Um método revisado para induzir o linfedema secundário no hindlimb dos ratos
2 de novembro de 2019
Este modelo animal permite que os investigadores induzam o linfedema secundário estatìstica significativo no retrospecto dos ratos, durando pelo menos 8 semanas. O modelo pode ser usado para estudar a fisiopatologia do linfedema e para investigar novas opções de tratamento.
O objetivo geral deste método é induzir linfedema secundário consistente na linha de frente dos camundongos sem causar morbidade grave. Este método pode ser usado para induzir linfedema secundário na etapa posterior de camundongos. A principal vantagem deste método é que ele resolve linfedema insignificante que dura pelo menos oito semanas sem causar morbidade grave.
Alguém novo no procedimento pode lutar com as técnicas microcirúrgicas. Por isso, recomendamos treinamento microcirúrgico e diversos procedimentos práticos para garantir um resultado bem-sucedido, mas também para preparar o pesquisador para que ele possa realizar o procedimento de forma mais eficiente. Configure a fonte de radiação e anestesia o rato como descrito no protocolo.
Coloque uma almofada de chumbo de 1,5 milímetros de espessura para garantir que apenas a área que passa por cirurgia seja irradiada. O exemplo mostrado é de um rato pós-operatório para esclarecer a área. Administre uma dose de 10 irradiações cinzas.
Os pesquisadores devem tomar precauções ao trabalhar com radiação. Durante este experimento, toda a irradiação foi realizada em uma sala isolada de radiação. E a fonte de radiação só foi ligada quando todo o pessoal saiu da sala.
Pese o rato antes da cirurgia. Examine a profundidade anestésico por teste de pata ou pinça traseira. Raspe a perna escolhida para o procedimento.
Defina o fluxo de oxigênio para 0,8 Litros por minuto. Conecte-o com um cone de nariz. Aplique pomada oftálmica.
Injete 0,5 mililitros de soro fisiológico subcutâneamente, de preferência no escroto do camundongo para prevenir hipovolemia durante a cirurgia. Coloque o mouse sobre o pano cirúrgico em posição supina. Coloque o cone do nariz sobre o focinho.
Fixar a extremidade dos blocos traseiros suavemente com fita adesiva, para evitar que o rato mude durante a cirurgia. Levante a pele com fórceps lisos e corte uma pequena abertura de aproximadamente cinco milímetros proximal à fossa popliteal. Deslize uma tesoura afiada na abertura e corte em direção ao joelho, de modo que a incisão termine logo acima do joelho.
Certifique-se de não perfurar os vasos subjacentes, levantando a pele com fórceps durante o corte. Mova o mouse para uma posição propensa e complete a incisão circunferencial. Dissecar a pele a alguns milímetros acima do ângulo.
Lembre-se de manter o tecido úmido com soro fisiológico estéril durante todo o procedimento. Retraia a pele da ferida proximal com um retrátil elástico. E certifique-se de que a veia ciática seja visível como mostrado.
Injete 0,01 mililitros Patente Blue V subcutâneamente entre o segundo e o terceiro dedo do dedo. Pressione suavemente a pata algumas vezes para distribuir a Patente Azul V.A distribuição da Patente Azul V pode ser vista através do microscópio. As estruturas necessárias para serem visualizadas são, o vaso linfático proximal, PLV, o linfonodo popliteal, PLN, o primeiro vaso linfático distal, DLV1, e o segundo vaso linfático distal, DLV2.
Amplie para visualizar o PLV e ligate-lo usando uma sutura de nylon 10-0. Pressione a pata para garantir que nenhuma patente azul passe proximal para a ligadura. Ligate os dois vasos linfáticos distal, como mostrado.
Pressione a pata várias vezes novamente para ter certeza de que nenhuma patente Azul V passa proximal para a ligadura. Neste exemplo, pode-se ver que um dos vasos linfáticos estoura devido à ligadura que dificulta o fluxo linfático. Remova o linfonodo popliteal, o linfonodo tem uma superfície lisa semelhante a pérolas e é colorido pelo Azul Patente V em contraste com o tecido de gordura circundante.
Antes de remover a almofada de gordura inguinal, cauterize este recipiente como mostrado. Em seguida, remova a almofada de gordura em uma peça. Certifique-se de que não há sangramento ativo.
Este é um exemplo de um linfonodo inguinal localizado. O linfonodo localizado na almofada de gordura inguinal raramente é colorido pela Patente Azul V e pode ser difícil de diferenciar da gordura. Remover a almofada de gordura em uma peça é a melhor maneira de garantir que o linfonodo tenha sido removido.
Sutura as bordas da pele até a fáscia muscular, com uma sutura de nylon 6-0 usando fórceps e suporte de agulha, deixando uma lacuna de dois a três milímetros, para restringir o fluxo linfático superficial. Este é um exemplo das suturas acabadas, na fossa popliteal, no lado lateral da linha traseira, acima do joelho, e no lado medial da barra traseira. Administre analgesia e pese o rato após a cirurgia, em seguida, colocá-lo em um armário aquecido para recuperação.
Repita o procedimento para irradiação pré-cirurgia. Este gráfico mostra o volume médio combinado de três estudos separados nas oito semanas após a cirurgia. No total, foram incluídos 31 camundongos.
O eixo x representa semanas após a cirurgia. O eixo y representa o volume de subida traseira em milímetros cúbicos. As barras de seta representam o desvio padrão.
Espera-se que o inchaço da cirurgia e o linfedema induzido diminuam durante as primeiras quatro semanas. Depois das primeiras quatro semanas vemos um estado relativamente estável de linfedema. O volume do controle de linha traseira aumenta durante as oito semanas, dizendo estritamente a diferença de volume entre o nível traseiro linfedema e o controle hindlimb, isso foi inesperado.
Especula-se que os camundongos usaram seu hindlimb não operado mais do que o hindlimb operado nas semanas seguintes à cirurgia. Isso pode levar à hipertrofia do controle de retroesco e talvez explicar o aumento do volume. Para figuras individuais sobre os três estudos incluídos, leia o protocolo.
Esta tabela mostra o teste de comparação múltipla de Sidak para as medidas de volume combinadas dos três estudos incluídos. O valor P calculado mostra que há uma diferença estatisticamente significativa entre os obstáculos com linfedema induzido e os preços traseiros de controle, durante todas as oito semanas de seguimento. Para análise estatística individual sobre os três projetos incluídos, leia o protocolo.
Este método induz linfedema estatisticamente significativo, com duração mínima de oito semanas. O procedimento pode ser usado para estudar a petrificialidade do linfedema e para pesquisar novas opções de tratamento. Depois de assistir a este vídeo, você deveria ter adquirido uma compreensão de como induzir linfedema secundário na etapa posterior de camundongos, usando uma combinação de microcirurgia e irradiação pré e pós-cirurgia.
Uma vez dominado, o procedimento cirúrgico pode ser realizado em 45 minutos.
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Visão Geral
Este modelo animal permite aos pesquisadores induzir linfedema secundário estatisticamente significativo na pata traseira de camundongos, com duração de pelo menos 8 semanas. O método pode ser utilizado para estudar a fisiopatologia do linfedema e para investigar novas opções de tratamento.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia
- Patofisiologia
Contexto
- O linfedema secundário é uma condição que pode impactar significativamente a qualidade de vida.
- Compreender seus mecanismos é fundamental para desenvolver tratamentos eficazes.
- Este modelo tem como objetivo fornecer um método confiável para induzir linfedema em camundongos.
- Recomenda-se treinamento em técnicas microcirúrgicas para uma implementação bem-sucedida.
Objetivo do Estudo
- Induzir linfedema secundário consistente na pata traseira de camundongos.
- Investigar a fisiopatologia subjacente do linfedema.
- Explorar opções terapêuticas potencialmente novas para o linfedema.
Métodos Utilizados
- Indução de linfedema secundário na pata traseira de camundongos.
- Uso de radiação conforme descrito no protocolo.
- Anestesia do camundongo antes do procedimento.
- Técnicas microcirúrgicas para indução bem-sucedida de linfedema.
Resultados Principais
- Foi alcançado linfedema estatisticamente significativo que durou pelo menos 8 semanas.
- O modelo não causou morbidade grave nos camundongos.
- Resultados consistentes foram obtidos em múltiplos ensaios.
- O treinamento melhorou a eficiência do procedimento.
Conclusões
- Este modelo é eficaz para estudar linfedema em camundongos.
- Ele fornece uma plataforma para testar novas abordagens terapêuticas.
- Pesquisas futuras podem se basear neste modelo para aprimorar a compreensão do linfedema.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método fornece um modelo murino reprodutível para linfedema secundário, permitindo estudos mecanicistas da disfunção linfática e avaliação de intervenções terapêuticas. O modelo auxilia na validação de alvos ao estabelecer um sistema relevante para a doença com saída fenotípica quantificável ao longo de um período de 8 semanas. Ele facilita a redução de riscos pré-clínicos, permitindo a avaliação dos efeitos de compostos sobre o fluxo linfático e a remodelação tecidual sem morbidade grave.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação dos componentes da via linfática e a validação funcional de alvos envolvidos na homeostase de fluidos.
- Valor Operacional: Fornece um fenótipo consistente e quantificável para avaliar o engajamento de alvos e a modulação da via.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Gera medições de volume de membros posteriores como leitura quantitativa para campanhas de triagem de compostos.
- Valor Operacional: Apoia a padronização de ensaios por meio do teste de comparação múltipla de Sidak para validação estatística entre coortes de estudo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Modela a fisiopatologia humana do linfedema secundário, permitindo a exploração translacional de biomarcadores relacionados ao vazamento linfático e à fibrose.
- Valor Operacional: Facilita a continuidade pré-clínica, desde a descoberta até os testes de eficácia, com fenótipo estável que dura pelo menos 8 semanas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta a pré-clínico, apoiando a validação de alvos orientada por hipóteses e a avaliação de compostos líderes em programas de doenças linfáticas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a desmistificação mecanicista ao esclarecer o papel de alvos linfocirculatórios na formação de edema.
- Triagem: Permite um sistema biológico pronto para uso na exposição a compostos, com volumetria do membro posterior quantificável como ponto final primário.
- Análises: Fornece uma estrutura estatística (teste de Sidak) para comparar grupos tratados versus controles em diferentes pontos temporais longitudinais.
- Pesquisa Translacional: Alinha-se aos fenótipos clínicos de linfedema, apoiando decisões de avançar/não avançar vinculadas a biomarcadores.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma microcirúrgica com irradiação reutilizável para modelagem de patologias linfáticas em múltiplos projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na modulação do alvo por meio de resposta fenotípica sustentada e estatisticamente significativa.
- Valor Operacional: Protocolo padronizado de irradiação (10 Gy pré e pós) e ligadura microcirúrgica garante reprodutibilidade entre diferentes operadores.
- Valor Estratégico: Reduz o risco de falha em estágios tardios ao permitir avaliação precoce dos perfis de segurança e eficácia linfáticos.
- Impacto no Portfólio: Orienta a priorização ajustada ao risco de candidatos direcionados ao sistema linfático com base na fidelidade do modelo de doença.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em técnicas microcirúrgicas e em protocolos de segurança radiológica.
- Depende de equipamentos especializados, incluindo estereomicroscópio, fonte de radiação com blindagem de chumbo e ferramentas de sutura de precisão.
- Necessita padronização entre equipes nos setores de cirurgia, irradiação e fenotipagem para resultados consistentes.
- A adaptação a outros sistemas modelo exigiria validação da anatomia linfática e da tolerância à radiação.
- Limitação prática: a duração do procedimento (~45 minutos após o treinamento) e a dependência de habilidade microcirúrgica podem afetar a produtividade.
