Visualizando o cérebro em desenvolvimento em zebrafish vivo usando Brainbow e Imagem Confocal de lapso de tempo
23 de março de 2020
A imagem in vivo é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para investigar os mecanismos celulares subjacentes ao desenvolvimento do sistema nervoso. Aqui descrevemos uma técnica para usar microscopia confocal de lapso de tempo para visualizar um grande número de células multicoloridas com rótulo barco-íris em tempo real dentro do sistema nervoso zebrafish em desenvolvimento.
Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre a dinâmica das células progenitoras neurais e sua prole que estão por trás do desenvolvimento cerebral vertebrado. A principal vantagem desta técnica é a capacidade de visualizar diretamente vários aglomerados de células clonalmente relacionadas dentro do cérebro vivo ao longo de muitas horas de desenvolvimento. O protocolo também pode ser aplicado ao estudo da dinâmica clonal e progenitora em outros sistemas de desenvolvimento do embrião de zebrafish.
A visualização usando este método é particularmente útil para observar diretamente processos fundamentais que ocorrem durante o desenvolvimento neural. Na tarde anterior à realização de microinjeções, configure zebrafish adultos selvagens em tanques de acasalamento segregados por sexo. Na manhã seguinte, prepare a solução de DNA de acordo com as instruções do manuscrito e injete aproximadamente 4,2 nano litros desta solução em uma célula de embriões de zebrafish dentro de 45 minutos após a fertilização.
Mantenha os embriões injetados em E três médios e uma incubadora de 28 graus Celsius por 24 horas, em seguida, chame os embriões mortos e deformados do grupo. Transfira até 20 embriões saudáveis em um tubo de 50 mililitros, encha-o com 10 mililitros de E3 e coloque uma tampa em cima de cada tubo. Coloque um rack com os tubos de 50 mililitros eretos em um banho de água de 37 graus Celsius por 80 a 90 minutos, certificando-se de que o nível de água no banho é maior do que o E três no tubo.
Retire o rack do tubo do banho de água e coloque-o na incubadora de 28 graus Celsius. Deixe até uma hora para o E3 esfriar e os embriões se reaclimatam à temperatura. Em seguida, transfira-os para placas de Petri com 0,2 milimôlar PTU e E três mantidos aquecidos na incubadora de 28 graus Celsius.
De duas a quatro horas após o choque térmico, examine os embriões sob um microscópio de dissecção de fluorescência padrão para expressão de CFP ou YFP, o que indica uma recombinação cerebral bem sucedida. Selecione embriões com uma expressão FP robusta por toda parte e transfira-os para um prato separado com PTU. Imagem-los um, dois ou três dias após a fertilização.
A expressão que aparece fraca sob um microscópio de fluorescência pode realmente ser bem visualizada em imagens de lapso de tempo confocal. Antes do dia do experimento, prepare a câmara de imagem e a ferramenta de manipulação de embriões. Para preparar a câmara de imagem, supercole cuidadosamente um anel de plástico no centro de uma placa de Petri de 60 milímetros.
Construa o manipulador super colando um pequeno comprimento de linha de pesca de nylon até o final de uma vara de cotonete de madeira de quatro polegadas. Se necessário, descorionato os embriões sob um microscópio de dissecção antes da montagem. Para montar os embriões, transfira o peixe para o centro do anel plástico na câmara de imagem e remova o máximo de excesso E três possível com uma pipeta de transferência fina.
Use uma pipeta de transferência limpa para cobrir o peixe com uma por cento de baixa agarose de derretimento e E três, enchendo todo o anel de plástico com uma camada de agarose. Em seguida, puxe suavemente o embrião para cima na ponta da pipeta e de volta para a agarose sem introduzir quaisquer bolhas de ar. Use um manipulador de embriões para orientar rapidamente o peixe e a agarose antes que endureça.
Se for possível a imagem com um microscópio vertical, posicione o embrião o mais próximo possível da superfície superior da agarose, certificando-se de que eles estejam paralelos à parte inferior da câmara de imagem com a cauda reta. Aguarde que a agarose endureça, em seguida, encha a câmara de imagem com E três, adicionando o máximo possível para explicar a evaporação ao longo da imagem. Coloque a câmara de imagem com o peixe e e três no microscópio confocal.
Em seguida, selecione o objetivo com uma alta abertura numérica e uma longa distância de trabalho. Encontre uma região com rotulagem adequadamente densa e brilhante das células e configure os parâmetros de aquisição. Este é um exemplo usando o software Zen, mas as configurações variam dependendo das linhas de microscópio e laser disponíveis.
Prepare três faixas para imagem de cada canal FP sequencialmente. Use um laser de argônio para excitar CFP a 458 nanômetros e YFP a 514 nanômetros, e use um laser DPSS 561 nanômetro para excitar o dTomato. Colete as missões para os três nos comprimentos de onda apropriados.
Selecione a faixa de pilha Z para imagem e um intervalo de tempo entre 10 e 30 minutos para acompanhar eventos mitóticos e apoptóticos. Finalmente, selecione o comprimento da sessão de imagem e execute o experimento. Depois que a imagem estiver concluída, salve os dados brutos no formato CZI se usar Zen ou outro formato compatível com Fiji, em seguida, importe as imagens para Fiji usando o importador de formatos biológicos.
Imagens de lapso de tempo multicolor in vivo foram usadas para mostrar clones codificados por cores brainbow de células na zona ventricular proliferativa do cérebro traseiro de zebrafish em desenvolvimento. Células rotuladas por brainbow dispostas ao longo de uma fibra radial particular compartilhavam a mesma cor. Que pode ser quantificado como os pesos relativos do canal RGB.
Isso sugere que esses grupos de rádio eram clones de células divisórias e que sua cor semelhante poderia ser usada para identificá-las como sendo relacionadas clonalmente. Uma análise quantitativa de cores mostrou que as células filhas expressam a mesma cor que a célula da mãe. Mas esses aglomerados de rádio vizinhos de células podem ser distinguidos uns dos outros.
Numerosos clones de células relacionadas podem ser seguidos simultaneamente ao longo de horas in vivo, permitindo uma análise e comparação de linhagem multiplex. A quantificação da expressão de cor em clones aos dois e, em seguida, novamente em três dias após a fertilização mostrou que a expressão brainbow permaneceu relativamente constante de dois a três dias. Imagens de lapso de tempo revelaram inúmeras células submetidas à migração nuclear intercinética e divisão celular de um a dois dias após a fertilização, possibilitando estudar o ciclo celular.
Calculou-se um ciclo celular médio de 8,4 horas, o que é comparável às medições anteriores em zebrafish. Além disso, essa técnica de imagem foi utilizada para observar células individuais submetidas às alterações morfológicas estereotipadas associadas à apoptose, como a membrana e a fragmentação celular. Como esse método é realizado in vivo, o zebrafish pode ser resgatado da câmara de imagem e mantido para imagens ou outros experimentos em momentos posteriores.
O uso dessa técnica nos permite explorar novas questões sobre os papéis das células clonalmente relacionadas durante o desenvolvimento neural.
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Visão Geral
Este artigo descreve uma técnica para imagens in vivo usando microscopia confocal de lapso de tempo para visualizar células marcadas com Brainbow multicoloridas no sistema nervoso em desenvolvimento do peixe-zebra. Este método permite aos pesquisadores investigar a dinâmica das células progenitoras neurais e sua progênie durante o desenvolvimento do cérebro dos vertebrados.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia do Desenvolvimento
- Técnicas de Imagem
Fundo
- Imagens in vivo são cruciais para estudar mecanismos celulares no desenvolvimento.
- Peixes-zebra servem como um organismo modelo para estudos do cérebro dos vertebrados.
- A marcação Brainbow permite a visualização de células clonalmente relacionadas.
- Entender a dinâmica das células progenitoras neurais é essencial para insights sobre o desenvolvimento do cérebro.
Propósito do Estudo
- Visualizar células progenitoras neurais em tempo real.
- Explorar dinâmica clonal e de progenitores em embriões de peixe-zebra.
- Observar processos fundamentais durante o desenvolvimento neural.
Métodos Utilizados
- Microscopia confocal de lapso de tempo para imagens.
- Injeção de solução de DNA em embriões de peixe-zebra de uma célula.
- Uso de marcação Brainbow para visualização multicolorida.
- Observação do sistema nervoso em desenvolvimento ao longo de horas.
Principais Resultados
- Visualização bem-sucedida de múltiplos clusters de células relacionadas.
- Insights sobre a dinâmica das células progenitoras neurais.
- Aplicação da técnica a outros sistemas em desenvolvimento.
- Observação direta dos processos de desenvolvimento neural.
Conclusões
- A técnica melhora a compreensão do desenvolvimento do cérebro.
- Ela fornece uma estrutura para estudar dinâmica clonal em peixe-zebra.
- Imagens in vivo são uma ferramenta valiosa para pesquisa em neurociência.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This technique enables real-time, multiplex lineage analysis of clonally related cells in a living vertebrate model, providing quantitative insights into cellular dynamics during neurodevelopment. By visualizing progenitor cell behavior and progeny fate over time, it supports mechanistic de-risking in early discovery by clarifying how genetic or pharmacological perturbations affect cell cycle, migration, and apoptosis. The approach enhances predictive confidence in target validation by linking molecular interventions to observable, quantifiable changes in clonally defined cell populations within a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracking clonally related neural progenitor cells and their progeny in vivo over developmental time.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for functional target validation through direct observation of cellular behaviors such as division, migration, and apoptosis.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying color-stable clonal expansion, allowing comparison across genetic or pharmacological conditions to assess mechanistic impact.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative readouts of clonal dynamics via RGB channel analysis of Brainbow-labeled cells, enabling objective comparison of experimental conditions.
- Operational Value: Establishes a scalable imaging workflow compatible with time-lapse confocal microscopy, facilitating consistent data acquisition across multiple embryos and time points.
- Assay Readiness: Produces large, multiplex datasets that can be banked and re-analyzed, supporting assay standardization and cross-functional collaboration in discovery biology.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Uses a disease-relevant system (zebrafish nervous system) to model vertebrate neurodevelopment, enabling extrapolation of clonal behavior insights to higher-order systems.
- Preclinical Alignment: Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying how perturbations affect clonally related cell populations, a key determinant of tissue architecture and function.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes stem from altered progenitor dynamics, reducing ambiguity in target mechanism interpretation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing dynamic, quantitative readouts that bridge genetic manipulation and phenotypic outcome in neurodevelopmental models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct visualization of clonally related cell behaviors in response to experimental perturbations.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs (e.g., cell cycle duration, apoptosis incidence, clonal color stability) that allow side-by-side comparison of conditions.
- Analytics: Enables statistical analysis of clonal expansion, color expression consistency, and spatial organization, providing objective metrics for evaluating compound or genetic effects.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical validation by establishing a quantitative baseline of normal clonal dynamics against which disease models can be compared.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging platform applicable across multiple projects studying neurodevelopment, neurodegeneration, or regenerative biology in zebrafish.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct, time-resolved observation of clonally defined cell populations.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via fixed imaging protocols, environmental controls (28°C incubator, PTU), and standardized embryo mounting and excitation parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by delivering quantifiable, lineage-resolved data that clarify whether a target modulates progenitor dynamics, thereby reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization by identifying targets that produce consistent, measurable alterations in clonal behavior across replicates and time points.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology, microinjection, and confocal microscopy to ensure embryo viability and signal quality.
- Dependent on confocal systems with multi-laser excitation (458 nm, 514 nm, 561 nm) and spectral detection capabilities to resolve CFP, YFP, and dTomato channels.
- Necessitates standardized embryo handling and mounting procedures to minimize variability in imaging quality and developmental staging.
- Must account for phototoxicity and bleaching over long time-lapse sessions, requiring optimization of laser power and interval settings.
- Applicable across zebrafish developmental stages and adaptable to other tissues (e.g., spinal cord, retina) where clonal dynamics are of interest.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:53
Microinjection and Heat Shock of Zebrafish Embryos
2:06
Screening and Mounting Embryos
3:59
Time-lapse Confocal Imaging of the Developing Zebrafish Hindbrain
5:17
Results: Brainbow Labels Clonally Related Clusters of Dividing Cells in the Developing Zebrafish Hindbrain
6:55
Conclusion
