Um método de alta saída para isolar pericites cerebrais do rato
14 de janeiro de 2020
Apresentamos um protocolo para a extração de pericitos cerebrais murina. Baseado em uma extração pericyte orientada para enriquecimento livre de antibióticos, este protocolo é uma ferramenta valiosa para estudos in vitro que fornecem alta pureza e alto rendimento, diminuindo assim o número de animais experimentais usados.
Recentemente, o papel dos pericítos cerebrais tornou-se evidente em distúrbios neurológicos e função cerebral. Portanto, o desenvolvimento de um método de cultura confiável para essas células é imperativo. Nosso protocolo para a extração de pericítos cerebrais murinas representa uma ferramenta confiável para estudos in vitro e para fornecer pericítes com alta pureza e rendimento celular.
Demonstrando o procedimento com Anupriya Mehra será Lucie Dehouck, uma técnica do meu laboratório. Comece colocando o cérebro de um rato C57BL/6 macho de quatro semanas de idade específico em um limpador seco e estéril e usando fórceps de ponta curva para remover os nervos de cerebelo, estriado e occipital. Use um cotonete para remover todas as meninges visíveis e virar o tecido cerebral de cabeça para baixo.
Abra os lóbulos com traços leves para fora e remova todos os vasos sanguíneos visíveis. Em seguida, coloque o tecido cerebral sem meninges em uma placa de Petri de 100 milímetros contendo 15 mililitros de tampão de lavagem frio B.To homogeneizar o tecido, transferir a amostra cerebral para um tubo de argamassa de moedor de tecido Dounce e adicionar três a quatro mililitros de tampão de lavagem B ao tubo. Use um pilão solto para picar o tecido 55 vezes, depois enxágue o pilão com tampão de lavagem B e pique o chorume de tecido com um pilão apertado 25 vezes.
Ao final da homogeneização, igualmente aliquotar o chorume entre dois tubos de 50 mililitros e adicionar 1,5 vezes o volume de frio 30% bovino serum albumin dextran. Em seguida, agite vigorosamente os tubos para misturar o chorume. Para isolar a fração vascular, sedimentar as células por centrifugação e transferir os supernantes em dois novos tubos.
Armazene a pelota na lavagem do tampão B no gelo. Resuspenda as pelotas em três mililitros de tampão de lavagem a frio B no gelo. Centrifugar os supernantes colhidos e repetir este passo mais uma vez.
Descarte os supernaciantes e resuspenque as pelotas em três mililitros de tampão de lavagem B.Em seguida, acumule as pelotas resuspended e leve o volume final da suspensão da célula agrupada para 10 mililitros com tampão de lavagem frio fresco B.Dissociar ainda mais as células com uma pipeta de 10 milímetros seis vezes até que nenhum pedaço restante de pelotas seja visível e use um conjunto de filtro de vácuo e um filtro de malha de nylon para filtrar a suspensão da célula. Coloque o coador em uma placa de Petri e limpe a malha com tampão de lavagem fresco B e raspando para recuperar quaisquer capilares. Em seguida, realize uma segunda filtragem com um filtro fresco.
Divida o filtrado igualmente entre dois tubos e colete as células por centrifugação. Depois de descartar os supernantes, junte as pelotas em um único tubo contendo tampão de lavagem pré-enwarmed B com enzimas e adicione Colagenase/Dispase pré-enwarmed ao tubo. Coloque o tubo em um banho de água de mesa tremendo por precisamente 33 minutos a 37 graus Celsius antes de parar a reação com 30 mililitros de tampão de lavagem a frio B.Colecione as células por centrifugação e descarte cuidadosamente o supernante.
Rápido, mas cuidadosamente, ressumem a pelota na lavagem do tampão B seis vezes e centrifufique a suspensão novamente. Depois de descartar o supernaspe, resuspenque a pelota em 18 mililitros de média dMEM completa e sementes dois mililitros de suspensão celular em DMEM completo em nove poços de três placas de seis poços revestidos de Matrigel. Coloque as culturas celulares em uma incubadora estéril de 37 graus Celsius 5% de dióxido de carbono por 24 horas antes de remover cuidadosamente os detritos de cada poço e adicionar mídia DMEM fresca.
Depois de 48 horas, troque o meio em cada poço a cada 48 horas. No dia 8 a 10, quando as células atingem 100% de confluência, passe as células em meio de cultura pericíte para novas placas de gelatina revestidas de seis poços e devolva as células à incubadora de cultura celular por mais seis a sete dias com monitoramento. Em seguida, divida as células novamente no dia 17 em pericíte médio em novas placas revestidas de gelatina.
Da passagem zero à segunda passagem, há características morfológicas específicas pelas quais as células endoteliais e o subsequente aumento gradual de pericítos podem ser identificados. Em uma passagem cultura zero, células endoteliais alongadas que se desenvolvem a partir de microvexilhões estão em abundância. Esta abundância é reduzida após a passagem um e ausente após a passagem dois.
Pelo contrário, os pericílitos aparecem como raras células quadrilaterais nas culturas primitivas e se tornam abundantes pela segunda passagem. A avaliação da expressão de NG2, CD146 e PDGFR beta pode ser usada para avaliar a pureza da cultura pericíte por PCR quantitativo, imunocitoquímica e mancha ocidental. A digestão enzimápica é um passo crítico para o sucesso do protocolo.
Certifique-se de monitorar rigorosamente as concentrações enzimáticas e o tempo de incubação.
Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo confiável para a extração de pericitos cerebrais murinos, que são essenciais para compreender seu papel em distúrbios neurológicos e na função cerebral. O método enfatiza uma abordagem de enriquecimento livre de antibióticos que proporciona alta pureza e elevada contagem celular, minimizando o número de animais experimentais necessários.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Pericitos cerebrais
- Distúrbios neurológicos
- Estudos celulares in vitro
Contexto
- A importância dos pericitos cerebrais na saúde cerebral
- Necessidade de métodos confiáveis de cultura celular
- Dificuldades nos protocolos existentes de extração
Métodos Utilizados
- Extração celular sem antibióticos
- Modelo murino (camundongo C57BL/6)
- Centrifugação, digestão enzimática e cultivo celular
Resultados Principais
- Alta pureza e viabilidade dos pericitos isolados
- Diferenciação morfológica clara entre pericitos e células endoteliais
- Avaliação da pureza do cultivo celular pelos marcadores NG2, CD146 e PDGFR beta
Conclusões
- O protocolo fornece um método confiável para o isolamento e cultivo de pericitos cerebrais murinos
- Este estudo aprimora a compreensão da função dos pericitos em contextos neurológicos
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento confiável de pericitos cerebrais com alta pureza e rendimento é essencial para o avanço da validação de alvos neurovasculares e a redução de riscos mecanicistas na descoberta de fármacos para o SNC. Este protocolo permite a modelagem escalonável in vitro da função e da patologia da barreira hematoencefálica, reforçando a confiabilidade preditiva nas pesquisas neurológicas iniciais. A extração de alto rendimento reduz o uso de animais, alinhando-se às prioridades éticas e operacionais em pesquisa e desenvolvimento biofarmacêutico.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de vias específicas dos pericitos implicadas em distúrbios neurovasculares.
- Apoia a validação funcional de alvos ao fornecer culturas puras de pericitos para estudos mecanicistas.
- Facilita a confiança preditiva na seleção de alvos no SNC e na redução de riscos de hipóteses biológicas.
Desenvolvimento de Ensaios e Triagem
- Fornece culturas padronizadas e de alto rendimento de pericitos para ensaios in vitro reprodutíveis.
- Permite a avaliação quantitativa da expressão de marcadores de pericitos para validação de ensaios.
- Permite a preparação escalonável de sistemas celulares relevantes para doenças, destinados à triagem de compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha modelos in vitro de pericitos com estudos translacionais de biomarcadores na pesquisa neurovascular.
- Permite continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica dos mecanismos da barreira hematoencefálica.
- Reduz o risco biológico em estágios avançados ao melhorar a fidelidade do modelo e seu valor preditivo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método de alto rendimento para o isolamento de pericitos se insere na interface entre a descoberta inicial e o desenvolvimento de modelos pré-clínicos para programas do SNC.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes de hipóteses sobre a função dos pericitos e a integridade neurovascular.
- Triagem: Fornece culturas reprodutíveis de pericitos validadas por marcadores para o desenvolvimento de ensaios.
- Análises: Permite a medição quantitativa da expressão de NG2, PDGFR-β e CD146 para avaliação da pureza da cultura.
- Pesquisa Translacional: Oferece uma plataforma para alinhar achados in vitro com estudos de biomarcadores in vivo.
- Reutilização Empresarial: Oferece um protocolo padronizado e escalável, adaptável entre equipes de pesquisa neurovascular.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos neurovasculares.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade dos fluxos de trabalho de cultivo de pericitos.
- Valor Estratégico: Melhora a qualidade das decisões de avançar ou não avançar e a eficiência do capital no avanço de portfólios do SNC.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos e modelos neurovasculares.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em dissecação cerebral de camundongos e técnicas de cultivo celular.
- Requer acesso à infraestrutura de centrifugação, filtração e análise de marcadores moleculares.
- Exige rigorosa adesão ao protocolo na digestão enzimática e no controle de tempo para garantir rendimento e pureza celular.
- A padronização entre equipes é essencial para a reprodutibilidade e a comparabilidade entre estudos.
- O ajuste para outras espécies ou modelos de doenças pode exigir otimização do protocolo.
