Gerando paisagens químicas controladas e dinâmicas para estudar comportamento microbiano

Este método permite elucidar a ecologia de microescala e o comportamento dos microrganismos navegando em gradientes químicos dinâmicos e descobrir suas trocas ocultas, cinética de nutrientes e dinâmica populacional em microambientes ecologicamente relevantes. Ao combinar tecnologia microfluida com fotolise, geramos pulsos químicos controlados, onde o quimioattractant localizado se torna subitamente disponível na microescala, para medir a resposta quimotactica de populações microbianas primeiro expostas a gradientes químicos instáveis. Projete o canal usando o software CAD e imprima-o em uma película de transparência para criar a máscara fotográfica.

Fabricar o mestre por litografia macia em uma sala limpa, de acordo com o manuscrito. Prepare uma mistura de PDMS combinando o elastômero com seu agente de cura a uma proporção de 10 para um em um béquer de 40 mililitros. Com uma faca de plástico, misture vigorosamente até que o líquido fique homogêneo.

Imediatamente desgase a mistura PDMS em uma câmara de vácuo por 45 minutos à temperatura ambiente. Para acelerar o processo, solte periodicamente o vácuo para estourar as bolhas que se formam na interface. Remova o pó da superfície do mestre com um limpador pressurizado.

Em seguida, despeje a mistura pdms desgaseada sobre o mestre, e asse-a em um forno a 80 graus Celsius por duas horas. Corte o PDMS com uma lâmina ao redor das microestruturas a uma distância de aproximadamente cinco milímetros e, em seguida, retire cuidadosamente o PDMS do mestre. Furos para servir como entrada e saída do microcanal.

Sele o microcanal com fita adesiva para evitar o acúmulo de poeira. Projete a forma 3D usando software de design 3D e imprima o mestre para o molde PDMS com uma impressora 3D de alta resolução. Depois de preparar e desgasear a mistura PDMS como feito anteriormente, limpe a superfície do mestre, dabbing com fita adesiva.

Coloque o mestre em uma escala. Em seguida, evitando a região central do mestre, despeje 23,4 gramas de mistura PDMS nãocurada, a fim de obter a altura desejada do PDMS, correspondendo à altura do mestre em 0,5 milímetros. Remova as bolhas restantes com a ajuda do ar comprimido.

Coloque o PDMS no mestre em um forno a 45 graus Celsius para assar por pelo menos 12 horas. Em seguida, retire suavemente a camada PDMS endurecida e fure os orifícios de entrada e saída para a injeção da suspensão bacteriana. Ative a superfície de uma placa de Petri e o molde PDMS com plasma de oxigênio por dois minutos.

Conecte o molde PDMS na placa de Petri pressionando suavemente o molde para a placa de Petri. Evite pressionar onde as características estão localizadas. Coloque a placa de Petri ligada ao molde PDMS 3D em um forno a 45 graus Celsius por pelo menos 12 horas para fortalecer a ligação química.

Em seguida, ative a membrana de policarbonato nanoporoso em uma câmara de plasma de oxigênio por um minuto à temperatura ambiente. Sob uma capa química, diluir uma solução comercial de 3-aminopropyltrietooxysilane em água deionizada para 1% em volume usando um tubo de polipropileno. Transfira a solução diluída de 3-aminopropilyltrietoxisilane em uma placa de Petri e mergulhe a membrana ativada na solução de 3-aminopropyltrietotoxisilane por 20 minutos.

Em seguida, remova a membrana da solução de 3-aminopropiltotoxisilano com pinças, e coloque-a em um limpador de quarto limpo para secar. Para a fabricação dos canais microfluidos PDMS que se deitarão sobre a membrana e permitirão a lavagem da arena bacteriana, repita a fabricação do dispositivo microfluido para o único experimento de pulso químico como feito anteriormente. Para ligar os canais de lavagem PDMS à membrana funcionalizada, primeiro ative o canal de lavagem PDMS e a membrana de policarbonato com uma câmara de plasma de oxigênio por dois minutos.

Imediatamente após o tratamento plasmápico, coloque a membrana funcionalizada e o canal de lavagem PDMS em contato pressionando suavemente o canal de lavagem PDMS na membrana. É importante pressionar suavemente o PDMS e a membrana, ou a membrana pode ser irreversivelmente ligada ao teto do microcanal de 200 micrômetros de altura PDMS. Em seguida, ative tanto a membrana de policarbonato do canal de lavagem do canal de lavagem laminado ligado e o molde 3D PDMS anteriormente ligado à placa de Petri, colocando-os em uma câmara de plasma de oxigênio por dois minutos.

Sanduiche a membrana entre duas camadas de PDMS e pressione juntas. Coloque a placa de Petri ligada à estrutura do sanduíche em um forno a 45 graus Celsius por pelo menos 12 horas para fortalecer a ligação química. Para começar, mantenha a câmara millifluidica sob vácuo por 20 minutos.

Em seguida, coloque a placa de Petri contendo a câmara millifluidica em um estágio de microscópio. Com uma pipeta, encha a câmara abaixo da membrana com a suspensão bacteriana diluída de Víbelo ordalii fluorescente GFP em uma solução de um milimolar 4-metoxi-7-nitroindolinyl-caged-L-glutamato em água do mar artificial. Depois de encher o canal com a suspensão bacteriana, suge a solução em excesso com uma toalha de papel, e veda a entrada e saída com plugues PDMS pressionando-os suavemente nos orifícios.

Encha uma seringa com uma solução artificial de água do mar de um mililitro 4-metoxi-7-nitroindolinyl-caged-L-glutamato, e conecte tubos à entrada e saída do canal de lavagem acima da membrana. Conecte a tubulação a um reservatório de resíduos e garanta que a tubulação esteja totalmente submersa no reservatório de resíduos de fluidos para evitar oscilações de pressão. Defina a taxa de fluxo na bomba de seringa para 50 microliters por minuto.

Inicie a bomba de seringa para estabelecer o fluxo no canal de lavagem acima da membrana. Inicie o software que controla o feixe led e o estágio do microscópio, e gere sequências de pulsos definidas pelo usuário em diferentes locais e com diferentes intensidades. Grave vídeo usando um objetivo de 4x em intervalos de tempo regulares durante um período de várias horas e em vários locais contíguos para cobrir uma grande superfície.

Neste estudo, foram utilizados os dispositivos microfluidos e millifluidos para estudar perfis de resposta quimotactic bacteriana e acumulação em condições dinâmicas de nutrientes. As projeções de intensidade máxima mostram a posição bacteriana, indicada por traços brancos, durante um intervalo de 0,5 segundos imediatamente após a liberação do pulso e 40 segundos após a liberação do pulso. As trajetórias bacterianas também foram mostradas em preto 60 segundos após a liberação do pulso.

A região sombreada representa o pulso químico liberado pela fotolise no momento zero segundo no meio do campo de visão, que posteriormente difundiu. A concentração bacteriana, bem como a dinâmica temporal da velocidade de deriva radial após uma liberação de pulso no centro do campo de visão são mostrados aqui. Os valores negativos da velocidade de deriva correspondem ao movimento quimotactico direcionado em direção ao centro do pulso.

Estatísticas de natação são apresentadas aqui para uma população bacteriana na ausência de gradientes químicos. Trajetórias representam as projeções bidimensionais do movimento bacteriano tridimensional no microcanal. A distribuição da probabilidade de velocidade de natação bacteriana medida foi encaixada por uma distribuição gama.

A partir das trajetórias bacterianas, foi extraída a distribuição de probabilidades do tempo entre reorientações sucessivas. O padrão de reorientação, a distribuição da velocidade da natação e as estatísticas de reorientação dos organismos foram utilizados para informar um modelo individual. Este método foi testado na bactéria marinha Vibrio ordalii realizando quimotaxis em direção ao glutamato de aminoácidos, mas a metodologia proposta é amplamente aplicável a diferentes combinações de espécies e quimioattractants, bem como a processos biológicos além da quimiotaxis, como a dinâmica populacional e comunitária em condições espacialmente heterogêneas e dinâmicas.

Técnicas clássicas em ecologia microbiana e microbiologia, como crescimentos em culturas em lote ou quimiostatas, têm ignorado em grande parte as características espátulas-temporais dos habitats microbianos. A criação quase instantânea de pulsos químicos nas microescalas por fotolise visa reproduzir o tipo de pulsos de nutrientes que as bactérias marinhas encontram na natureza a partir de uma variedade de fontes, por exemplo, a propagação difusa de plumas por trás de partículas orgânicas afundando ou o nutriente que se espalha de células fitoplânctons lícitas. A solução de aminosilano é agudamente tóxica e deve ser tratada com extremo cuidado.

Trabalhamos exclusivamente sob o capô da fumaça e usamos equipamentos de proteção como jaleco, óculos de segurança e luvas. Também cuidamos dos resíduos que geramos.