é a microinjeção de fragmentos de DNA em um pronúcleo de um oócito fertilizado. Em 1990, essa abordagem, que foi introduzida pela primeira vez em camundongos, foi adaptada para ratos6,7. A transgênese de ratos por injeção pronuclear é caracterizada pela menor eficiência8 em relação aos camundongos, o que está estritamente relacionado com a presença de plasma elástico emembranaspronuclear9 . Embora a sobrevivência dos embriões após a manipulação seja 40-50% menor do que em camundongos, essa técnica é considerada um padrão na geração de ratos geneticamente modificados10. Abordagens alternativas que podem garantir a incorporação transgênica eficiente e maiores taxas de sobrevivência de zigotes injetados têm sido investigadas.
O principal determinante da expressão transgênica estável e transmissão à prole é sua integração ao genoma celular hospedeiro. Os lentivírus (LVs) têm a característica distinta de serem capazes de infectar células divisórias e não divisórias. Seu uso como ferramenta para a incorporação de genes heterólogos em embriões provou ser altamente eficiente11, e os indivíduos transgênicos são caracterizados pela expressão estável do fragmento de DNA incorporado. A eficácia dos vetores lentivirais foi confirmada para a modificação genética de camundongos12,13, ratos12,14, e outras espécies11. Neste método, a suspensão lv é injetada sob a zona pellucida do embrião na fase de dois pronucleis. Esta técnica essencialmente garante 100% de sobrevivência dos embriões porque o oolema permanece inalterado. A produção de suspensões lv de alta qualidade e relativamente altamente concentradas são fatores cruciais. No entanto, concentrações mais baixas de suspensões de LV podem ser superadas por injeções repetidas11, o que aumenta a quantidade de partículas virais na superfície do ovo, sem afetar a integração da membrana. Embriões que são submetidos a injeções repetidas no espaço perivitelline desenvolvem-se ainda mais, e descendentes transgênicos podem transmitir o transgene através da germinação. A eficiência da geração transgênica de ratos por transgênese lentiviral pode ser de até 80%12.
Aqui, descrevemos a produção de lentivírus recombinante derivado do HIV-1 que foi pseudodigitado com proteína envelope de estomatite vesicular (VSV) G. O uso do pseudotipo VSV de segunda geração determina a ampla infectividade das partículas virais e permite a produção de vetores altamente estáveis que podem ser concentrados por ultracentrifugação e criopreservação. Após a verificação do título, os vetores estão prontos para serem usados como um veículo para a entrega de transgênicos em zigotes de rato Albino Wistar. Após uma série de injeções, os embriões podem ser cultivados durante a noite e transferidos no estágio de duas células para mães adotivas. Neste ponto, uma das duas abordagens alternativas pode ser considerada. O procedimento padrão utiliza fêmeas pseudográvidas como receptores de embriões. No entanto, quando a taxa de gravidez é baixa após o acasalamento com machos vasectomizados, os embriões podem ser implantados em fêmeas grávidas wistar/sprague-dawley (SD) que são acasaladas com ratos machos férteis com uma cor de pele escura (por exemplo, ratos da Noruega Marrom [BN)." A cor da pele permite a distinção da prole da gravidez natural de descendentes que se originam dos embriões manipulados transferidos.

<table><tbody><tr><td>7500 Sistema de PCR em Tempo Real</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aerrane (isoflurano)</td><td>Baxter</td><td>FDG9623</td><td></td></tr><tr><td>Conjuntos de tubos aspiradores para pipetas microcapilares calibradas</td><td>Sigma</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Atipam 5 mg/ml</td><td>Eurovet Animal Health BV</td><td>N/A</td><td>0,5 mg/kg</td></tr><tr><td>Baytril 25 mg/ml (enrofloksacin)</td><td>Bayer</td><td>N/A</td><td>5-10 mg/kg</td></tr><tr><td>Capilares de vidro borossilicato com filamento GC100TF-15</td><td>Harvard Apparatus Limited</td><td>30-0039</td><td>injeção capilar</td></tr><tr><td>Bupivacaína 25 mg/ml</td><td>Advanz Pharma</td><td>N/A</td><td>0,25% em&nbsp; 0,9% NaCl</td></tr><tr><td>Butomidor 10 mg/ml (butorfanol&nbsp; tartarato)</td><td>Orion Pharma</td><td>N/A</td><td>1 mg/kg</td></tr><tr><td>CELLSTAR Placa de Cultura de Células de Tecido 35-mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627160</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Cultura de Células de Tecido CELLSTAR 60-mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>CellTram Oil</td><td>Eppendorf</td><td>5176 000.025</td><td></td></tr><tr><td>Cepetor (Medetomidina) 1 mg/ml</td><td>cp-pharma</td><td>N/A</td><td>0.5 mg/kg</td></tr><tr><td>Chorulon, Gonadotrofina Coriônica Humana&nbsp;</td><td>Intervet</td><td>N/A</td><td>150 UI/ml ml 0,9% NaCl</td></tr><tr><td>DMEM baixa glicose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6048</td><td></td></tr><tr><td>DNase, livre de RNase</td><td>A& A Biotechnology</td><td>1009-100</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax Óleo Mineral Leve Filtrado</td><td>Sigma</td><td>ES-005-C</td><td></td></tr><tr><td>Envelope protein coding plasmid para vetores lentivirais (VSVg plasmid)&nbsp;</td><td>ADDGENE</td><td>14888</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet</td><td>Eppendorf</td><td>4i /5252 000.013</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9665-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Folligon, Égua Grávida' s Gonadotrofina sérica&nbsp;</td><td>Intervet</td><td>N/A</td><td>125 UI/ml em células HEK</td></tr><tr><td>293T</td> de NaCl de 9%<td>ATCC</td><td>ATCC CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidase de testículo bovino</td><td>Sigma</td><td>H4272-30MG</td><td>0.5 mg/ml em microscópio invertido médio M2</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina 100mg/ml</td><td>Biowet Pulawy</td><td>N/A</td><td>50 mg/kg</td></tr><tr><td>Parafina Líquida</td><td>Merck Millipore</td><td>8042-47-5</td><td></td></tr><tr><td>M16 médio EmbryoMax</td><td>Sigma</td><td>MR-016-D</td><td></td></tr><tr><td>M2 médio</td><td>Sigma</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Magnésio 1M</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63069-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Óleo Mineral Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>M8410-500ML</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 0.9%</td><td>POLPHARMA OTC</td><td>N/A</td><td>estéril, ampolas de 5ml</td></tr><tr><td>Microscópio de operação&nbsp;</td><td>Inami Ophthalmic Instruments</td><td>Deca-21</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de embalagem que codifica plasmídeo para vetores lentivirais&nbsp; (plasmídeo delta R8.2)</td><td>ADDGENE</td><td>12263</td><td></td></tr><tr><td>PEI reagente (Polietilenimina, Mw ~ 25,000,),</td><td>Polysciences, Inc</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0781-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tamponado com Fosfato Salino, pH 7.4, líquido, filtrado estéril, adequado para cultura de células</td><td>Sigma Aldrich</td><td>806552-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Extracter&nbsp;</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Reflex Clip Applier/Reflex Clips</td><td>World Precision Instruments</td><td>500345/500346</td><td></td></tr><tr><td>Safil, ácido poliglicólico, trançado, revestido, fios absorvíveis</td><td>B.Braun Estereomicroscópio Cirúrgico</td><td>1048029</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr> Linha de <tr><td>Costura Cirúrgica</td><td>B.Braun&nbsp;</td><td></td><td></td>C1048040</tr><tr><td>SYBR Green PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystem</td><td>4334973</td><td></td></tr><tr><td>Tolfedine 4% (ácido tolfenâmico)</td><td>Vetoquinol</td><td>N/A</td><td>2 mg/kg</td></tr><tr><td>TransferMan NK2</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA solução</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3924-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima L-100 XP&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>VacuTip</td><td>Eppendorf</td><td>5175108.000</td><td>suportes capilar</td></tr><tr><td>Vita-POS</td><td>Ursapharm</td><td>N / A</td><td>pomada para os olhos</td></tr><tr><td>Placa de aquecimento</td><td>Semic</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Relojoeiro Fórceps</td><td>VWR</td><td>470018-868</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de ratos transgênicos usando uma abordagem vetorial lentiviral

Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach

Modelos animais transgênicos são fundamentalmente importantes para a pesquisa biomédica moderna. A incorporação de genes estrangeiros em embriões de camundongos ou ratos primitivos é uma ferramenta inestimável para a análise da função genética em organismos vivos. O método de transgênese padrão é baseado na microinjeção de fragmentos de DNA estranho susceptante em um pronúcleo de um oócito fertilizado. Esta técnica é amplamente utilizada em camundongos, mas permanece relativamente ineficiente e tecnicamente exigente em outras espécies animais. O transgene também pode ser introduzido em embriões em estágio unicelular através de infecção lentiviral, fornecendo uma alternativa eficaz às injeções pronuclears padrão, especialmente em espécies ou cepas com uma estrutura de embriões mais desafiadora. Nesta abordagem, uma suspensão que contém vetores lentivirais é injetada no espaço perivitelline de um embrião de rato fertilizado, que é tecnicamente menos exigente e tem uma taxa de sucesso maior. Os vetores lentivirais mostraram incorporar eficientemente o transgene no genoma para determinar a geração de linhas transgênicas estáveis. Apesar de algumas limitações (por exemplo, requisitos de Biossegurança Nível 2, limites de tamanho do fragmento de DNA), a transgênese lentiviral é um método de transgênese rápida e eficiente. Além disso, o uso de ratos fêmeas que são acasalados com uma cepa masculina fértil com uma cor de pele dominante diferente é apresentado como uma alternativa para gerar mães adotivas pseudográvidas.

Utilizando-se o protocolo descrito aqui, foram produzidos vetores lentivirais que carregavam o construto Syn-TDP-43-eGFP (título de LV físico = 3,4 x 108/μL) e, em seguida, poderiam ser utilizados para injeções subzonais de embriões em estágio de célula. Apenas embriões com duas pronucéis visíveis foram submetidos ao procedimento. O número de injeções de suspensões virais foi determinado experimentalmente. Alta eficiência de implantação e falta simultânea de descendentes transgênicos foram considerados indicad...

Este artigo tem como objetivo fornecer a metodologia para transgênese lentiviral em embriões de ratos usando múltiplas injeções de uma suspensão do vírus no espaço de perivitelline zigogote. Ratos fêmeas que são acasalados com uma cepa masculina fértil com uma cor de pele dominante diferente é usado para gerar mães adotivas pseudográvidas.

Geração de ratos transgênicos usando uma abordagem vetorial lentiviral

Transgenic animal models are fundamentally important for modern biomedical research. The incorporation of foreign genes into early mouse or rat embryos is ...

Animais transgênicos são fundamentais para a pesquisa biomédica moderna, pois permitem estudos da função genética em organismos vivos. Vários métodos de modificações genéticas têm sido aplicados em estudos em animais. Aqui, apresentamos uma técnica amplamente acessível e eficaz que utiliza vetores lentivirais como ferramenta de incorporação transgênica no genoma de um embrião de rato.Após a administração de gonadotropina coriônica humana, mate cinco semanas de idade Wistar ratos fêmeas um-para-um com sexualmente fértil machos Wistar de três a 10 meses de idade. Às oito às 10.m da manhã seguinte, verifique as fêmeas para a presença de um plugue vaginal e colde os ovidutos das fêmeas com um plugue de acasalamento por no máximo 10.m.em um prato de coleta contendo meio M2 pré-aquecido. Quando todos os ovidutos tiverem sido coletados, transfira os tecidos para um prato de 35 milímetros contendo meio M2 pré-aquecido complementado com 0,5 miligramas por mililitro de hialuronidase de testículos bovinos e coloque o prato sob um microscópio estéreo. Use fórceps finos para abrir as paredes do oviduto e pressione a ampulla até que os embriões sejam libertados.Para facilitar a liberação dos embriões das células cumulus, use uma pipeta de transferência de vidro conectada a um tubo aspirador operado pela boca para in pipeta suavemente os embriões para cima e para baixo. Quando todos os embriões tiverem sido liberados, lave as células algumas vezes em meio M2 fresco para remover a hialuronidase e detritos celulares. Transfira os embriões para 50 gotas de microliter individuais de meio M16 pré-equilibrado coberto por óleo mineral em um prato de 60 milímetros.Em seguida, coloque o prato em uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius com uma atmosfera de dióxido de carbono de 5% até sua injeção. Para microinjeção vetorial lentiviral sob a zona pellucida dos embriões de estágio de uma célula, use um puxador de pipeta para preparar capilares de vidro borossilicato de microinjeção com um filamento. Depois de cada vez que o filamento é alterado ou um novo capilar de vidro é usado, execute um teste de rampa para definir os parâmetros ideais.Em seguida, use uma ponta de microcarregador para carregar aproximadamente dois microliters de solução lentiviral recém-descongelada por pipeta de microinjeção sob uma capa de fluxo laminar de biossegurança. Adicione uma gota de 100 microliter de m2 médio ao centro da tampa de uma placa de Petri de 60 milímetros. Cubra o meio com óleo mineral e monte a pipeta de retenção e o vírus carregou capilar de microinjeção em um micromanipulador.Coloque o prato de microinjeção sob um microscópio invertido e transfira de 15 a 20 embriões de estágio de uma célula para a gota M2 no prato de microinjeção. Capture um embrião com a pipeta de retenção e use a ampliação 400 vezes e o capilar de vidro para injetar a solução lentiviral sob a zona pellucida no espaço perivitelline segurando o capilar sob a zona pellucida por um momento após a entrega do vírus. Quando todos os embriões forem injetados, use uma pipeta fina para devolver as células injetadas ao prato de cultura e devolver o prato à incubadora de cultura celular até sua implantação.Para preparar as mães adotivas para a transferência de embriões, mate fêmeas sexualmente maduras de Sprague-Dawley com machos vasectomizados e verifique as fêmeas na manhã seguinte para um plugue vaginal. Depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal nas fêmeas anestesiadas com um plugue viável, aplique pomada nos olhos do animal e raspe a pele da parte de trás de cada animal. Coloque o primeiro rato na posição propensa em uma superfície limpa em uma almofada de aquecimento sob um microscópio cirúrgico.Cubra o rato com uma cortina estéril com um pequeno orifício cortado sobre a parte inferior das costas e faça uma incisão de pele de aproximadamente dois centímetros paralela à coluna vertebral lombar. Use uma tesoura afiada para fazer um corte na parede abdominal e use fórceps para agarrar uma almofada de gordura ovariana. Puxe o ovário e oviduto para fora da cavidade abdominal em um pedaço de gaze encharcada de cloreto de sódio de 0,9%.Carregue m2 médio, três bolhas de ar, e os embriões em uma transferência capilar. Use microscisores para fazer uma pequena incisão no oviduto entre o infundibulum e ampulla e inserir a ponta da pipeta de transferência na incisão. Expulse suavemente os embriões e bolhas de ar para dentro do oviduto, em seguida, use fórceps contundentes para colocar o trato reprodutivo de volta na cavidade abdominal.Suturar a parede abdominal com suturas absorvíveis de ácido poliglicólico e fechar a incisão da pele com clipes de ferida e colocar o animal em uma gaiola limpa em uma placa de aquecimento com monitoramento até a recumbência total. Para vasectomizar potenciais companheiros, depois de preparar o rato macho para cirurgia como demonstrado, use 70% de etanol e um esfoliante cirúrgico para desinfetar a pele sobre os testículos. Pressione suavemente o abdômen para expor os testículos no saco escrotal e cubra o rato com uma cortina estéril com um pequeno orifício sobre o local cirúrgico e use uma tesoura escrotal para fazer uma incisão de 0,5 centímetros no meio do saco.Empurre cuidadosamente o testífero para a esquerda e localize os vasos deferimento entre os testíferos e a linha média como um duto branco com um único vaso sanguíneo. Use fórceps para puxar suavemente os vasos aferir do saco escrotal e segurar o vaso com fórceps, use uma tesoura fina para remover um fragmento de um centímetro do duto. Repita o procedimento para o segundo teste como apenas demonstrado e feche a pele com suturas absorvíveis de ácido poliglicólico.Em seguida, coloque o rato em uma gaiola limpa em uma placa de aquecimento com monitoramento até a recumbência total. Neste experimento representativo em que embriões únicos foram injetados várias vezes, oito ratos nasceram de embriões que foram injetados duas vezes, três dos quais foram confirmados para transportar o transgene. Um dos fundadores não transferiu o transgene para a prole e três fêmeas adotivas foram usadas para cada configuração experimental.A abordagem escolhida permitiu a geração de linhas de ratos transgênicos estáveis que expressavam a proteína de fusão TDP-43-eGFP sob o controle da sinapse neuronal em um promotor em todo o sistema nervoso central. A transgênese baseada em lentivírus resultou em uma única inserção de cópia do transgêgênio, como demonstrado pelo PCR quantitativo. Quando este método foi utilizado para outros vetores lentivirais, observou-se uma taxa de sobrevivência de aproximadamente 90%.A porcentagem de embriões que sobreviveram às injeções pronucleares foi significativamente menor. No geral, esses resultados sugerem que ratos gestantes podem ser usados como mães adotivas com uma eficiência comparável. Notavelmente, os dados numéricos analisados para rodadas individuais de microinjeção indicaram que a eficácia da implantação dependia diretamente do número de injeções em um embrião e indiretamente na carga viral.O uso de vetores lentivirais garante a integração genômica e a transmissão do transgênico e facilita uma alta taxa de sobrevivência dos embriões micromanípulos mesmo quando múltiplas injeções subdérmicas são realizadas. Este procedimento pode ser efetivamente aplicado a outras espécies e pode ser considerado uma alternativa para a transgênese convencional.

generation-of-transgenic-rats-using-a-lentiviral-vector-approach

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Vectores de expressão lentivirais são os veículos mais eficazes para expressando estavelmente diferentes moléculas efectoras ou construções repórter em divisão e não se dividem as células de mamíferos e organismos inteiros. Aqui nós fornecemos um protocolo sobre como empacotar construções de expressão lentivector em partículas pseudoviral e transdução de células alvo, utilizando as partículas pseudoviral.

Embalagem HIV-FIV ou à base de construções de expressão e Lentivector Transdução de Partículas Pseudotyped VSV-G virais

Neste protocolo descrevemos produção, purificação e titulação de lentivirais. Nós fornecemos um exemplo de entrega do gene lentiviral vetor mediada em primárias neurônios cultivados e astrócitos. Nossos métodos podem também se aplicam a outros tipos de...

Produção de lentivirais para Células Transdução do Sistema Nervoso Central

Este vídeo descreve a injeção pronuclear de vetores lentivirais no espaço perivitelino de um embrião de camundongo fertilizado. O lentivírus contém o transgene, que é incorporado ao genoma do embrião fertilizado, dando origem a camundongos transgênicos.

Injeção de perivitelina baseada em vetor lentiviral: um método para transduzir o gene de interesse em oócitos de camundongo unicelular fertilizados

Fonte: Keefe, K. M., et al. A injeção direta de um vetor lentiviral destaca várias vias motoras na medula espinhal do rato. J. Vis. Exp. (2019).Este vídeo demonstra a injeção de um vetor viral de transporte retrógrado altamente eficiente (HiRet) na medula espinhal de ratos para rastrear as vias neuronais. O vírus possui glicoproteínas para entrada sináptica e um gene codificador de proteína fluorescente. A agulha é inserida na medula espinhal e a suspensão do vírus é administrada a uma taxa...

Uma injeção de vetor viral na medula espinhal de rato para rastreamento neuronal retrógrado

Genes podem ser manipulados durante o desenvolvimento do córtex ou do hipocampo do rato via in utero eletroporação (IUE) em E16, para permitir modificações rápidas e direcionadas na conectividade neuronal para estudos posteriores do comportamento ou neuropatologia em animais adultos. Pós-natal em imagem in vivo para o controle do sucesso IUE é realizada por bioluminescência de ativar luciferase cotransfectados.

Geração de topicamente transgênicas Rats por<em&gt; In utero</em&gt; Eletroporação e<em&gt; In vivo</em&gt; Triagem Bioluminescência

Este manuscrito descreve como a entrega de genes locais mediada por vetores virais fornece uma maneira atraente de expressar transgenes no sistema nervoso central.  O protocolo descreve todas as etapas cruciais para realizar uma injeção de vetor viral na substância negra do rato para desenvolver um modelo animal baseado em vetor viral para a doença de Parkinson.

Desenvolvimento de um modelo de rato baseada alfa-sinucleína para a doença de Parkinson por meio de injecção estereotáxica de um vector viral recombinante adeno-associado

Métodos para uma entrega de gene em larga escala do SNC em ratos são cobertos. Neste exemplo, o propósito é imitar uma doença que afeta a todo da medula espinhal. A transdução generalizada pode ser usada para fornecer uma proteína terapêutica ao SNC, desde uma única administração periférica.

Métodos e dicas para administração intravenosa de vírus Adeno-associado aos ratos e avaliação do sistema nervoso Central transdução

Aqui, apresentamos um protocolo para promover a integração do transgene e produção de ratos transgénicos fundador com eficácia elevada por uma simples injeção de um vetor de Lentivirus no espaço de um oócito fertilizado perivitelline.

Particulas de Lentivirus mediada produção de camundongos transgênicos: um método simples e altamente eficiente para estudo direto dos fundadores

Este protocolo demonstra a injeção de um vetor viral retrogradely transportável em tecido de medula espinhal de ratos. O vetor é tomado no sinapse e transportado para o corpo celular dos neurônios do alvo. Este modelo é apropriado para rastreamento retrógrado de importantes vias da coluna vertebral ou células alvos para aplicações da terapia de gene.

Injeção direta de um vetor de Lentivirus destaca várias vias motoras na medula espinhal de ratos

O presente protocolo descreve métodos de expressão transgênica em corações de ratos e camundongos por injeção intramiocárdica direta do vírus sob orientação ecocardiográfica. Métodos para a avaliação da suscetibilidade de corações a arritmias ventriculares pela estimulação elétrica programada de corações isolados, perfundidos por Langendorff, também são explicados aqui.

Expressão Transgênica Viral em Corações de Roedores e Avaliação do Risco de Arritmia Cardíaca

Este protocolo apresenta uma abordagem otimizada para a produção de modelos de ratos geneticamente modificados. O vírus adenoassociado (AAV) é usado para entregar um modelo de reparo de DNA, e a eletroporação é usada para entregar reagentes CRISPR-Cas9 para completar o processo de edição do genoma em embrião de 2 células.

CRISPR-Cas9 Edição Genômica de Embriões de Rato usando Vírus Adenoassociado (AAV) e Eletroporação de Embriões de 2 Células

Aprenda a técnica de transgênese lentiviral em embriões de ratos para engenharia genética. Este método acessível permite a incorporação eficiente de transgenes no genoma, facilitando estudos de função gênica em organismos vivos.

Geração de ratos transgênicos usando uma abordagem vetorial lentiviral

Explorar mais vídeos