Name: Um modelo de inoculação retardada da infecção crônica de pseudomonas aeruginosa ferida (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Aprenda a criar um modelo de infecção crônica por Pseudomonas aeruginosa em feridas de camundongos imunocompetentes usando inoculação retardada. Este protocolo permite estudar patogênese bacteriana sem supressão imunológica.

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O vetor de construção luminescente pUT-Tn5-EM7-lux-Km1 foi um presente gracioso de J. Hardy. Os esquemas foram criados com BioRender.com. Agradecemos ao laboratório de G. Gurtner por seus conselhos sobre o modelo de infecção por feridas. Também agradecemos a T. Doyle, do Stanford Center for Innovation in In Vivo Imaging, por sua experiência técnica. Este trabalho foi apoiado por subsídios R21AI133370, R21AI133240, R01AI12492093, e subsídios da Stanford SPARK, do Falk Medical Research Trust e da Cystic Fibrosis Foundation (CFF) para p.L.B. C.R.D foi apoiado pela T32AI007502. Uma Bolsa de Pós-Graduação em Ciência e Engenharia de Gabilan Stanford e uma Lubert Stryer Bio-X Stanford Interdisciplinar Graduate Fellowship apoiaram j.M.S.

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Stanford.
1. Preparação e crescimento de bactérias
<ol><li>Realizar todo o trabalho com P. aeruginosa e animais com precauções BSL-2 de acordo com o comitê institucional de biossegurança do pesquisador e diretrizes do comitê de uso de animais. Faça todas as etapas descritas aqui envolvendo P. aeruginosa, incluindo a inoculação do rato, em um armário de biossegurança.</li>
	<li>A cepa luminescente PAO1:lux de P. aeruginosa está disponível em nosso laboratório por solicitação. Raia PAO1, armazenada como estoque de glicerol congelado, no agar Lysogeny Broth (LB). Para a cepa luminescente PAO1:lux, a agar LB deve conter antibióticos seletivos (100 μg/mL carbenicillin e 12,5 μg/mL kanamicina). Cresça a 37 °C durante a noite em uma incubadora bacteriana.</li>
	<li>Escolha uma colônia isolada e cresça durante a noite a 37 °C em 3 ml lb médio, pH 7.4. Para cepas luminescentes, o caldo deve conter 100 μg/mL carbenicillin. Cresça condições aeróbicas.</li>
</ol>2. Preparação do procedimento
<ol><li>Faça com que todo o pessoal que faça a cirurgia use um vestido limpo/jaleco, máscara facial, rede de cabelo e luvas.</li>
	<li>Autoclave todas as ferramentas cirúrgicas, incluindo tesouras e fórceps. Use técnica asséptica para esterilizar ferramentas entre animais.</li>
	<li>Limpe a mesa cirúrgica com etanol e prepare um campo cirúrgico limpo.</li>
</ol>3. Depilação
<ol><li>Anestesiados de 8 a 12 semanas de camundongos C57BL/6J usando ratos C57BL/6J de 8 a 12 semanas usando 1%-3% isoflurane. Os investigadores devem seguir as diretrizes da equipe veterinária de sua instituição para anestesia ao usar isoflurane.<ol>
<li>Inicie a anestesia entregando 1%-3% de isoflurano e ajuste a taxa de fluxo de oxigênio para 1,5 L/min. Coloque o mouse na câmara de indução.</li>
		<li>Belisque o dedo do rato para avaliar a profundidade da anestesia. Quando o rato não responde mais à estimulação, remova-o da câmara de indução e coloque-o no banco cirúrgico com o nariz no cone do nariz isoflurano.</li>
		<li>Aplique lubrificante ocular em ambos os olhos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pesar o mouse para obter um peso pré-procedimento da linha de base.</li>
	<li>Coloque o rato em posição propensa. Injete o mouse subcutâneamente com estéril pré-aquecido 0,9% cloreto de sódio, 250 μL em cada flanco para um total de 500 μL.</li>
	<li>Raspe a área dorsal do mouse usando uma máquina elétrica. A barba deve ocorrer em um local diferente da estação cirúrgica para evitar a contaminação capilar da ferida.</li>
	<li>Aplique uma fina camada de loção de depilação. Deixe a loção sentar para 20-60 s. Remova o cabelo e o excesso de loção com gaze umedecida em água morna. Após a depilação, proceda para o procedimento de ferimento excisional.</li>
</ol>4. Cirurgia de ferida excisional de espessura total
<ol><li>Injete a liberação sustentada buprenorfina 0,6-1 mg/kg subcutâneamente usando uma agulha de 25 G na área dorsal média do camundongo. A liberação lenta buprenorfina proporciona alívio da dor ao longo de 48-72 h.</li>
	<li>Desinfete o local cirúrgico. Limpe a superfície dorsal com um cotonete de betadina estéril. Limpe o excesso de betadina com um cotonete de álcool estéril. Isso deve ser realizado 3 vezes (alternando entre betadina e álcool), cotocando movendo-se do centro de forma circular para a borda. Deixe a área secar.</li>
	<li>Crie uma cortina ao redor do local cirúrgico usando gaze estéril ou envoltório de aderência de plástico.</li>
	<li>Estique a pele esticada caudally. Use um soco estéril de biópsia da pele de 6 mm de diâmetro para fazer uma incisão inicial através da epiderme dorsal esquerda. Repita na epiderme dorsal direita.</li>
	<li>Use fórceps para engrossar a pele do centro da área de ferida delineada à esquerda. Excir as camadas epidérmicas e dérmicas usando tesouras. Repita na área de ferida delineada direita para criar feridas excisional simétricas.</li>
	<li>Lave feridas com 50 μL de soro soro estéril. Deixe que o local cirúrgico e a pele circundante sequem. Em seguida, cubra as feridas e dorsum com um vestido transparente de filme.</li>
	<li>Coloque o rato de volta em uma gaiola limpa. Casa 1 animal por gaiola.</li>
	<li>Coloque a gaiola em uma almofada de aquecimento e monitore até o rato acordar.</li>
	<li>Ao realizar a cirurgia acima em vários animais, use um esterilizador de contas quentes para limpar todos os instrumentos cirúrgicos entre os animais.</li>
	<li>Permita 24h para que os camundongos se recuperem do procedimento cirúrgico e para a formação de uma matriz de feridas provisórias sobre as feridas antes de proceder à inoculação com bactérias.</li>
</ol>5. Inoculação com P. aeruginosa
<ol><li>Diluir durante a noite pao1:lux cultura para OD600 = 0,05 em 75 mL de mídia LB contendo 100 μg/mL carbenicillin e cultivar as bactérias até que a cultura esteja em fase exponencial inicial (OD600 ◗ 0,3). Isso deve levar aproximadamente 2-3 h.</li>
	<li>Diluir PAO1:lux em PBS a uma concentração de (7,5 ± 2,5) x 102 CFU/mL. Certifique-se de preparar o excesso de inóculo para garantir volume suficiente e permitir o revestimento após o experimento. Se transportar entre instalações (ou seja, do laboratório para o vivarium), use dupla contenção em uma caixa de prova de vazamento claramente marcada biohazard.</li>
	<li>Realize todo o trabalho com P. aeruginosa e camundongos utilizando equipamentos de proteção individual aprovados em um gabinete de segurança biológica aprovado em Um Animal Biosafety Nível 2 (ABSL-2) aprovado pelo gabinete de segurança biológica (BSC). Equipamentos reutilizáveis, como a escala de pesagem, devem ser cobertos com envoltório agarrado para evitar contaminação.</li>
	<li>Anestesiando usando 3% de isoflurano como descrito acima. Pesar rato e registrar o peso. Injete o mouse subcutâneamente com estéril pré-aquecido 0,9% cloreto de sódio, 250 μL em cada flanco para um total de 500 μL.</li>
	<li>Se o vestido transparente do mouse sair durante a noite, remova cuidadosamente qualquer cicatriz resultante e coloque um novo curativo.</li>
	<li>Use uma seringa de tampa de segurança de 500 μL 27 G para injetar 40 μL da suspensão PAO1:lux através da imagem transparente vestindo em cada ferida. Diferentes camundongos devem ser usados para controles de feridas não inoculados/PBS, a fim de evitar contaminação cruzada do lado contralateral.</li>
	<li>Coloque o mouse de volta em sua gaiola em uma almofada de aquecimento e monitore até que ele acorde. Todos os ratos devem ser alojados individualmente em gaiolas separadas para evitar contaminação cruzada.</li>
	<li>Forneça pasta de suplemento nutricional de alta caloria sanduíche entre pelotas de alimentos no chão da gaiola.</li>
	<li>Use o inóculo restante para estar uma placa de agar LB. Conde colônias para confirmar o número de bactérias administradas.</li>
</ol>6. Em imagens invivo de feridas infectadas
<ol><li>Siga os protocolos de contenção BSL-2 para o transporte de camundongos de e para o instrumento de imagem, incluindo o uso de um recipiente secundário. Tenha cuidado para não transferir ou soltar qualquer cama animal durante a transferência do rato para a câmara de indução ou instrumento de imagem.</li>
	<li>Induzir anestesia do camundongo com isoflurano inalado de 1%-3% em uma câmara de indução, conforme descrito na etapa 3.1.</li>
	<li>Uma vez anestesiado o mouse, coloque-o em posição propensa na câmara de imagem de um sistema óptico de imagem com o nariz no cone do nariz isoflurano.</li>
	<li>Abra o programa de software.</li>
	<li>Os parâmetros de aquisição variarão com base no número de animais imagems simultaneamente e intensidade da bioluminescência. Os parâmetros básicos a serem definidos incluem tempo de exposição, binning, f/stop e campo de visão (FOV). Nossas configurações iniciais padrão são o tempo de exposição 30 segundos, binning low (2), f/stop 1.2 e FOV 25. Ajuste essas configurações conforme necessário, dependendo das necessidades do pesquisador.</li>
	<li>Analisar dados de luminescência usando um programa de imagem (ver Tabela de Materiais). Luminescência será representada como uma imagem pseudocolor sobreposta em uma fotografia colorida dos ratos.<ol>
<li>Crie uma região de interesse (ROI) no local da ferida e meça o fluxo médio (fótons/segundo) detectados. Observe que os dados também podem ser relatados como brilho (fótons/segundo/cm²/steradiano), mas desde que a distância da plataforma de imagem da câmera permaneça constante entre a imagem, o fluxo é suficiente.</li>
		<li>Meça o fundo criando um ROI em uma área aleatória na plataforma de imagem. Subtraia o número de antecedentes de fótons/segundo.</li>
		<li>Exporte os dados para uma planilha para análise si só.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar imagens como descrito acima como diariamente para rastrear a progressão da infecção.</li>
</ol>7. Gestão pós-operatória
<ol><li>Monitorar camundongos de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo protocolo iACUC do pesquisador. Monitoramos todos os ratos diariamente durante os primeiros 4 dias, depois a cada dois dias até o final do experimento. Pesar os camundongos uma vez por dia durante os primeiros 4 dias após a cirurgia em um BSC. Injete 250 μL de 0,9% de cloreto de sódio subcutânea nos dias pós-infecção 1 e 2.</li>
	<li>Verifique se há sinais de dor/angústia nos camundongos, incluindo postura curvada, casaco desleixado, letargia, dificuldade para respirar, careta facial e perda de peso.</li>
	<li>Se os animais apresentarem sinais de deterioração da saúde, consulte um veterinário. Qualquer rato que pareça mostrar sinais piores de dor/angústia e perda de peso de 20% ou mais deve ser eutanizado.</li>
</ol>8. Excisão de ferida
<ol><li>No final do experimento, sacrifique os camundongos usando inalação de CO2, seguido de luxação cervical. Descarte a carcaça animal de acordo com os protocolos ABSL-2 da instituição.</li>
	<li>Leitos de feridas de consumo usando tesouras e fórceps estéreis em um BSC. Coloque cada cama ferida em 1 mL de PBS estéril em um tubo de polipropileno de 1,5 mL. Pique o tecido da ferida com uma tesoura. Todas as feridas devem ser tratadas como ASBL-2, mesmo que não sejam consideradas infectadas.</li>
	<li>Incubar em um shaker a 300 rpm por 2 h a 4 °C. Vórtice cada tubo para 10 s e diluir serialmente o efluente bacteriano em PBS. Plaquere o efluente bacteriano diluído em agar LB para enumerar a carga bacteriana.</li>
	<li>Considere feridas infectadas se o sinal luminescente na ferida estiver acima da luminescência do fundo e mais bactérias são detectadas no efluente da ferida do que em feridas inoculadas com PBS como controle.</li>
</ol>

<ol><li>Sen, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skin+wounds%3A+a+major+and+snowballing+threat+to+public+health+and+the+economy%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy.</a> Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).</li>
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<li>van Gennip, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+polymorphonuclear+leukocytes+and+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+on+silicone+implants+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interactions between polymorphonuclear leukocytes and Pseudomonas aeruginosa biofilms on silicone implants in vivo.</a> Infection and Immunity. 80 (8), 2601-2607 (2012).</li>
<li>Trøstrup, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+aggravates+skin+inflammatory+response+in+BALB%2Fc+mice+in+a+novel+chronic+wound+model%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model.</a> Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).</li>
<li>Zhao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+study+of+delayed+wound+healing+in+a+biofilm-challenged+diabetic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Time course study of delayed wound healing in a biofilm-challenged diabetic mouse model.</a> Wound Repair and Regeneration. 20 (3), 342-352 (2012).</li>
<li>Brubaker, A. L., Rendon, J. L., Ramirez, L., Choudhry, M. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+neutrophil+chemotaxis+and+infiltration+contributes+to+delayed+resolution+of+cutaneous+wound+infection+with+advanced+age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunolology%22%5BJournal%5D)">Reduced neutrophil chemotaxis and infiltration contributes to delayed resolution of cutaneous wound infection with advanced age.</a> Journal of Immunolology. 190 (4), 1746-1757 (2013).</li>
<li>Watters, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+perturb+wound+resolution+and+antibiotic+tolerance+in+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice.</a> Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).</li>
<li>Lee, C., Kerrigan, C. L., Picard-Ami, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclophosphamide-induced+neutropenia%3A+effect+on+postischemic+skin-flap+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Cyclophosphamide-induced neutropenia: effect on postischemic skin-flap survival.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 89 (6), 1092-1097 (1992).</li>
<li>Sweere, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+response+to+Chronic+Pseudomonas+aeruginosa+wound+infection+in+immunocompetent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">The immune response to Chronic Pseudomonas aeruginosa wound infection in immunocompetent mice.</a> Advances in Wound Care. , (2019).</li>
<li>Sweere, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+trigger+antiviral+immunity+and+prevent+clearance+of+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection.</a> Science. 363 (6434), (2019).</li>
</ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes para divulgar.

Desenvolvemos um novo modelo de infecção por feridas de inoculação tardia P. aeruginosa. A estratégia de retardar a inoculação com bactérias até 24 h após o ferimento excisional permite a avaliação de infecções por feridas durante um prazo de 1 semana. Usando uma cepa luminescente de P. aeruginosa,é possível rastrear a progressão da infecção ao longo do curso de infecção. O curso mais longo de infecção em comparação com outros modelos de infecção por P. aeruginosa permitirá novas oportunidades ...

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) é uma bactéria em forma de vara gram-negativa com crescente relevância para a saúde e doenças humanas. É responsável pela morbidade e mortalidade extensivas em ambientes nosocomiais, particularmente envolvendo infecções por feridas em pacientes imunocomprometidos1,2. O surgimento de cepas multidrogaresistentes deste patógeno proporcionou mais impulso para a investigação de fatores que contribuem para a virulência P. aeruginosa, mecanismos de resistência a antibióticos P. aeruginosa e novos métodos de prevenção e tratamento desta infecção mortal3. Como tal, a necessidade de modelos animais de infecção por feridas crônicas como ferramentas para investigar essas questões de pesquisa nunca foi tão grande.
Infelizmente, muitos modelos animais de infecção por P. aeruginosa tendem a simular infecção aguda com resolução rápida de infecção ou declínio rápido devido à sepse4,5, que não simula adequadamente a natureza frequentemente crônica dessas infecções. Para resolver essa desvantagem, alguns modelos utilizam a implantação de corpos estranhos, como contas de agar, implantes de silicone ou géis alginatos6,7,8. Outros modelos usam camundongos imunocomprometidos devido à idade avançada, obesidade ou diabetes, ou por meios farmacológicos como neutropenia induzida por ciclofosfhamide9,10,11,12. No entanto, ou o uso de materiais estranhos ou hospedeiros imunes comprometidos provavelmente altera o processo inflamatório local, dificultando a compreensão da fisiopatologia envolvida em infecções crônicas de feridas em hospedeiros com sistemas imunológicos normais.
Desenvolvemos um modelo crônico de infecção por ferida de P. aeruginosa em camundongos que envolve inoculação tardia com bactérias após ferimentos excisional. A inoculação retardada permite experimentos que avaliam a carga bacteriana que se estende por pelo menos 7 dias. Este modelo abre novas oportunidades para investigar tanto a patogênese quanto novos tratamentos de infecções crônicas p. aeruginosa.

<table><tbody><tr><td>Injeção de cloreto de sódio a 0,9%</td><td>Hospira</td><td>2484457</td><td></td></tr><tr><td>18 G x 1 agulha estéril</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>25 G x 1 1/5 agulha estéril</td><td>BD</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>Cotonete com álcool</td><td>BD</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>Aura Imaging Software</td><td>Spectral Instruments Imaging</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Purdue Frederick Company</td><td>19-065534</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina SR LAB</td><td>Zoopharm</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>C57BL / 6J camundongos machos</td><td>O Laboratório Jackson</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>perfurador de biópsia descartável, tesoura</td> fina <td>Integra</td><td>33-36</td><td></td>de 6 mm</tr><tr><td>- carboneto de tungstênio Ferramentas de</td><td>Ciência Fina</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>Esterilizador Seco de Esferas de Vidro</td><td>Aparelho de Harvard</td><td>61-0183</td><td></td></tr><tr><td>Ágar granulado</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP9744</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento</td><td>Milliard</td><td>804879481218</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de insulina com agulha de 28 G</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Lago X Imaging System</td><td>Spectral Instruments Imaging</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>LB caldo</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Leur-Lok de 1 mL</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Mini Arco Animal Trimmer</td><td>Wahl Professional</td><td>919152</td><td></td></tr><tr><td>Nair Loção de Depilação com Óleo de Bebê</td><td>Church e Dwight</td><td>n/a</td><td>Disponível em qualquer farmácia</td></tr><tr><td>Octagon Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11041-08</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Press and Seal Cling Wrap</td><td>Glad</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de insulina SafetyGlide com agulha de 30 G</td><td>BD</td><td>305934</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de insulina Safetyglide, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW</td><td>BD</td><td>305934</td><td></td></tr><tr><td>Scale</td><td>Ohaus Scout Pro</td><td>SP202</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento Nutricional Suplementar</td><td>Henry Schein Saúde Animal</td><td>29908</td><td></td></tr><tr><td>Tegaderm, 6 cm x 7 cm</td><td>3M</td><td>1624W</td><td></td></tr></tbody></table>

um modelo de inoculação retardada da infecção crônica de pseudomonas aeruginosa ferida

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) é um grande patógeno nosocomial de crescente relevância para a saúde e doença humana, particularmente no cenário de infecções crônicas de feridas em pacientes diabéticos e hospitalizados. Há uma necessidade urgente de modelos de infecção crônica para auxiliar na investigação da patogênese ferida e no desenvolvimento de novas terapias contra esse patógeno. Aqui, descrevemos um protocolo que usa inoculação atrasada 24 horas após ferimentos excisional de espessura total. A infecção da matriz de feridas provisórias presente neste momento, ou a liberação rápida ou a disseminação da infecção e, em vez disso, estabelece infecção crônica que dura de 7 a 10 dias sem a necessidade de implantação de materiais estranhos ou supressão imunológica. Este protocolo imita um curso temporal típico de infecção pós-operatória em humanos. O uso de uma cepa luminescente P. aeruginosa (PAO1:lux) permite a avaliação diária quantitativa da carga bacteriana para infecções por feridas P. aeruginosa. Este novo modelo pode ser uma ferramenta útil na investigação da patogênese bacteriana e no desenvolvimento de novas terapias para infecções crônicas de feridas P. aeruginosa.

Utilizando uma cepa luminescente de PAO1 com uma codificação plasmídea codificando o sistema de repórteres luxABCDE (PAO1:lux), realizamos ferimentos excisional em camundongos, inoculamos essas feridas com plânctnico P. aeruginosa 24 h depois, e medimos carga bacteriana ao longo do tempo (Figura 1 e Figura 2). Uma imagem representativa obtida usando um sistema óptico de imagem demonstra que este modelo resulta em lumines...

Descrevemos um protocolo de inoculação atrasado para gerar infecções crônicas de feridas em camundongos imunocompetentes.

Um modelo de inoculação retardada da infecção crônica de pseudomonas aeruginosa ferida

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...

Este protocolo é significativo porque descreve um modelo para infecção crônica da ferida pseudomonas aeruginosa sem a necessidade de implantação de material estranho ou supressão imunológica. A inoculação retardada com Pseudomonas aeruginosa 24 horas após a espessura total do ferimento excisional prossala a liberação rápida e disseminação da bactéria, estabelecendo uma infecção que dura de sete a dez dias. Este modelo único será uma ferramenta útil para as investigações de patogênese bacteriana, interações de patógenos hospedeiros e o desenvolvimento de novas terapias para infecções crônicas da ferida pseudomonas aeruginosa.Me auxiliando em uma demonstração do procedimento estará Dan Liu, um estudante de medicina do Laboratório Bollyky. Antes de iniciar o procedimento, pese um rato anestesiado de oito a 12 semanas de idade para obter um peso de linha de base e colocar o mouse na posição propensa. Depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal, injete subcutâneamente o mouse com 250 microliters de cloreto de sódio estéril pré-aquecido de 0,9% em cada flanco.Use uma máquina de barbear elétrica para remover o cabelo da área dorsal do mouse e aplique uma fina camada de creme depilatório à pele exposta. Após 20 a 60 segundos, remova o cabelo e o excesso de loção com gaze umedecido em água morna. Para cirurgia de ferida excisional de espessura total, primeiro use uma agulha de calibre 25 para injetar subcutâneamente 0,6 a um miligrama por quilograma de buprenorfina de liberação sustentada na área média dorsal do rato e limpe o local cirúrgico de forma circular com três betadinas estéreis alternativos e cotonetes de álcool.Coloque uma cortina de plástico sobre o local cirúrgico e estique a pele esticada caudally. Quando a pele secar, use um soco de biópsia de pele de seis milímetros de diâmetro estéril para fazer uma incisão inicial através da epiderme dorsal esquerda, seguida de uma segunda incisão na epiderme dorsal direita. Use fórceps para galoar a pele a partir do centro da área de ferida delineada pela esquerda e usar tesouras para extirir as camadas epidérmicas e dérmicas.Depois de repetir a incisão na área de ferida delineada à direita para criar feridas excisionais simétricas, lave ambas as feridas com 50 microliters de soro fisiológico estéril. Quando o local cirúrgico e a pele circundante secarem, cubra as feridas e o dorso com um curativo transparente e coloque o rato em uma gaiola limpa em uma almofada de aquecimento com monitoramento até a recumbência total. 24 horas após a cirurgia, pese novamente o camundongo re-anestesiado e injete o animal subcutâneamente com 250 microlitadores de cloreto de sódio pré-aquecido 0,9% em ambos os flancos.Em seguida, carregue 100 microliters da suspensão luminescente de cepa P.aeruginosa em uma seringa de tampa de segurança tuberculina de 500 microliter equipada com uma agulha calibre 27 e injete 40 microliters de suspensão de bactérias através do curativo de filme transparente em cada ferida. Certifique-se de que a suspensão bacteriana está bem misturada e que o curativo transparente está intacto. Certifique-se de perfurar o curativo transparente apenas uma vez com o lado da luneta da agulha para cima.Em seguida, devolva o rato à sua gaiola em uma página de aquecimento com monitoramento e forneça pasta de suplemento nutricional de alta caloria sanduíche entre pelotas de alimentos no chão da gaiola. Plaque o inóculo restante em uma placa de ágar LB e conte as colônias para confirmar o número de bactérias que foram administradas. Para a imagem in vivo das feridas infectadas, siga os protocolos de contenção do nível de bio segurança dois para o transporte dos camundongos de e para o instrumento de imagem e coloque o camundongo anestesiado na posição propensa dentro da câmara de imagem.No software de imagem, defina o tempo de exposição, binning, f-stop e campo de visão conforme apropriado para o experimento. Em seguida, crie uma região de interesse no local da ferida e meça o fluxo médio detectado em fótons por segundo. Para medir o fundo, crie uma região de interesse sobre uma área aleatória na plataforma de imagem e subtraia o número de fundo de fótons por segundo.No final do experimento, em um armário de bio segurança, use tesouras estéreis e fórceps para extirpar os leitos de ferida e colocar cada cama em um mililitro de PBS estéril em um tubo de polipropileno de 1,5 mililitro. Pique o tecido da ferida com uma tesoura e incubar os pedaços de tecido em um agitador a quatro graus Celsius em 300 rotações por minuto durante duas horas. No final da incubação, vórtice de cada tubo por 10 segundos antes de diluir em série o efluente bacteriano na PBS e emplacar o efluente bacteriano diluído no ágar LB para quantificar a carga bacteriana.Esta imagem representativa obtida usando um sistema óptico de imagem demonstra que este modelo resulta em luminescência detectável. Neste experimento, a infecção atingiu o pico no terceiro dia pós-inoculação e persistiu sete dias após a inoculação com base tanto na bioluminescência quanto na contagem de colônias. A cultura das bactérias isoladas da ferida demonstra ainda que a colônia quantificada formando unidades por ferida se correlaciona com a luminescência detectada.Embora haja uma perda de peso rápida inicial imediatamente após a injeção, injeções salinas e nutrição suplementar podem restaurar os camundongos aos seus pesos iniciais. A dose de inoculação calculada da qual 50% das feridas se tornarão substancialmente infectadas foi determinada em cerca de 7,7 vezes 10 para a segunda colônia formando unidades por mililitro. Doses superiores a uma vezes 10 a quarta colônia formando unidades por mililitro resultam em uma taxa de infecção de 100%.Vários tratamentos tópicos e sistêmicos podem ser aplicados após os procedimentos de woundamento e inoculação para investigar novas terapias potenciais para Pseudomonas aeruginosa. Todo o trabalho com Pseudomonas aeruginosa e camundongos infectados deve ser conduzido com precauções de segurança BSL-2 de acordo com as diretrizes do comitê institucional de biosegurança e uso animal do pesquisador.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: de Vries, C. R., et.al. Um modelo de inoculação retardada da infecção crônica da ferida por Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra a inoculação tardia de Pseudomonas aeruginosa luminescente em um camundongo com duas feridas dorsais de espessura total cobertas por um curativo transparente. Isso facilita a formação de biofilmes e o estabelecimento de infecções crônicas. O monitoramento regular da bioluminescência permite quantificar a carga bacteriana e acompanhar...

Desenvolvimento de um modelo de camundongo para infecção crônica de feridas cutâneas por Pseudomonas aeruginosa 

Descreve-se o método de ágar-esferas de estabelecer infecção das vias aéreas persistente a longo prazo crônica Pseudomonas aeruginosa no modelo de mouse.

Crônica de Longo Prazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infecção das vias aéreas em ratos

Desenvolvemos um modelo de lesão pulmonar em camundongos por injeção intratraqueal da bactéria Pseudomonas aeruginosa. Este modelo mimetiza a lesão pulmonar durante a pneumonia e é clinicamente relevante.

Pseudomonas aeruginosa Lesão Pulmonar Induzida Modelo

Embora o estudo in vitro das interações patógeno-hospedeiro permita a caracterização de respostas imunes específicas, modelos in vivo são necessários para observar os efeitos de respostas complexas. Usando a exposição a Candida albicans seguida de infecção pulmonar mediada por Pseudomonas aeruginosa, estabelecemos um modelo murino de interações microbianas envolvidas na patogenicidade da pneumonia associada à ventilação mecânica.

Estudar comunidades microbianas<em&gt; In Vivo</em&gt;: Um modelo de interação mediada por anfitrião entre<em&gt; Candida Albicans</em&gt; E<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Nas Airways

Aqui descrevemos um modelo murino diabético romance utilizando camundongos sem pelos para monitoramento em tempo real, não-invasivo, de infecções de ferida biofilme bioluminescentes Pseudomonas aeruginosa. Esse método pode ser adaptado para avaliar a infecção de outras espécies bacterianas e microrganismos geneticamente modificados, incluindo várias espécies biofilmes e testar a eficácia das estratégias de antibiofilm.

Venha para o lado da luz: In Vivo monitoramento de infecções por Pseudomonas aeruginosa biofilme em feridas crônicas em um modelo murino Hairless diabética

Aqui descrevemos um protocolo que permite a análise histológica e molecular de amostras de pele após injeção intradérmica de Candida albicans . Esse protocolo mantém a integridade estrutural da pele e permite a localização do tecido-residente ou recém recrutadas células do sistema imunológico, bem como a distribuição do patógeno.

Profunda dérmica injeção como um modelo de Candida albicans de infecção da pele para análise histológica

As feridas crônicas são desenvolvidas a partir de feridas agudas em um modelo de mouse diabético induzindo altos níveis de estresse oxidativo após uma ferida cutânea de espessura total. A ferida é tratada com inibidores para catalase e glutationa peroxidase, resultando em comprometimento da cicatrização e desenvolvimento de biofilme por bactérias presentes no microbioma cutâneo.

Protocolo para criar feridas crônicas em camundongos diabéticos

A infecção articular periprotética (PJI) causada por patógenos perigosos é comum na ortopedia clínica. Os modelos animais existentes não conseguem simular com precisão a situação real da PJI. Aqui, estabelecemos um modelo de camundongo PJI associado ao biofilme de Candida albicans para pesquisar e desenvolver novas terapêuticas para PJI.

Modelo de Infecção por Candida albicans em Articulação Periprotética em Camundongos

Feridas crônicas resistentes a antibióticos são uma grande ameaça ao sistema de saúde. As infecções por biofilme são teimosas e hostis e podem causar fechamento funcional deficiente da ferida. Relatamos um modelo suíno clinicamente relevante de feridas crônicas de espessura total infectadas por biofilme. Esse modelo é poderoso tanto para estudos mecanicistas quanto para testar intervenções.

Modelo suíno de infecção por biofilme e feridas invisíveis

Atualmente, faltam modelos in vivo passíveis de triagem de medicamentos contra infecções bacterianas crônicas. Aqui, descrevemos um protocolo para infecção de ferida por um isolado clínico de Pseudomonas aeruginosa para gerar uma infecção persistente em larvas de peixe-zebra.

Modelagem de infecção persistente por Pseudomonas aeruginosa em larvas de peixe-zebra feridas

Aprenda a criar um modelo de infecção crônica por Pseudomonas aeruginosa em feridas de camundongos imunocompetentes usando inoculação retardada. Este protocolo permite estudar patogênese bacteriana sem supressão imunológica.

Um modelo de inoculação retardada da infecção crônica de pseudomonas aeruginosa ferida

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