Name: Privação Visual Monocular e Medição de Plasticidade de Dominação Ocular no Córtex Visual Primário do Camundongo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Aprenda a realizar privação visual monocular e medir a plasticidade de dominação ocular no córtex visual primário de camundongos. Este protocolo permite estudar os mecanismos neurais da plasticidade visual durante o período crítico.

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Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de CiênciaNatural da China (81571770, 81771925, 81861128001).

Neste protocolo, camundongos C57Bl/6 masculinos foram obtidos do Instituto de Animais De Laboratório da Academia de Ciências Médicas de Sichuan e do Hospital Popular Provincial de Sichuan. Todos os cuidados com animais e procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais, Universidade de Ciência Eletrônica e Tecnologia da China.
1. Privação monocular (DM) no dia pós-natal 28 em camundongos
<ol><li>Coloque as ferramentas cirúrgicas, a agulha de sutura (0,25 mm de diâmetro, diâmetro da corda 0,07 mm) e os cotonetes de algodão em uma caixa de alumínio e autoclave-los a 120 °C por 0,5 h. Estique a capô com 75% de etanol. Seque as ferramentas cirúrgicas em um forno de secagem.</li>
	<li>Prepare uma solução de 2% de agarose, coloque-a em um banho de água a 75 °C para evitar solidificar.</li>
	<li>Use isoflurane misturado com oxigênio para anestesiar o camundongo (2% de indução e manutenção de 1,2-1,5%). Conserte o mouse no aparelho estereotaxic e use um dispositivo regulador de calor para manter a temperatura do corpo do rato em 37 °C e evitar hipotermia.</li>
	<li>Aplique uma fina camada de pomada ocular à base de petróleo em ambos os olhos.</li>
	<li>o microscópio anatômico com iluminação, sutura a pálpebra em um olho. Faça a agulha passar pelos dois lados da pálpebra 2x (Figura 1A) e faça cerca de quatro pontos.</li>
	<li>Aça o rosca 2-3x e depois corte o fio. Aplique 3 μL de cola de secagem instantânea no nó para aumentar sua estabilidade. Em seguida, corte o fio extra de sutura.</li>
	<li>Forneça uma injeção intraperitoneal de buprenorfina (1 mg/kg) ao camundongo.</li>
	<li>Transfira o rato para uma almofada de aquecimento para manter sua temperatura corporal a 37 °C e evitar hipotermia e monitorá-lo até recuperar a consciência.</li>
	<li>Quando o rato estiver totalmente acordado coloque-o em uma gaiola separada.</li>
	<li>Verifique as pálpebras diariamente para garantir que elas permaneçam fechadas e não infectadas. Exclua o mouse se uma abertura de pálpebras for encontrada.</li>
	<li>Antes da gravação eletrofisiológica, use isoflurane misturado com oxigênio para anestesiar o camundongo (2% de indução e manutenção de 1,2-1,5%).</li>
	<li>Remova os pontos com tesoura ocular para expor o globo ocular. Aparar cuidadosamente as pálpebras dos olhos.</li>
	<li>Lave o olho com a solução da lente e verifique o olho um microscópio para obter clareza. Exclua camundongos com opacidades córneas ou sinais de infecção.</li>
</ol>2. Craniotomia na região binocular do rato V1 após privação monocular no 4º dia
<ol><li>Depois de anestesiar o mouse, verifique a profundidade da anestesia pela falta de resposta a uma pitada de dedo do dedo do dedo do dodo do dedo do dodo do dedo.</li>
	<li>Coloque e conserte o mouse no aparelho estereotaxic. Ajuste a altura da barra de ouvido e a haste do dente para manter o cérebro plano e estável.</li>
	<li>Use uma almofada de aquecimento para manter a temperatura do corpo.</li>
	<li>Aplique uma pomada ocular à base de petróleo na superfície dos olhos para mantê-los úmidos.</li>
	<li>Remova o cabelo na cabeça do rato para expor sua pele. Esfregue a pele com esfregões alternados de iodo e 70% de etanol 3x.</li>
	<li>Incime uma área de 8 x 8 mm da pele entre as orelhas para expor o crânio e remover o tecido do couro cabeludo. Em seguida, remova o tecido conjuntivo sobreposto com 30% de peróxido de hidrogênio.</li>
	<li>Faça um buraco de 1 x 1 mm no crânio acima do cerebelo. Afixar um pequeno parafuso ósseo no buraco como referência.</li>
	<li>Realizar uma pequena craniotomia de 1 mm de diâmetro na região binocular V1 do hemisfério contralateral até o olho privado (Figura 1B, A-P: lambda -0,51-lambda +1,67 mm; M-L: -2,6- -3,0 mm; D-V: 0-1 mm). Remova cuidadosamente o fragmento do crânio sem machucar o cérebro.</li>
	<li>Cubra a superfície cortical exposta com 75 μL de 2% de agarose a 40 °C para evitar a secagem.</li>
	<li>Conserte um eletrodo de tungstênio na moldura estereotaxica. Coloque o eletrodo de tungstênio verticalmente na superfície do córtex exposto, a região binocular de V1, para garantir que as células que são registradas reajam aos dois olhos.</li>
	<li>Use cotonetes de algodão para remover o gel ocular e aplique óleo de silício no olho a cada 2 h.</li>
</ol>3. Estimulação visual e gravação eletrofisiológica
<ol><li>Mascarar o olho com placa de plástico não transparente. Posicione um monitor LCD a 23 cm do olho do mouse.</li>
	<li>Reduza a anestesia para 0,5-0,8% quando o mouse estiver totalmente anestesiado.</li>
	<li>Avance o eletrodo de microeletrodo lentamente com um micromanipulador hidráulico de óleo. Pare quando uma alta relação sinal-ruído é observada e o eletrodo for avançado para a camada 4 (Figura 1C, aproximadamente 250-450 μm de profundidade). Certifique-se de que o fator amplificador seja fixado em 1.000, o filtro de 300-100 Hz e a taxa de amostra a 40 Hz.</li>
	<li>Apresentar uma grade sinusoidal em campo completo (Figura 1D, 12 direções, 100% contraste, 2 Hz de frequência temporária, 0,04 ciclos por grau de frequência espacial) no monitor LED.</li>
	<li>Meça a resposta da célula estimulando o olho ipsilateral e contralateral separadamente. Presente de 3-5x total.</li>
	<li>Meça as respostas de cinco a oito células em cada penetração. Realize de quatro a seis penetrações em cada mouse.</li>
	<li>Após a gravação, ajuste a vazão de isoflurano para 5% ou mais, continue a exposição ao isoflurano por 1 min e, em seguida, realize a luxação cervical. NOTA: Penetrações separadas foram espaçadas pelo menos 200 μm de distância na zona binocular V1.</li>
</ol>4. Classificação de pico off-line e análise de dados
<ol><li>Detecte picos quando o sinal bruto cruza um nível de limiar. Alinhar picos capturados no primeiro pico positivo ou negativo. Use software para detectar picos de diferentes células.</li>
	<li>Coloque dois cursores: um positivo e outro para deflexão negativa. Defina o modelo de pico(Figura 2A). Defina a área de modelo para isso com a variação mais significativa entre diferentes classes de picos.</li>
	<li>Use a análise principal do componente para separá-los em clusters. Os métodos de agrupamento podem variar entre diferentes laboratórios.</li>
	<li>Classifique o pico de um limite usando o algoritmo k-means.</li>
	<li>Correlacionar a orientação com a taxa de disparo de pico e traçar as curvas de ajuste de orientação para o olho ipsilateral e contralateral.</li>
	<li>Calcule o índice OD para a unidade única, que representa a relação de força de resposta contralateral/ipsilateral: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60600/60600eq1a.jpg"> onde Rcontra e Ripsi são a resposta ideal da célula para o olho contralateral e ipsilateral, respectivamente, e Rspon é a atividade espontânea da célula.</li>
	<li>Atribuir pontuação oD para 1-7 da seguinte forma: − 1 a −0,75 = 1; −0,75 a −0,45 = 2; −0,45 a −0,15 = 3; −0,15 a 0,15 = 4; 0,15 a 0,45 = 5; 0,45 a 0,75 = 6; e 0,75 a 1 = 7.</li>
	<li>Calcular o índice de viés contralateral (ICB): <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60600/60600eq2a.jpg"> onde N é o número da célula, e nx iguala o número da célula com pontuações od igual a x.</li>
</ol>

<ol><li>Hubel, D. H., Wiesel, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+monocular+deprivation+in+kittens%5BTitle%5D)+AND+%22Naunyn-Schmiedebergs+Archiv+f%C3%BCr+experimentelle+Pathologie+und+Pharmakologie%22%5BJournal%5D)">Effects of monocular deprivation in kittens.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archiv für experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 248 (6), 492-497 (1964).</li>
<li>Daw, N. W., Fox, K., Sato, H., Czepita, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+period+for+monocular+deprivation+in+the+cat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Critical period for monocular deprivation in the cat visual cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 67 (1), 197-202 (1992).</li>
<li>Guire, E. S., Lickey, M. E., Gordon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+period+for+the+monocular+deprivation+effect+in+rats%3A+assessment+with+sweep+visually+evoked+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Critical period for the monocular deprivation effect in rats: assessment with sweep visually evoked potentials.</a> Journal of Neurophysiology. 81 (1), 121-128 (1999).</li>
<li>Wang, L., Sarnaik, R., Rangarajan, K. V., Liu, X., Cang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+receptive+field+properties+of+neurons+in+the+superficial+superior+colliculus+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Visual receptive field properties of neurons in the superficial superior colliculus of the mouse.</a> Journal of Neuroscience. 30 (49), 16573-16584 (2010).</li>
<li>Niell, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Types%2C+circuits%2C+and+receptive+fields+in+the+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cell Types, circuits, and receptive fields in the mouse visual cortex.</a> Annual Review of Neuroscience. 38 (1), 413-431 (2015).</li>
<li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+specific+interneurons+improves+V1+feature+selectivity+and+visual+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of specific interneurons improves V1 feature selectivity and visual perception.</a> Nature. 488 (8), 379-383 (2012).</li>
<li>Cossell, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+excitatory+synaptic+strength+in+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional organization of excitatory synaptic strength in primary visual cortex.</a> Nature. 518 (2), 399-403 (2015).</li>
<li>Lacaruso, M. F., Gasler, L. T., Hofer, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+organization+of+visual+space+in+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synaptic organization of visual space in primary visual cortex.</a> Nature. 547 (7), 449-452 (2017).</li>
<li>Metin, C., Godement, P., Imbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primary+visual+cortex+in+the+mouse%3A+Receptive+field+properties+and+functional+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The primary visual cortex in the mouse: Receptive field properties and functional organization.</a> Experimental Brain Research. 69 (3), 594-612 (1988).</li>
<li>Marshel, J. H., Garrett, M. E., Nauhaus, I., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+specialization+of+seven+mouse+visual+cortical+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Functional specialization of seven mouse visual cortical areas.</a> Neuron. 72 (6), 1040-1054 (2011).</li>
<li>Gordon, J. A., Stryker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+plasticity+of+binocular+responses+in+the+primary+visual+cortex+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent plasticity of binocular responses in the primary visual cortex of the mouse.</a> The Journal of Neuroscience. 16 (10), 3274-3286 (1996).</li>
<li>McGee, A. W., Yang, Y., Fischer, Q. S., Daw, N. W., Strittmatter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-driven+plasticity+of+visual+cortex+limited+by+myelin+and+Nogo+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Experience-driven plasticity of visual cortex limited by myelin and Nogo receptor.</a> Science. 309 (5744), 2222-2226 (2005).</li>
<li>Sawtell, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor-dependent+ocular+dominance+plasticity+in+adult+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor-dependent ocular dominance plasticity in adult visual cortex.</a> Neuron. 38 (6), 977-985 (2003).</li>
<li>Hofer, S. B., Mrsic-Flogel, T. D., Bonhoeffer, T., Hubener, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prior+experience+enhances+plasticity+in+adult+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Prior experience enhances plasticity in adult visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 9 (12), 127-132 (2006).</li>
<li>Crozier, R. A., Wang, Y., Liu, C., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deprivation-induced+synaptic+depression+by+distinct+mechanisms+in+different+layers+of+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Deprivation-induced synaptic depression by distinct mechanisms in different layers of mouse visual cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (4), 1383-1388 (2007).</li>
<li>Tagawa, Y., Kanold, P. O., Majdan, M., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+periods+of+functional+ocular+dominance+plasticity+in+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Multiple periods of functional ocular dominance plasticity in mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 8 (3), 380-388 (2005).</li>
<li>Lickey, M. E., Pham, T. A., Gordon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swept+contrast+visual+evoked+potentials+and+their+plasticity+following+monocular+deprivation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Swept contrast visual evoked potentials and their plasticity following monocular deprivation in mice.</a> Vision Research. 44, 3381-3387 (2004).</li>
<li>Cang, J., Kalatsky, V. A., Lowel, S., Stryker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+intrinsic+signal+as+a+measure+of+cortical+plasticity+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the intrinsic signal as a measure of cortical plasticity in the mouse.</a> Vision Neuroscience. 22 (5), 685-691 (2005).</li>
<li>Khan, I. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+different+suturing+techniques+for+cystotomy+closure+in+canines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+%26+Plant+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evaluation of different suturing techniques for cystotomy closure in canines.</a> Journal of Animal & Plant Sciences. 23 (4), 981-985 (2013).</li>
<li>Weisman, D. L., Smeak, D. D., Birchard, S. J., Zweigart, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+a+continuous+suture+pattern+with+a+simple+interrupted+pattern+for+enteric+closure+in+dogs+and+cats%3A+83+cases+%281991-1997%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Veterinary+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Comparison of a continuous suture pattern with a simple interrupted pattern for enteric closure in dogs and cats: 83 cases (1991-1997).</a> Journal of the American Veterinary Medical Association. 214 (10), 1507-1510 (1999).</li>
<li>Heneghan, C. P. H., Thornton, C., Navaratnarajah, M., Jones, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+isoflurane+on+the+auditory+evoked+response+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22BJA%3A+British+Journal+of+Anaesthesia%22%5BJournal%5D)">Effect of isoflurane on the auditory evoked response in man.</a> BJA: British Journal of Anaesthesia. 59 (3), 277-282 (1987).</li>
<li>Mitzdorf, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+source-density+method+and+application+in+cat+cerebral+cortex%3A+investigation+of+evoked+potentials+and+EEG+phenomenal%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Current source-density method and application in cat cerebral cortex: investigation of evoked potentials and EEG phenomenal.</a> Physiological Reviews. 65 (1), 37-100 (1985).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Apresentamos um protocolo detalhado para MD e medindo plasticidade od por gravação de unidade única. Este protocolo é amplamente utilizado na neurociência visual. Embora o protocolo de DM não seja complicado, existem alguns procedimentos cirúrgicos críticos que devem ser seguidos cuidadosamente. Primeiro, há dois detalhes importantes garantindo a qualidade da costura. A sutura é suficientemente estável se os pontos estiverem concentrados na porção medial da pálpebra. Além disso, 3 μL de cola é aplicado na cabeça do nó pa...

A privação visual monocular é um excelente paradigma experimental para examinar a plasticidade V1. Para estudar a importância da experiência visual no desenvolvimento neural, David Hubel e Torsten Wiesel1,2 gatinhos privados de visão normal em um olho em vários pontos de tempo e por períodos variados de tempo. Eles então observaram as mudanças na intensidade de resposta em V1 para os olhos privados e não privados. Seus resultados mostraram um número anormalmente baixo de neurônios reagindo ao olho que havia sido suturado fechado nos primeiros três meses. No entanto, as respostas dos neurônios nos gatinhos permaneceram idênticas em todos os aspectos aos olhos de um gato adulto normal que foi suturado fechado por um ano, e os gatinhos não se recuperaram. MD em gatos adultos não pode induzir plasticidade od. Portanto, o impacto da experiência visual na fiação V1 é forte durante uma breve e bem definida fase de desenvolvimento, antes e depois da qual os mesmos estímulos têm menos influência. Tal fase de maior suscetibilidade à entrada visual é conhecida como o período crítico no córtex visual.
Embora o camundongo seja um animal noturno, neurônios individuais no camundongo V1 têm propriedades semelhantes aos neurônios encontrados em gatos3,4,5. Nos últimos anos, com o rápido desenvolvimento da tecnologia transgênica, um número crescente de estudos em neurociência visual tem usado camundongos como modelo experimental6,7,8. Em estudos visuais de camundongos, neurocientistas usam mutantes e linhas de ratos de nocaute, que permitem o controle sobre a composição genética dos camundongos. Embora os camundongos V1 não tenham colunas od, neurônios únicos na zona binocular V1 mostram propriedades significativas de OD. Por exemplo, a maioria das células responde mais fortemente à estimulação contralateral do que à estimulação ipsilateral. O fechamento temporário de um olho durante o período crítico induz uma mudança significativa na distribuição do índice OD9,10,11. Portanto, o MD pode ser usado para estabelecer um modelo de plasticidade de OD para investigar como genes envolvidos em distúrbios do desenvolvimento neural influenciam a plasticidade cortical in vivo.
Aqui, introduzimos um método experimental para MD e sugerimos um método comumente usado (gravação eletrofisiológica) para analisar a mudança na plasticidade od durante a privação visual monocular. O método tem sido amplamente utilizado em muitos laboratórios por mais de 20 anos12,13,14,15,16. Existem outros métodos utilizados na medição da plasticidade od também, como o potencial visual crônico evocado (VEP) registrando17, e imagen óptica intrínseca (IOI)18. A vantagem significativa deste método agudo é que é fácil de seguir, e os resultados são notavelmente confiáveis.

<table><tbody><tr><td>502 cola</td><td>M & Fornecedor verificado - G Chenguang Stationery Co., Ltd.</td><td></td><td></td>AWG97028</tr><tr><td>Cartão de Aquisição</td><td>National Instument</td><td>PCI-6250</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biowest</td><td>G-10</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Amplificador A-M System</td><td>Modelo 1800</td><td></td></tr><tr><td>Atropina</td><td>Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd</td><td>A135946-5</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho Estereotáxico Cerebral</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>68001</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de mola Cohan-Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-02</td><td></td></tr><tr><td>Soluções de lentes de contato</td><td>Beijing Dr. Lun Eye Care Products Co., Ltd.</td><td></td><td>Cotonetes de</td></tr><tr><td>algodão</td><td>GM17064 Henan Guangderun Medical Instruments Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Porta-agulhas finas</td><td>SuZhou Stronger Medical Instruments Co., Ltd</td><td>CZQ1370</td><td></td></tr><tr><td>Forcep</td><td>66 Vision Tech Co., Ltd.</td><td>53320A</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>66 Vision Tech Co., Ltd.</td><td>53072</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>66 Tecnologia Co. da visão, Ltd.</td><td>#5</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento</td><td>Stryker</td><td>TP 700 T</td><td></td></tr><tr><td>Iluminador</td><td>Motic China Group Co., Ltd.</td><td>MLC-150C</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>R510-22</td><td></td></tr><tr><td>Monitor LCD</td><td>Philips (China) Investment Co., Ltd.</td><td>39PHF3251 / T3</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>SOPTOP</td><td>SZMT1</td><td></td></tr> Monitor <tr><td>de sinais vitais não invasivo Micromanipulador</td> hidráulico de óleo <td>Mouseox</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>NARISHIGE International Ltd.</td><td>PC-5N06022</td><td></td></tr><tr><td>Petrolatum Eye Gel</td><td>Dezhou Yile Disinfection Technology Co., Ltd.</td><td>17C801</td><td></td></tr><tr><td>Spike2</td><td>Cambridge Electronic Design, Cambridge, Reino Unido</td><td>Spike2 Versão 9</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica</td><td>66 Vision Tech Co., Ltd.</td><td>54010</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica</td><td>66 Vision Tech Co., Ltd.</td><td>54002</td><td></td></tr><tr><td>agulha de sutura</td><td>Ningbo Medical Co., Ltd</td><td>3/8 arco 2.5 * 8</td><td></td></tr><tr><td>eletrodo de tungstênio</td><td>FHC, Inc</td><td>L504-01B</td><td></td></tr><tr><td>Xylocaine</td><td>Huaqing</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

privação visual monocular e medição de plasticidade de dominação ocular no córtex visual primário do camundongo

Monocular Visual Deprivation and Ocular Dominance Plasticity Measurement in the Mouse Primary Visual Cortex

A privação visual monocular é um excelente paradigma experimental para induzir a plasticidade de resposta cortical visual primária. Em geral, a resposta do córtex ao olho contralateral a um estímulo é muito mais forte do que a resposta do olho ipsilateral no segmento binóculo do córtex visual primário do camundongo (V1). Durante o período crítico dos mamíferos, suturar o olho contralateral resultará em uma rápida perda de capacidade de resposta das células V1 para estimulação ocular contralateral. Com o desenvolvimento contínuo de tecnologias transgênicas, cada vez mais estudos estão usando camundongos transgênicos como modelos experimentais para examinar os efeitos de genes específicos na plasticidade de dominação ocular (OD). Neste estudo, introduzimos protocolos detalhados para privação visual monocular e calculamos a mudança na plasticidade od no mouse V1. Após a privação monocular (MD) por 4 dias durante o período crítico, as curvas de ajuste de orientação de cada neurônio são medidas, e as curvas de ajuste da camada quatro neurônios em V1 são comparadas entre a estimulação dos olhos ipsilaterais e contralaterais. O índice de viés contralateral (ICB) pode ser calculado usando o escore ocular de OD de cada célula para indicar o grau de plasticidade od. Esta técnica experimental é importante para estudar os mecanismos neurais da plasticidade da OD durante o período crítico e para o levantamento dos papéis de genes específicos no desenvolvimento neural. A maior limitação é que o estudo agudo não pode investigar a mudança na plasticidade neural do mesmo camundongo em um momento diferente.

Os resultados experimentais aqui descritos permitem medições bem sucedidas de plasticidade de MD e OD de um rato privado e não privado durante o período crítico (P19-P32). A Figura 1 mostra como realizar gravações de unidade única na camada 4 da V1 a zona binocular para comparar respostas no olho ipsilateral e contralateral 4 dias após o MD. A Figura 2 mostra as medidas de classificação e ajuste de orientação para estimular os olhos ipsilaterais e contralaterais...

Aqui, apresentamos protocolos detalhados para privação visual monocular e análise de plasticidade de dominação ocular, que são métodos importantes para estudar os mecanismos neurais da plasticidade visual durante o período crítico e os efeitos de genes específicos em desenvolvimento visual.

Privação Visual Monocular e Medição de Plasticidade de Dominação Ocular no Córtex Visual Primário do Camundongo

Monocular visual deprivation is an excellent experimental paradigm to induce primary visual cortical response plasticity. In general, the response of the ...

A privação visual monocular é um excelente protocolo experimental para induzir a plasticidade de resposta visual primária. Normalmente, os neurônios no segmento binóculo do córtex visual primário no camundongo respondem cerca de duas vezes mais fortemente à estimulação do olho contralateral do que ao olho ipsilateral. No entanto, a sutura fechou o olho contralateral durante o período crítico para a plasticidade de dominação ocular resultando na rápida perda de responsividade pelos neurônios V1 para a estimulação ocular contralateral e também seguida por um aumento subsequente na resposta ao olho ipsilateral.Aqui, introduzimos o protocolo experimental para privação monocular e sugerimos um método comumente utilizado para analisar a tendência de dominação ocular durante a privação visual. Coloque as ferramentas cirúrgicas em uma caixa de alumínio e autoclave-as abaixo de 120 graus centígrados por meia hora. Prepare a solução de 2% de agarose na chaleira de banho de água e mantenha-a a 75 graus centígrados.Aplique uma fina camada de pomada ocular em ambos os olhos. Sob o microscópio anatômico com iluminação, sutura as pálpebras. Faça cerca de quatro pontos.Faça de dois a três nódulos do fio. Aplique três microliters de cola de secagem instantânea 502 na cabeça do nó para aumentar a estabilidade do nó. Em seguida, corte o fio tão curto quanto.Quando o rato estiver totalmente acordado, coloque-os em uma gaiola separada. Antes da gravação eletrofisiológica, use isoflurane para anestesiar o rato. Remova os pontos e exponha o globo ocular.Aparar cuidadosamente a pálpebra. Lave os olhos com soluções de lentes de contato e verifique os olhos em busca de clareza. Apenas o mouse com boa condição dos globos oculares pode ser usado.Depois de anestesiar o mouse, coloque o mouse em uma moldura estereotaxic. Use uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal durante todo o procedimento. Aplique a pomada ocular na superfície dos olhos para mantê-la úmida.Remova o cabelo do rato para expor sua pele. Incisar uma área de oito milímetros multiplicada por oito milímetros de área da pele entre ambas as orelhas para expor o crânio e remover o tecido do couro cabeludo. Em seguida, remova o tecido conjuntivo sobrelado com peróxido de hidrogênio.Faça um buraco no crânio acima do cerebelo. Fixar um pequeno parafuso ósseo no orifício como referência. Realize uma pequena craniotomia de um milímetro de diâmetro na região binóculo V1.Remova cuidadosamente o fragmento do crânio sem ferir o cérebro. Cubra a superfície cortical exposta com 2% de agarose para evitar a secagem. Fixar um eletrodo de tungstênio no quadro estereotaxic.Coloque o eletrodo de tungstênio verticalmente na região do binóculo V1 para garantir que as células que são registradas reagem aos dois olhos. O estímulo é separado por 30 graus em um bloco aleatório. Foram apresentados de três a cinco blocos em cada medição.Mascarar um olho com placa de plástico não transparente. Apresentar LCD1 para posicionado em 23 centímetros dos olhos do mouse. Avanço microelerode lentamente pelo micromanipulador hidráulico de óleo.Pare o sinal de alta relação de ruído do sinal quando o eletrodo for avançado para a camada quatro e inicie a medição. Amplificamos as atividades de pico a um fator de 1.000 e filtramos de 300 a 10 kilohertz e depois amostramos a 40 kilohertz. Em seguida, mascarar o outro olho e medir a resposta do olho contralateral.Sinais medidos por eletrodos únicos são atividades populacionais. Use software para separar picos de diferentes células. Primeiro, filtrar o sinal de 500 a 5.000 hertz.Coloque dois cursores, um para deflexão positiva e outro para picos negativos de deflexão. Configure modelos de espetos. Defina a área de modelos onde apresenta a maior variação entre diferentes classes de picos.Use a análise dos componentes principais para separá-los em clusters. Classificar os picos de um limite usando o algoritmo k significa. Correlacionar a orientação com a taxa de disparo de picos e traçar as curvas de ajuste de orientação para os olhos ipsilaterais e contralaterais.Em seguida, calcule o índice OD para células únicas que representam a resposta contralateral e ipsilateral Atribua um escore de OD para cada célula de acordo com o índice OD. Calcule o índice de viés contralateral de acordo com a fórmula. Este diagrama mostra as curvas de ajuste de orientação do olho ipsilateral e contralateral em camundongos monoculares privados e sem privação.Este protocolo permite uma privação visual monocular bem sucedida e a medição de dominância ocular de um rato privado e não privado em período crítico. Acabamos de mostrar como realizar este experimento e analisamos a mudança na dominância ocular durante a privação visual. Durante o experimento, é importante evitar a infecção no processo de sutura e interação durante o registro eletrofisiológico.Obrigado por assistir nosso vídeo.

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Research

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