Name: Imunohistoquímica do Monte Inteiro em Embriões e Larvas de Zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Aprenda imunohistoquímica de monte inteiro em embriões e larvas de zebrafish para visualização de proteínas em tecidos intactos. Esta técnica permite observar padrões de expressão proteica em três dimensões usando microscopia confocal.

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Financiamento do NIH conceder 8P20GM103436 14.

Os procedimentos para trabalhar com adultos e embriões de criação de zebrafish descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Estadual murray.
1. Coleta e Fixação de Embriões
<ol><li>Prepare tanques de desova colocando pares sexuais mistos de zebrafish adultos ou grupos em tanques com uma malha ou forro ranhurado cheio de água do sistema durante a noite.</li>
	<li>Nas luzes acesas, troque a água do tanque de desova para água do sistema fresco para remover fezes. Use um ciclo escuro claro de 14 h/10 h com luzes acesas às 9h.</li>
	<li>Uma vez que os ovos são colocados, devolva os adultos para tanques domésticos.</li>
	<li>Colete ovos desenhando-os usando um pipet de transferência ou despejando-os em um filtro de malha.</li>
	<li>Transfira os ovos para pratos petri preenchidos no meio do caminho com meio embrião (como 30% danieau ou e2 meio embrião com 0,5 mg/L azul metileno), limitando o número de embriões por prato a 50.</li>
	<li>Remova todos os ovos que estejam mortos ou não se dividam. NOTA: Embriões mortos podem ser facilmente identificados à medida que se tornam opacos e muitas vezes parecem "nublados". Se o azul metileno for adicionado ao meio embrionário, os embriões mortos assumem uma aparência azul escura.</li>
	<li>Incubar pratos de ovos a 28,5 °C até chegarem ao estágio desejado. Para este experimento, levante os embriões até 23 hpf.</li>
	<li>Opcional) Transfira os embriões em 24 hpf para 200 μM 1-phenyl 2-thiourea (UPt) em meio embrionário para evitar a melagênese16,17. Alternativamente, embriões alvejantes pós-fixação (ver seção 5 opcional).</li>
	<li>Troque o meio embrião ou o PTU médio diariamente.</li>
	<li>Embriões decorionados sem eclosão usando fórceps ultra-finas um estereótipo. Alternativamente, embriões quimicamente dechorionatos incubando em 1 mg/mL Pronase em meio embrião por vários minutos à temperatura ambiente. Remova os embriões da Pronase e lave três vezes com meio embrião.</li>
	<li>Embriões descorados vão ficar com plástico. Mantenha-os em pratos de petri de vidro ou plástico revestidos com 1-2% de agarose dissolvida em meio embrião. Mova embriões descoionados usando tubos pasteur polidos pelo fogo para minimizar os danos.</li>
	<li>Transfira os embriões para tubos centrífugas de 1,5 mL usando um tubo de plástico ou polido de fogo.</li>
	<li>Remova o meio embrião com uma micropipeta. Deixe apenas líquido suficiente para cobrir os embriões após cada mudança de fluido.</li>
	<li>Prepare 4% de paraformaldeído (PFA) em 1x soro-tampão de fosfato (PBS) em um capô de fume químico. ATENÇÃO: PfA é um material perigoso. Use luvas e descarte líquidos e sólidos contaminados em áreas designadas.</li>
	<li>Conserte os embriões em 4% pfa para 1-2 h com balanço suave à temperatura ambiente. Alternativamente, conserte os embriões de 4h a noite a 4°C.</li>
	<li>Lave três vezes em 1x PBS + 1% Triton-X (PBTriton) por 5 min.</li>
	<li>Use os embriões imediatamente ou armazene a 4 °C por até 1 semana.</li>
	<li>Para armazenamento a longo prazo, desidratar os embriões em 100% de metanol (MeOH) 2 h ou durante a noite a -20 °C. Guarde os embriões a -20 °C no MeOH por vários meses. CUIDADO: MeOH é um material perigoso. Use luvas e descarte líquidos e sólidos contaminados em áreas designadas.</li>
</ol>2. Preparação de embriões
<ol><li>Reidrate os embriões através de incubações em série à temperatura ambiente.<ol>
<li>Incubar em 75% MeOH/25% 1x PBS por 5 min, balançando.</li>
		<li>Incubar em 50% MeOH/50% 1x PBS por 5 min, balançando.</li>
		<li>Incubar em 25% MeOH/75% 1x PBS por 5 min, balançando.</li>
		<li>Incubar 100% PBTriton por 5 min, balançando.</li>
	</ol>
</li>
	<li>(Opcional) Prepare uma solução de trabalho de proteína k fresca (10 μg/mL em PBTriton) no gelo adicionando 10 μL de estoque de proteinase k recém-descongelado (10 mg/mL).<ol>
<li>Permeabilizar os embriões digerindo até 30 min em Proteinase K. NOTA: O tempo sugerido é <24 hpf: sem digestão; 24 hpf: 15 min digestão; e 7 dias de idade: 30 min digestão.</li>
		<li>Enxágüe embriões permeabilizados em PBTriton e refixação em 4% pfa por 20 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Lave os embriões três vezes em PBTriton por 5 min à temperatura ambiente com balanço suave.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Incubação primária de anticorpos
<ol><li>Selecione uma solução de bloqueio comercial ou soro correspondente à espécie de hospedeiro de anticorpos secundários (ex. 10% soro de cabra em PBTriton) com ou sem 2 mg/mL Bovine Serum Albumin (BSA).</li>
	<li>Bloqueie os embriões na solução de bloqueio por 1-3 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C enquanto balança.</li>
	<li>Incubar em anticorpo primário diluído na solução de bloqueio ou 1% de soro em PBTriton durante a noite a 4 °C enquanto balançava. Neste experimento, os principais anticorpos utilizados foram anti-NMDAR1, receptor anti-pan-AMPA e anti-fosfor-Histone H3, cada um diluído para uma concentração final de 1:500 em 1% de soro de cabra em PBTriton.</li>
	<li>Lave cinco vezes em PBTriton por 10 minutos à temperatura ambiente enquanto balança.</li>
</ol>4. Incubação de anticorpos secundários
<ol><li>Selecione um anticorpo secundário baseado na espécie hospedeira do anticorpo primário e no comprimento de onda desejado.</li>
	<li>Incubar em anticorpo secundário diluído na solução de bloqueio ou 1% de soro por 2 h à temperatura ambiente (ou durante a noite a 4 °C) enquanto balançava. NOTA: Anticorpos secundários fluorescentes são sensíveis à luz. Usamos 1:500 cabra-anti-rato Alexa488 diluído em 1% de soro de cabra em PBTriton.</li>
	<li>Cubra os tubos com papel alumínio ou tampa com uma caixa de bloqueio leve para esta e todas as etapas subsequentes.</li>
	<li>Lave três vezes em PBTriton por 10 min à temperatura ambiente enquanto balança.</li>
	<li>Transfira os embriões para uma solução de glicerol de 50% na PBS sobre um leito de 2% de agarose em meio embrião e prossiga para a documentação ou prossiga para novas etapas de processamento abaixo.</li>
</ol>Etapas opcionais
5. Branqueamento
<ol><li>Prepare a solução alvejante em um tubo de 1,5 mL adicionando 810,7 μL de ddH2O, 89,3 μL de 2 M KOH e 100 μL de 30% H2O2.</li>
	<li>Inverta o tubo três vezes para misturar.</li>
	<li>Pipette 1 mL de direção de solução alvejante para os embriões.</li>
	<li>Abra a tampa do tubo de embrião para permitir que o gás escape. Bata suavemente o tubo no banco para desalojar bolhas.</li>
	<li>Monitore o processo de branqueamento (use um microscópio, se necessário) e pare a reação quando o pigmento for suficientemente removido (aproximadamente 5 min para 24 hpf ou 10 min para 72 hpf).</li>
	<li>Remova cuidadosamente a solução de branqueamento com uma micropipeta e enxágue embriões três vezes em 1 mL de PBTriton. NOTA: Os embriões são pegajosos nesta etapa.</li>
	<li>Proceda para documentação ou mais etapas de processamento abaixo.</li>
</ol>6. Dissecção embrionária e gema
<ol><li>Para remover a gema, transfira uma pequena quantidade (~200 μL ou suficiente para cobrir completamente o embrião, mas restritiva o suficiente para limitar onde ele pode flutuar) de 1x PBS para um slide de depressão ou um escorregador de vidro simples.</li>
	<li>Use um tubo de transferência de plástico para mover 1 ou mais embriões para a gotícula PBS.</li>
	<li>Use fórceps ultrafinos e 00 pinos de inseto para quebrar a gema e raspar muito suavemente grânulos de gema da superfície ventral do embrião (veja também Cheng et al., 2014)18.</li>
	<li>Retire os grânulos de gema e reponha o PBS conforme necessário.</li>
	<li>Repita até que o embrião esteja suficientemente livre de gema.</li>
</ol>7. Montagem plana em slides
<ol><li>Transfira embriões deyolked para um slide de vidro carregado com uma pipeta de plástico ou uma micropipeta de 1 mL com uma ponta aparada (para reduzir o estresse da cisalhamento). Oriente como desejado com uma ponta de micropipette de 200 μL ou pino de inseto.</li>
	<li>Afaste o excesso de PBS com um lenço de Kim ou toalha de papel.</li>
	<li>Adicione 2-3 gotas de mídia de montagem ao slide e deslizamento de cobertura.</li>
	<li>O ar seco por aproximadamente 5 a 10 min.</li>
	<li>Sele o vidro da tampa no escorregador com esmalte claro. NOTA: As bordas do vidro da tampa devem ser completamente cobertas com uma fina camada contínua de esmalte.</li>
	<li>Deixe secar aproximadamente 10 min antes da imagem.</li>
</ol>8. Montagem em Agarose
<ol><li>Prepare 1% de agarose em meio de embrião adicionando 0,5 g de agarose a 50 mL de meio embrião em um frasco ou béquer seguro de micro-ondas de pelo menos 3x volume maior do que o desejado.</li>
	<li>Aqueça em um micro-ondas, girando a cada 30 s, até que a garose seja completamente dissolvida.</li>
	<li>Faça 1 mL alíquotas em tubos centrífugas de 1,5 mL. Guarde as alíquotas à temperatura ambiente.</li>
	<li>Cubra as tampas do tubo com tampas antes de aquecer.</li>
	<li>Coloque tubos de agarose em um suporte de tubo flutuante em um béquer meio cheio de água.</li>
	<li>Micro-ondas o béquer com tubos flutuantes por 2-3 min, ou até que a garose seja completamente derretida.</li>
	<li>Transfira um embrião para o slide ponteado com uma pipeta de plástico ou uma micropipeta de 200 μL com uma ponta aparada (para reduzir o estresse da cisalhamento).</li>
	<li>Posicione o embrião em um deslizamento de cobertura retangular usando pinos de inseto e adicione aproximadamente 20 μL de agarose derretida diretamente ao embrião.</li>
	<li>Oriente rapidamente a região de interesse mais próxima do deslizamento de cobertura usando 00 pinos de inseto. NOTA: Este é um suporte de cabeça para baixo.</li>
	<li>Devolva o tubo de agarose para o tubo de água quente flutuar entre cada uso e micro-ondas conforme necessário.</li>
	<li>Imagem usando um microscópio quando a agarose endurece. Mantenha o embrião montado de cabeça para baixo para uso em um microscópio invertido. Vire o deslizamento de cobertura (assim a agarose está o deslizamento de cobertura) para uso em microscópios eretos.</li>
</ol>9. Montagem em Slides Bridged
<ol><li>Para fazer slides de ponte, cole tampas quadradas no escorregador de vidro usando um pequeno pontilhado de supercola. NOTA: Deve haver um cocho de pelo menos 5 mm de largura entre os deslizamentos de cobertura. Dois #1 deslizamentos de cobertura são tipicamente apropriados para embriões de 24-48 hpf, enquanto três deslizamentos de cobertura de altura podem ser necessários para 72 hpf.</li>
	<li>Transfira 1-2 embriões desyolked para o slide pontecom uma pipeta de plástico ou uma micropipeta de 200 μL com uma ponta aparada (para reduzir o estresse da cisalhamento).</li>
	<li>Afaste o excesso de fluido com um lenço de Kim ou toalha de papel.</li>
	<li>Adicione uma gota de ≥80% de glicerol diretamente ao embrião.</li>
	<li>Cubra com um vidro de cobertura retangular. A gota do glicerol deve tocar no vidro da tampa.</li>
	<li>Adicione mais glicerol ao espaço entre o vidro da tampa e deslize conforme necessário para cobrir completamente o embrião com uma margem de glicerol nas laterais do embrião.</li>
	<li>Deslize o vidro da tampa retangular suavemente para enrolar o embrião em posição para imagem.</li>
</ol>10. Coloração DAB
NOTA: Esta seção começa após a etapa 4.2 acima e substitui o resto da etapa 4.
<ol><li>Incubar os embriões em uma solução de bloqueio com um anticorpo secundário conjugado peroxidase por 2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C enquanto balança.</li>
	<li>Lave três vezes em PBTriton por 10 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Transfira os embriões para uma placa de cultura ou deslizamento de depressão com uma pipeta de transferência.</li>
	<li>Misture 50 μL de 1% DAB (3,3'-diaminobenzidina) dissolvido no DDH2O e 50 μL de 0,3% de peróxido de hidrogênio e leve a 1 mL com PBS. CUIDADO: DAB é um material perigoso. Use luvas e descarte de líquidos e sólidos contaminados da DAB em áreas designadas.</li>
	<li>Cubra embriões manchados de HRP com a solução DAB preparada acima e monitore o desenvolvimento de cores (tipicamente 1-5 min) um microscópio.</li>
	<li>Depois de atingir o nível desejado de desenvolvimento de cores, enxágue os embriões brevemente na PBS.</li>
	<li>Transfira os embriões de volta para um tubo de 1,5 mL antes da fixação.</li>
	<li>Refixar os embriões por 15-20 min em 4% de PFA em temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave os embriões três vezes em PBTriton por 5 min.</li>
	<li>Proceda para a documentação.</li>
</ol>11. Protocolo modificado para tecido seccionado de manchas que é montado em slides
<ol><li>Tecido de cerca para ser manchado com uma caneta pap.</li>
	<li>Transfira os slides para uma câmara úmida.</li>
	<li>Adicione 1 mL de PBS diretamente ao slide.</li>
	<li>Incubar 7 min à temperatura ambiente para remover o meio de incorporação.</li>
	<li>Despeje o PBS invertendo slide.</li>
	<li>Reidratar 1 min em até 1 mL de tampão TNT (100 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0,1% Tween20).</li>
	<li>Bloqueie em até 1 mL de solução de bloqueio (comercial ou 10% soro + 2% BSA) por 1 h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubar durante a noite em anticorpo primário diluído em 1% soro ou solução de bloqueio a 4 °C.</li>
	<li>Lave cinco vezes em até 1 mL de tampão TNT à temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubar em anticorpo secundário por 2h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4°C. Cubra a câmara com papel alumínio ou use uma tampa escura.</li>
	<li>Lave cinco vezes em TNT à temperatura ambiente. Despeje a última lavagem.</li>
	<li>Montar com 2-3 gotas de montagem média e tampa. Vamos sentar 5-10 min.</li>
	<li>Sele o vidro da tampa no escorregador usando esmalte claro. Deixe secar completamente antes da imagem.</li>
</ol>12. Documentação
<ol><li>Registre o procedimento completo e quaisquer desvios em um caderno de laboratório.</li>
	<li>Registre a concentração, nome, número do catálogo, fabricante e número de lote do anticorpo primário.</li>
	<li>Coloque a amostra apropriadamente montada no palco do microscópio. Localize a região de interesse.</li>
	<li>Selecione um exemplo relativamente brilhante. Defina a exposição da câmera e ganhe para que o sinal seja suficientemente brilhante sem saturar.</li>
	<li>Compare a intensidade de coloração da mesma região de interesse usando os mesmos ajustes de exposição quando comparar entre embriões experimentais rotulados por anticorpos e anticorpos de controle (ex. IgG).</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm informações para divulgar.

Imunohistoquímica é uma ferramenta versátil que pode ser usada para caracterizar a expressão spatio-temporal de praticamente qualquer proteína de interesse em um organismo. A imunohistoquímica é usada em uma grande variedade de tecidos e organismos modelo. Este protocolo foi otimizado para uso em zebrafish. A imunohistoquímica em diferentes espécies pode exigir diferentes técnicas de fixação e manuseio, bloqueando soluções dependendo das espécies e a presença de peroxidases endógenas, e tempos de incubação devido à espes...

O zebrafish (Danio rerio) emergiu como um modelo poderoso para o estudo de processos biológicos por várias razões, incluindo curto tempo de geração, desenvolvimento rápido e comodidade às técnicas genéticas. Como resultado, os zebrafish são comumente usados em telas de moléculas pequenas de alto nível para pesquisa toxicológica e descoberta de drogas. Os zebrafish também são um modelo atraente para o estudo dos processos de desenvolvimento, dado que uma única fêmea pode produzir rotineiramente 50-300 ovos por vez e os embriões opticamente claros desenvolvem-se externamente permitindo uma visualização eficiente dos processos de desenvolvimento. No entanto, as primeiras pesquisas se basearam principalmente em telas genéticas avançadas usando N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) ou outras mutagens devido a desafios no estabelecimento de técnicas genéticas reversas. Cerca de duas décadas atrás, morfinas foram usadas pela primeira vez em zebrafish para derrubargenes1 . Morfinas são pequenos oligonucleotídeos antisenseque inibem a tradução do alvo mRNA após microinjeção em um embrião em um estágio inicial de desenvolvimento. Uma grande fraqueza dos morfolinos é que eles são diluídos à medida que as células se dividem e geralmente perdem eficácia por 72 horas após a fertilização (hpf). Enquanto morfinanos continuam sendo uma ferramenta poderosa para a interrupção do gene zebrafish, os núcleos eficazes ou causadors de transcrição (TALENs), núcleos de zinco-finger (ZFNs) e repetos curtos e regularmente interespaçados (CRISPRs) estão sendo usados mais recentemente para atingir diretamente o genoma do zebrafish2,3. Essas estratégias genéticas reversas, combinadas com a genética avançada e telas de alto nível, estabeleceram o zebrafish como um modelo poderoso para estudar a expressão genética e a função.
A capacidade de estudar a função genética geralmente requer uma avaliação da distribuição spatio-temporal da expressão do produto genético ou genético. As duas técnicas mais utilizadas para visualizar tais padrões de expressão durante o desenvolvimento precoce estão na hibridização situ (ISH) e toda a imunohistoquímica do monte (IHC). No situ a hibridização foi desenvolvida pela primeira vez em 1969 e conta com o uso de sondas de RNA antisense rotuladas para detectar a expressão mRNA em um organismo4. Em contraste, anticorpos rotulados são usados na imunohistoquímica para visualizar a expressão proteica. A ideia de rotular proteínas para detecção remonta aosanos 5 da década de 1930 e o primeiro experimento iHC foi publicado em 1941, quando anticorpos rotulados pela FITC foram usados para detectar bactérias patogênicas em tecidos infectados6. Ish e IHC evoluíram e melhoraram significativamente nas décadas seguintes e agora são utilizados rotineiramente no laboratório de pesquisa molecular e diagnóstico7,8,9,10,11. Embora ambas as técnicas tenham vantagens e desvantagens, o IHC oferece vários benefícios sobre o ISH. Na prática, o IHC é muito menos demorado do que o ISH e geralmente é menos caro dependendo do custo do anticorpo primário. Além disso, a expressão mRNA nem sempre é uma métrica confiável de expressão proteica como tem sido demonstrado em camundongos e humanos que apenas cerca de um terço da variação de abundância de proteínas pode ser explicada pela abundância mRNA12. Por essa razão, o IHC é um suplemento importante para confirmar os dados ish, quando possível. Finalmente, o IHC pode fornecer dados subcelulares e de colocalização que não podem ser determinados pelo ISH13,14,15. Aqui, descrevemos um método passo a passo para detectar de forma confiável proteínas por imunohistoquímica em embriões e larvas de zebrafish de monte inteiro. O objetivo desta técnica é determinar a expressão espacial e temporal de uma proteína de interesse em todo o embrião. Esta tecnologia utiliza anticorpos primários específicos de antígenos e anticorpos secundários fluorescentes marcados. O protocolo é prontamente adaptável para usar em seções de tecido montados em slides e para uso com substratos cromosgênicos em vez de fluorescência. Usando este protocolo, demonstramos que o desenvolvimento de músculos esqueléticos de zebrafish expressa receptores glutamato ionotrópicos, além de receptores de acetilcolina. Subunidades receptoras glutamato do tipo NMDA são detectáveis no músculo longitudinal a 23 hpf.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160-100</td><td></td></tr><tr><td>Folha de alumínio, resistente</td><td>Kirkland</td><td></td><td>Qualquer marca pode ser substituída Anticorpo</td></tr><tr><td>anti-NMDA</td><td>Millipore Sigma</td><td>MAB363</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fosfo-histona H3 (Ser10), clone RR002</td><td>Millipore Sigma</td><td>05-598</td><td></td></tr><tr><td>Receptor anti-pan-AMPA (GluR1-4)</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td></td>MABN832</tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de Cálcio [Ca(NO3)2]</td>Tubos de centrífuga <td>Sigma Aldrich</td><td>C4955</td><td></td></tr><tr><td>, 1,5 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT150C</td><td></td></tr><tr><td>Esmalte transparente</td><td>Sally Hanson</td><td></td><td>Qualquer esmalte ou endurecedor pode ser substituído</td></tr><tr><td>Depressão (concavidade) slide</td><td>Electron Miscroscopy Sciences</td><td>71878-01</td><td></td></tr><tr><td>Diaminobenzidina</td><td>Thermo Scientific</td><td>1855920</td><td></td></tr><tr><td>Meio embrionário, Danieau, 30%</td><td></td><td></td><td>17,4 mM NaCl, 0,21 mM KCl, 0,12 mM MgS04, 0,18 mM Ca(NO3)2, 1,5 mM HEPES em água ultrapura.</td></tr><tr><td>Meio embrionário, E2</td><td></td><td></td><td>7,5 mM NaCl, 0,25 mM KCl, 0,5 mM MgSO4, 75 &mu; M KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0,5 mM CaCl2, 0,35 mM NaHCO3, 0,5 mg/L azul de metileno</td></tr><tr><td>Suporte de tubo flutuante</td><td>Thermo Scientific</td><td>59744015</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio composto de fluorescência</td><td>Leica Biosystems</td><td>DMi8</td> Estereomicroscópio de fluorescência Leica Biosystems DMi8 <td></td></tr><tr><td></td><td> Biosystems</td><td>M165-FC</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro 18 mm x 18 mm</td><td>Corning</td><td>284518</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro 22 mm x 60 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>22-050-222</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-rato IgG Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Solução HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Câmara úmida com tampa</td><td>Simport</td><td>M920-2</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio, 30%</td> <td>Fisher Scientific</td><td>H325-500</td><td></td></tr><tr><td>Immunedge caneta Pap</td><td>Vector labs</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Alfinetes de insetos, tamanho 00</td><td>Stoelting</td><td>5213323</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio (MgSO4 &middot; 7H2O)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63138</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de malha</td><td>Oneida</td><td></td><td>Qualquer marca pode ser substituída</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Azul de metileno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>Micro-tubo cap lock</td><td>Produtos de Pesquisa Internacional</td><td>145062</td><td></td></tr><tr><td>Forno de microondas</td><td>Toastmaster</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I8765</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra normal</td><td>Millipore Sigma</td><td>S02L1ML</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de nutatas</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-044</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Fisher Scientific</td><td>04042-500</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>PBTriton</td><td></td><td></td><td>1% TritonX-100 in 1x PBS</td></tr><tr><td>Permount suporte de montagem</td><td>Fisher Chemical</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri (vidro)</td><td>Pyrex</td><td>3160100</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri (plástico)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>1-fenil 2-tioureia</td><td>Acros Organics</td><td>207250250</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS), 10x, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS), 1x</td><td></td><td></td><td>1x feito de 10x estoque diluído em dH2O</td></tr><tr><td>Cloreto de Potássio (KCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Potássio (KOH)</td><td>Fisher</td><td>P250-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10165921001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Invitrogen</td><td>AM2544</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>Tanque de desova com tampa e inserção</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td></td></tr><tr><td>SuperBlock PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>37515</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost + slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Superglue gel</td><td>3M Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNT</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris, pH 8,0; NaCl 150 mM; 0,1% Tween20; feito em dH2O</td></tr><tr><td>Pipeta de transferência</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Tricloroacético (Cl3CCOOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Pinça ultrafina</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-121</td><td></td></tr><tr><td>Água, ultrapura/duplamente destilada</td><td>Fisher Scientific</td><td>W2-20</td><td></td></tr></tbody></table>

imunohistoquímica do monte inteiro em embriões e larvas de zebrafish

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

A imunohistoquímica é uma técnica amplamente utilizada para explorar a expressão e localização de proteínas durante os estados normais de desenvolvimento e doenças. Embora muitos protocolos de imunohistoquímica tenham sido otimizados para seções de tecido e tecido mamíferos, esses protocolos muitas vezes requerem modificação e otimização para organismos modelos não mamíferos. Os zebrafish são cada vez mais utilizados como um sistema modelo em pesquisas básicas, biomédicas e translacionais para investigar os mecanismos biológicos moleculares, genéticos e celulares dos processos de desenvolvimento. Os zebrafish oferecem muitas vantagens como um sistema modelo, mas também exigem técnicas modificadas para detecção ideal de proteínas. Aqui, fornecemos nosso protocolo de imunohistoquímica de fluorescência em embriões e larvas de zebrafish. Este protocolo descreve além várias diferentes estratégias de montagem que podem ser empregadas e uma visão geral das vantagens e desvantagens que cada estratégia proporciona. Também descrevemos modificações neste protocolo para permitir a detecção de substratos cromosgênicos em tecido de montagem inteiro e detecção de fluorescência no tecido larval seccional. Este protocolo é amplamente aplicável ao estudo de muitas etapas de desenvolvimento e estruturas embrionárias.

Toda a imunohistoquímica da montagem usa anticorpos para detectar o padrão espacial de expressão proteica no animal intacto. O fluxo básico de imunohistoquímica (retratado na Figura 1) envolve a criação de zebrafish, criação e preparação de embriões, bloqueio de antígenos não específicos, o uso de um anticorpo primário específico para antígenos para atingir a proteína de interesse, detectando esse anticorpo primário com um anticorpo secundário rotulado, monta...

Aqui, apresentamos um protocolo para detecção de proteínas mediadas por anticorpos fluorescentes em preparações inteiras de embriões e larvas de zebrafish.

Imunohistoquímica do Monte Inteiro em Embriões e Larvas de Zebrafish

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

A imunohistoquímica de montagem total é uma técnica relativamente rápida e simples que permite a observação espacial e temporal de proteínas diretamente em um tecido ou organismo usando anticorpos rotulados. A utilidade desta técnica é que permite a coloração de um tecido intacto ou de um organismo sem ter que primeiro secioná-lo e a microscopia confocal pode ser usada para gerar uma representação tridimensional do padrão de expressão proteica. A imunohistoquímica é amplamente utilizada em pesquisas biomédicas para entender a etiologia e os mecanismos moleculares que sustentam a doença.É também uma valiosa ferramenta de diagnóstico para identificar tumores em amostras patológicas. Para começar, prepare os tanques de desova cheios de água do sistema e com uma malha ou forro ranhum no lugar. Coloque zebrafish adultos em pares sexuais mistos em grupos nos tanques durante a noite.Use um ciclo claro/escuro de 14 horas/10 horas com luzes acesas às 9h.m. Na manhã seguinte, com as luzes acesas, troque a água do tanque de desova com água fresca do sistema para remover as fezes. Uma vez colocados ovos, devolva os adultos para os tanques domésticos.Colete os ovos desenhando-os usando uma pipeta de transferência. Transfira 50 ovos para cada placa de Petri preenchida no meio do caminho com o meio de embrião. Remova quaisquer ovos opacos e nublados que estejam mortos ou não se dividam.Incubar o prato de ovos a 28,5 graus Celsius até 23 horas após a fertilização. Se os embriões forem mais de 24 horas após a fertilização, com uma pipeta transfira os embriões para 200 PTU micromolar em meio de embrião para prevenir a melanogênese. Sob um microscópio estéreo, descorionato os embriões não-esquesques usando fórceps de ponta ultra fina.Usando pipetas Pasteur polidas em fogo para minimizar os danos, transfira-as para placas de vidro ou petri de plástico revestidas com 1-2% de agarose dissolvida em meio de embrião. Em seguida, transfira os embriões para tubos de centrífuga de 1,5 mililitro usando uma pipeta plástica ou polida pelo fogo. Remova o meio do embrião com uma micropipette.Deixe apenas líquido suficiente para cobrir os embriões. Fixar os embriões em 4%PFA por uma a duas horas com balanço suave à temperatura ambiente. Em seguida, lave os embriões três vezes em 1X PBS e 1%PBTriton por cinco minutos.Use os embriões imediatamente ou armazene a quatro graus Celsius por até uma semana. Para armazenamento a longo prazo, desidrate e armazene os embriões em 100% de metanol a menos 20 graus Celsius. Para reidratar os embriões, realize incubações seriais de cinco minutos cada a temperatura ambiente com quantidades decrescentes de metanol e PBS e PBTriton para a lavagem final.Prossiga com a preparação do embrião de acordo com o manuscrito. Selecione uma solução de bloqueio que corresponda à espécie de hospedeiro de anticorpos secundários, por exemplo 10% de soro de cabra em PBTriton com ou sem dois miligramas por mililitro de BSA. Adicione 0,5 mililitros da solução de bloqueio no tubo contendo o embrião e coloque o tubo em um roqueiro por uma a três horas à temperatura ambiente.Em seguida, incubar o embrião em anticorpo primário diluído em solução de bloqueio e PBTriton durante a noite a quatro graus Celsius enquanto balança. Pela manhã, lave o embrião cinco vezes em PBTriton por 10 minutos cada um em temperatura ambiente enquanto balança. Em seguida, selecione um anticorpo secundário baseado nas espécies hospedeiras do anticorpo primário e no comprimento de onda desejado em 488 nanômetros.Adicione o anticorpo secundário diluído na solução de bloqueio no tubo que contém o embrião. Cubra o tubo com papel alumínio e incubar por duas horas em temperatura ambiente enquanto balança. Depois disso, lave os embriões três vezes em PBTriton por 10 minutos cada um em temperatura ambiente enquanto coberto com papel alumínio e balanço.Com uma pipeta, transfira os embriões para uma solução de 50% de glicerol em PBS sobre um leito de 2% de agarose em meio de embrião. Para remover a gema, transfira 200 microliters de 1X PBS para um slide de depressão ou um escorregador de vidro simples. Use uma pipeta de transferência de plástico para mover um ou mais embriões para a gotícula PBS.Use fórceps ultra finos e pinos duplos zero para quebrar a gema e raspar suavemente grânulos de gema da superfície ventral do embrião. Remova os grânulos da gema e reabasteca com PBS conforme necessário. Após a montagem, coloque a amostra no estágio do microscópio.Localize a região de interesse selecionando um exemplo relativamente brilhante. Ajuste a exposição da câmera e ganhe para que o sinal seja suficientemente brilhante sem saturar. Ao comparar entre os embriões experimentais rotulados por anticorpos e controlar embriões de anticorpos, use as mesmas configurações de exposição.Este protocolo de imunohistoquímica de montagem inteira é uma ferramenta valiosa para o estudo da expressão de proteína espacial e temporal usando o desenvolvimento de zebrafish. A subunidade GluN1 do receptor de glutamato tipo NMDA revelou expressão de subunidades receptoras de glutamato ao longo do desenvolvimento de músculos de zebrafish a 23 horas após a fertilização. Seções congeladas de embriões pós-fertilização de 72 horas foram montadas em lâminas e imunossuadas para fosfo-H3, um marcador de células proliferadoras.Várias células expressaram fosfo-H3 e a expressão foi mais notável nas zonas ventriculares. Anticorpo de controle mouse IgG e excluindo anticorpos primários revelaram um baixo nível de expressão não específica. É importante selecionar soluções de bloqueio apropriadas e anticorpos secundários com base nas espécies de hospedeiros de anticorpos primários para garantir a detecção e minimizar manchas não específicas.A imunohistoquímica deve ser verificada para garantir que o sinal observado seja, na verdade, a proteína de interesse. Experimentos de acompanhamento geralmente envolvem o uso de organismos geneticamente ou ambientalmente modificados. A imunohistoquímica concede aos pesquisadores a capacidade de observar proteínas in situ, acelerando consideravelmente nossa compreensão de inúmeros sistemas na biologia básica e aplicada, particularmente durante o desenvolvimento de embriões.Metanol e formaldeído são tóxicos e devem ser tratados cuidadosamente. Os resíduos precisam ser coletados e descartados de acordo com os procedimentos institucionais.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Montar toda a hibridização in situ é uma das técnicas mais utilizadas em biologia do desenvolvimento. Aqui, apresentamos uma alta resolução de dupla fluorescentes em protocolo de hibridização in situ para analisar o padrão de expressão precisa de um único gene e para determinar a sobreposição dos domínios de expressão dos dois genes. Incluímos uma propidium iodeto nuclear contra-coloração para destacar a organização do tecido.

Zebrafish Whole Mount Alta Resolução Duplo Fluorescente In Situ Hibridização

Uma maneira rápida de realizar imunocoloração do coração embrionário zebrafish é descrito. Em comparação com toda a abordagem montagem imunocoloração, este método aumenta drasticamente a penetração dos anticorpos, o que permite obter imagens de alta resolução que revelam estruturas celulares / subcelulares no coração dentro de um tempo de processamento muito reduzido.

Imunomarcação de Dissecada Coração Zebrafish embrionárias

O peixe-zebra, um pequeno peixe tropical, tornou-se um modelo popular para estudar a função do gene durante o desenvolvimento de vertebrados e doença. A expressão espacial e temporal dos genes alvo pode ser determinada...

Alta resolução Monte Whole<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização dentro embriões Zebrafish para estudar a expressão gênica e função

Processos de desenvolvimento, tais como a proliferação, a modelagem, diferenciação, e a orientação do axónio pode ser facilmente modelada na medula espinal do peixe-zebra. Neste artigo, nós descrevemos um procedimento de montagem para os embriões de peixe-zebra, que otimiza a visualização destes eventos.

Dissecção e montagem lateral de embriões Zebrafish: Análise de Desenvolvimento da Medula Espinhal

O embrião de peixe-zebra é um excelente modelo para investigação em biologia do desenvolvimento. Durante a embriogênese, peixe-zebra desenvolver com uma massa de gema, que apresenta desafios tridimensionais para observação de amostras e análise. Este protocolo descreve como criar bidimensionais planas montagem preparações de toda montagem in situ (desejo) manchadas espécimes embrião de peixe-zebra.

Monte Preparação Plano de observação e análise de amostras de embriões Zebrafish manchado por inteiro Monte<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridização

Técnicas são descritas a imunocoloração fosfo-epitopos em embriões de peixe-zebra inteiros e em seguida, realizar duas cores localização confocal fluorescente em estruturas celulares tão pequenos quanto cílios. As técnicas de fixação e de imagem pode definir a localização e cinética da aparência ou a activação de proteínas específicas.

Imunocoloração fosfo-epitopos em ciliadas Órgãos da Whole Mount embriões Zebrafish

Desenvolvimento de cílios é vital para a organogênese adequada. Este protocolo descreve um método otimizado para rotular e Visualizar células ciliadas do zebrafish.

Visualização de células Multiciliated no Zebrafish através de um protocolo combinado de toda montagem fluorescente In Situ da hibridação e imunofluorescência

Este protocolo demonstra a imunofluorescência seqüencial e immunohistochemistry em Cryosections dos embriões do zebrafish do cedo-estágio permitindo análises precisas da colocalização em populações específicas da pilha.

Imunofluorescência sequencial e imuno-histoquímica em embriões de zebrafish Crioseccionados

Este artigo descreve um método para montar embriões frágeis do zebrafish para a microscopia confocal prolongada do tempo-lapso. Este método de baixo custo é fácil de executar usando pratos regulares de microscopia com fundo de vidro para imagens em qualquer microscópio invertido. A montagem é realizada em camadas de agarose em diferentes concentrações.

Um método de montagem em camadas para a microscopia confocal de lapso de tempo prolongado de embriões zebrafish inteiros

Este protocolo descreve como obter imagens combinando hibridização in situ e imunohistoquímica de cortes embrionários de zebrafish. A hibridização in situ foi realizada antes da criossecção, seguida da coloração de anticorpos. É útil detectar os padrões de expressão de dois genes em peixes-zebra se houver escassez de anticorpos.

In situ Hibridização Combinada com Imunohistoquímica em Embriões de Zebrafish Crioseccionados

Apresentamos aqui um protocolo para imagens in vivo de todo o cérebro de larvas de peixes-zebra usando microscopia de fluorescência tridimensional. O procedimento experimental inclui preparo da amostra, aquisição e visualização das imagens.

In vivo Imagem do cérebro inteiro de larvas de peixe-zebra usando microscopia de fluorescência tridimensional

Aprenda imunohistoquímica de monte inteiro em embriões e larvas de zebrafish para visualização de proteínas em tecidos intactos. Esta técnica permite observar padrões de expressão proteica em três dimensões usando microscopia confocal.

Imunohistoquímica do Monte Inteiro em Embriões e Larvas de Zebrafish

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