Name: Uso de Termoforese microescala para medir interações proteína-lipídicas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 45 s
Description: Aprenda a usar termoforese microescala marcada para medir constantes de dissociação (KDs) em interações proteína-lipídicas com Vam7 e ácido fosfatídico. Este método rápido e de baixo custo é ideal para desenvolvimento farmacêutico inicial.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Esta pesquisa foi apoiada por uma bolsa da Fundação Nacional de Ciência (MCB 1818310) para a RAF. Este trabalho foi apoiado em parte pela Unidade de Cristalidade de Biologia Química/Proteína do H. Lee Moffitt Cancer Center (NIH/NCI: P30-CA076292).

1. Preparação de materiais
<ol><li>Preparar soro fisco tampão de fosfato (PBS): 137 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM NaH2PO4 e 2 mM KH2PO4, pH 7.41.</li>
	<li>Prepare o corante NTA-Atto 647 N. Diluir o estoque NTA-Atto 647 N corante para 100 nM de uma solução DMSO 100% em PBS sem Interpol.</li>
	<li>Express Vam7-His8 – Proteína como proteína de fusão em E. coli e purificar usando Ni-NTA e exclusão de tamanho cromatografia8.</li>
	<li>Titular o analito no buffer PBS. Se o analito estiver em um buffer diferente, o MST rotulado não é particularmente sensível a pequenas diferenças tampão de moléculas como o DMSO, a menos que o conteúdo do tampão de analito interaja com proteína rotulada.</li>
</ol>2. Preparação do dispositivo MST
<ol><li>Ligue o interruptor de alimentação na parte de trás do dispositivo.</li>
	<li>Abra o software de controle e certifique-se de que o laptop esteja ligado e conectado no computador conectado ao dispositivo.</li>
	<li>Insira as configurações de fluorescência e MST para este experimento. Definir MST Antes dos 3 s, MST em 30 s, e recuperação de Fluorescência (Fluo.) após 1 s. Antes de medidas de fluorescência inicial e não requer longos tempos; MST é a quantidade real de tempo para que o equilíbrio seja alcançado após a indução do calor.</li>
	<li>
Tabela de Capilares: Para cada tubo capilar, digite o nome do alvo (ligante), o nome do ligante (analito), a concentração do alvo e a maior concentração de titulação e use a razão de titulação de preenchimento automático. Por exemplo, digite 50 nM para a concentração de alvo de Vam7-His8, Vam7-His8 para nome de destino, (1,2-dioctanoyl ácido fosfídico) Di-C8 PA para nome de ligantes, e a maior concentração do ligante selecionando 1:1 e arrastando para slots de autofill 2-16.</li>
	<li>Execute uma varredura de tampa para selecionar o LED apropriado (20% LED (predefinido)) com base no sinal da proteína alvo e ajuste entre unidades de fluorescência de 200 e 2000 para mst rotulado. As varreduras de tampa devem mostrar picos uniformes arredondados em forma de sino.</li>
	<li>Selecione uma gama de poderes MST e digite valores para cada um testar o ajuste de ligação mais robusto e aperte o Start Cap Scan + Measurement, escaneando diferentes valores para determinar as melhores condições de funcionamento para uma determinada interação que está sendo testada.</li>
	<li>Determine a potência MST com um melhor ajuste usando o software de análise e a predefinição para termoforese com Tjump. Analisar se encaixa de acordo com a maior separação de fluorescência entre a menor e a maior concentração em comparação com a potência MST com melhor ajuste e selecione o poder MST para ensaios de replicação.</li>
	<li>Determine se o fotobleaching ocorreu entre a primeira e a segunda execução, indo ao software de análise e mudando a análise para o modo expert. Em seguida, selecione fluorescência em vez de termoforese para análise. Selecione o modo de especialista e, em seguida, fotobleaching.</li>
</ol>3. Preparação de amostras para MST rotulado
<ol><li>Traga a solução Vam7-His8 para uma concentração de 200 nM na PBS sem Interpol.</li>
	<li>Leve o corante NTA-Atto 647 para 100 nM em PBS sem Interpol.</li>
	<li>Misture o corante Vam7-His8 e NTA-Atto 647 a uma proporção volumosa de 1:1 e deixe sentar-se à temperatura ambiente coberta de luz por 30 minutos. Determine a concentração adequada de proteína alvo como na seção 2.5 (ver Suplemento sobre a utilização de KD de corante Ni-NTA como demonstrado em vídeo).</li>
	<li>Mistura centrífuga de corante NTA-Atto 647 N e proteína por 10 minutos em uma sala escura usando uma centrífuga de mesa a aproximadamente 8.161 x g.</li>
	<li>Armazene a mistura a 4 °C após o experimento ou no gelo durante o experimento para reutilização dentro de algumas horas, se necessário, a fim de evitar que a proteína se desnaturasse.</li>
	<li>Use o localizador de concentração NT para determinar o intervalo de concentração necessário para a titulação.</li>
	<li>Leve o Di-C8 PA para a concentração máxima adequada na água.</li>
	<li>Titule o analito usando uma diluição seriada de 1:1 no buffer PBS para 16 concentrações com base na etapa anterior. Ao contrário do SPR, a termoforese não é tão sensível às diferenças de buffer.</li>
</ol>4. MST de amostras
<ol><li>Ligue o dispositivo e o laptop conectado.</li>
	<li>Pressione a seta para cima na frente da máquina e deslize o rack capilar para fora.</li>
	<li>Carregue capilares no rack com a maior concentração na posição 1.</li>
	<li>No software de controle, selecione o Canal Vermelho correspondente ao NTA-Atto 647 N.</li>
	<li>Digite informações de concentração, posição e nome para cada capilar na Tabela dos Capilares.</li>
	<li>Execute uma varredura capilar atingindo o Start Cap Scan em 20% LED (predefinido) e ajuste de acordo entre 200 e 2000 unidades de fluorescência usando configurações de intensidade led ou concentração de ligante (proteína rotulada).</li>
	<li>Selecione uma gama de energia MST.</li>
	<li>Iniciar a varredura da tampa + medição MST.</li>
	<li>Analise usando o software de análise.</li>
</ol>5. Análise dos dados do MST
NOTA: O software de análise fornecido pela Nanotemper é proprietário e é realizado usando a Análise de Afinidade M.O. Existem diferentes maneiras de medir afinidades vinculantes baseadas em fluorescência ou termoforese. As versões mais recentes deste software são predefinidas para avaliar automaticamente os dados usando termoforese e são predefinidas para usar a Termoforese com tjump aproveitando ambas as medidas. Alternativamente, pode-se selecionar ou Tjump sozinho ou Termoforesis sozinho. Além disso, o software de análise permite medições estimadas de afinidade usando fluorescência inicial. Essas configurações podem ser acessadas apenas no modo de especialista.
<ol><li>Defina a estratégia de avaliação no software de análise para especialista clicando na caixa para o relâmpago ao lado de um conjunto de dados na tela Seleção de Dados. O Software de Análise é predefinido para análise da Análise MST; no entanto, um pesquisador pode selecionar Criar Novas Análises e selecionar Análise Inicial de Fluorescência, a fim de estimar afinidades vinculantes com base na fluorescência inicial. O modo expert também está disponível para fluorescência inicial. Na análise descrita abaixo, a termoforese e tjump foi utilizada para determinar o KD do apresentado de Vam7-His8 com seu substrato natural, o ácido fosfatidídeo lipídico.</li>
</ol>

<ol><li>Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroScale+Thermophoresis%3A+Interaction+analysis+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Structure%22%5BJournal%5D)">MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond.</a> Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).</li>
<li>Chapman, D., Hochstrasser, R., Millar, D., Youderia, nP. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+proteins+without+primary+sequence+tryptophan+residues%3A+mutant+trp+repressors+with+aliphatic+substitutions+for+tryptophan+side+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Engineering proteins without primary sequence tryptophan residues: mutant trp repressors with aliphatic substitutions for tryptophan side chains.</a> Gene. 163 (1), 1-11 (1995).</li>
<li>Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry+for+measuring+macromolecule-ligand+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li>
<li>Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+interaction+studies+using+microscale+thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Molecular interaction studies using microscale thermophoresis.</a> Assay and Drug Development Technologies. 9 (4), 342-353 (2011).</li>
<li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nature Communications. 1, 100(2010).</li>
<li>Khavrutskii, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification-free+method+of+binding+affinity+determination+by+microscale+thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li>
<li>Seidel, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+microscale+thermophoresis+discriminates+sites+and+affinity+of+protein-ligand+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition+English%22%5BJournal%5D)">Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding.</a> Angewandte Chemie International Edition English. 51 (42), 10656-10659 (2012).</li>
<li>Starr, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidic+acid+induces+conformational+changes+in+Sec18+protomers+that+prevent+SNARE+priming%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphatidic acid induces conformational changes in Sec18 protomers that prevent SNARE priming.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3100-3116 (2019).</li>
<li>Miner, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Central+Polybasic+Region+of+the+Soluble+SNARE+%28Soluble+N-Ethylmaleimide-sensitive+Factor+Attachment+Protein+Receptor%29+Vam7+Affects+Binding+to+Phosphatidylinositol+3-Phosphate+by+the+PX+%28Phox+Homology%29+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Central Polybasic Region of the Soluble SNARE (Soluble N-Ethylmaleimide-sensitive Factor Attachment Protein Receptor) Vam7 Affects Binding to Phosphatidylinositol 3-Phosphate by the PX (Phox Homology) Domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (34), 17651-17663 (2016).</li>
<li>Collins, M. D., Gordon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-chain+phosphoinositide+partitioning+into+plasma+membrane+models%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Short-chain phosphoinositide partitioning into plasma membrane models.</a> Biophysical Journal. 105 (11), 2485-2494 (2013).</li>
<li>Zhao, H., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+guide+to+biochemical+approaches+for+analyzing+protein-lipid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A simple guide to biochemical approaches for analyzing protein-lipid interactions.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (15), 2823-2830 (2012).</li>
<li>Kaufmann, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+proteins%3A+virulence+factors+of+intracellular+disease+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Immunitat+und+Infektion%22%5BJournal%5D)">Stress proteins: virulence factors of intracellular disease agents.</a> Immunitat und Infektion. 17 (4), 124-128 (1989).</li>
<li>le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+membrane+proteins+and+lipids+with+solubilizing+detergents%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).</li>
<li>Corradi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Diversity+in+Lipid-Protein+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Emerging Diversity in Lipid-Protein Interactions.</a> Chemical Reviews. 119 (9), 5775-5848 (2019).</li>
<li>Rainard, J. M., Pandarakalam, G. C., McElroy, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Microscale+Thermophoresis+to+Characterize+Hits+from+High-Throughput+Screening%3A+A+European+Lead+Factory+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">Using Microscale Thermophoresis to Characterize Hits from High-Throughput Screening: A European Lead Factory Perspective.</a> SLAS Discovery. 23 (3), 225-241 (2018).</li>
<li>Sparks, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+competitive+inhibitor+of+phosphatidic+acid+binding+by+the+AAA%2B+protein+NSF%2FSec18+blocks+the+SNARE-priming+stage+of+vacuole+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A small-molecule competitive inhibitor of phosphatidic acid binding by the AAA+ protein NSF/Sec18 blocks the SNARE-priming stage of vacuole fusion.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (46), 17168-17185 (2019).</li>
</ol>

Os autores não declaram conflito de interesses em potencial.

A determinação de Vam7-His8binding para DiC8-PA forneceu um KD robusto para a interação dada, que é um pouco menor do que o KD medido de Vam7-His8 para lipossomos pa (inédito). Essa diferença é mais provável devido à falta de uma membrana, o que geralmente resulta em menor afinidade para interações de ligação lipídica específica da membrana e, portanto, demonstra o papel do andaime de membrana liposso para esta interação11.
<p class="j...

A termoforese de microescala é uma técnica relativamente nova na determinação das constantes de desassociação (KD), bem como as constantes de inibição (IC50) entre ligantes bioquimicamente relevantes. O principal varejista comercial para MST (por exemplo, NanoTemper) oferece duas tecnologias populares de MST: 1) Rotular MST livre exigindo uma marca fluorescente, e 2) rotulada termoforese usando a fluorescência inerente de proteínas dependentes do número de resíduos aromáticos presentes em cada proteína1. Uma desvantagem da termoforese sem rótulo é que, na maioria dos casos, não permite a medição de interações proteína-proteína. No entanto, pode ser possível projetar proteínas sem aminoácidos aromáticos, como o triptofano para uso na termoforese gratuita de rótulo2.
O MST mede o movimento das partículas em resposta à indução de campos de temperatura microscópicos iniciados por um laser infravermelho em tecnologias atualmente disponíveis1. O MST pode ser usado para medir interações proteína-proteína, interações proteína-lipídicas, moléculas proteicas pequenas, experimentos de competição e até interações entre pequenas moléculas, desde que se possa produzir separação de sinal suficiente. Além disso, o MST permite a medição de interações à base de proteína de membrana embutidas em lipossomos ou nanodiscos. A termoforese rotulada aproveita o uso de etiquetas fluorescentes rotuladas permitindo a separação quimicamente controlável do sinal entre ligante e analito. Os valores de KD podem ser obtidos utilizando termoforese para interações envolvendo ligação proteica em baixas concentrações de nanomolar, que na maioria dos casos é uma concentração de proteína muito menor do que a necessária para a calimeto isotermal (ITC)3. Além disso, o MST não possui requisitos rigorosos de tampão, conforme exigido para a ressonância de plasmon superficial (SPR)4 e a termoforese rotulada pode até mesmo ser usada para medir constantes vinculantes de proteínas de interesse de soluções proteicas não totalmente purificadas5 com tags fluorescentes geneticamente inseridas6. Uma desvantagem do MST é que os parâmetros cinéticos não podem ser obtidos prontamente para o MST como no SPR2.
As medidas de termoforese dependem da diferença de temperatura local de uma solução. Este calor pode ser gerado a partir de um laser infravermelho. O dispositivo MST tem um detector de fluorescência acoplado a um feixe infravermelho (IR) e pode captar alterações na fluorescência das mudanças de concentração locais das moléculas fluorescentes no ponto em que o laser IR é alvo. O dispositivo MST utiliza um laser direcionado ao IR acoplado diretamente a um detector de fluorescência focado no mesmo ponto em que o calor é gerado na solução. Isso permite uma detecção robusta de mudanças de temperatura correspondentes ao esgotamento das moléculas no ponto de calor gerado pelo laser IR. A fluorescência medida geralmente diminui mais perto do laser ir em resposta ao aumento da temperatura. As diferenças medidas como resultado podem ser devido a vários fatores, incluindo carga, tamanho ou entropia de solvação. Essas diferenças são medidas como mudanças na fluorescência em resposta à indução do calor ou movimento de moléculas de partes quentes a mais frias do capilar.
Ao carregar um capilar com uma determinada solução, é importante deixar o ar em cada extremidade do capilar e não carregar o capilar completamente cheio. O capilar comercial contém cerca de 10 μL de solução. Pode-se obter medições precisas com 5 μL de solução desde que a solução seja manipulada para o centro do capilar, não há bolhas de ar (potencialmente degas antes do carregamento capilar), e é preciso carregar o rack para não sacudir a solução do centro do capilar, onde o laser infravermelho é alvo. Se o laser não entrar em contato totalmente com a solução, o resultado provavelmente será uma das três saídas inutilizáveis para essa concentração: 1) não ou baixa detecção de fluorescência, 2) maior detecção de fluorescência (potencialmente com pico irregular), ou 3) detecção de fluorescência dentro de outros valores a partir dada titulação, mas com um pico irregular e não encaminhado.
Para termoforese rotulada é ideal ter um sinal de fluorescência acima de 200 e abaixo de 2000 unidades de fluorescência7. O dispositivo MST usa uma gama de intensidades led de 0 a 100, que podem ser selecionadas para alcançar um sinal acima de 200 ou abaixo de 2000. Alternativamente, pode-se usar diferentes concentrações do ligante rotulado para modificar o sinal de fluorescência a um nível ideal. É importante executar uma varredura de tampa com uma determinada medição MST como referência ao analisar dados, pois uma verificação de tampa ruim pode muitas vezes resultar em um ponto que pode ser mais tarde determinado como um outlier. Cada execução deve levar aproximadamente 30 minutos se medir uma única potência MST com uma varredura de tampa. Os dispositivos comerciais permitem alterações na potência do MST. Em versões de software mais antigas isso poderia ser definido de 0 a 100; e nas versões posteriores pode-se selecionar MST baixo, médio ou alto. Para alcançar traços robustos, um pesquisador pode precisar tentar cada um desses e decidir qual configuração do MST resulta nos dados mais robustos para uma determinada interação.

<table><tbody><tr><td>Cy5 Maleimide Corante Mono-Reativo</td><td>GE Healthcare</td><td>PA23031</td><td>Para rotulagem de proteínas</td></tr><tr><td>Graphpad Prsim</td><td>Software</td><td></td><td></td>Graphpad</tr><tr><td>Monolith NT.115 Capilares (1000 contagens)</td><td>Nanotemper</td><td>MO-K022</td><td>Capilares para MST</td></tr><tr><td>Monolith NT.115 máquina</td><td>Nanotemper</td><td></td><td>University equipment</td></tr><tr><td>NTA-Atto 647</td><td>N Sigma</td><td>2175</td><td>rótulo para His tags</td></tr><tr><td>Fosfatidilinositol 3-fosfato diC8 (PI(3)P diC8)</td><td>Echelon</td><td>P-3008</td><td>Lipídio para experimentos de ligação</td></tr></tbody></table>

uso de termoforese microescala para medir interações proteína-lipídicas

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

A capacidade de determinar a afinidade vinculante dos lipídios às proteínas é uma parte essencial da compreensão das interações proteína-lipídicas no tráfico de membranas, transdução de sinais e remodelagem citoesquelética. Ferramentas clássicas para medir tais interações incluem ressonância de plasmon superficial (SPR) e calorimetria de titulação isotermal (ITC). Embora ferramentas poderosas, essas abordagens têm contratempos. O ITC requer grandes quantidades de proteína purificada, bem como lipídios, que podem ser caros e difíceis de produzir. Além disso, o ITC e o SPR são muito demorados, o que poderia agregar significativamente ao custo de realizar esses experimentos. Uma maneira de contornar essas restrições é usar a técnica relativamente nova de termoforese de microescala (MST). O MST é rápido e econômico usando pequenas quantidades de amostra para obter uma curva de saturação para um determinado evento de vinculação. Atualmente existem dois tipos de sistemas MST disponíveis. Um tipo de MST requer rotulagem com um fluoróforo no espectro azul ou vermelho. O segundo sistema conta com a fluorescência intrínseca de aminoácidos aromáticos na faixa UV. Ambos os sistemas detectam o movimento das moléculas em resposta à indução localizada de calor de um laser infravermelho. Cada abordagem tem suas vantagens e desvantagens. O MST sem rótulos pode usar proteínas nativas não cometas; no entanto, muitos analitos, incluindo farmacêuticos, fluoresce na faixa UV, que podem interferir com a determinação de valores de KD precisos. Em comparação, o MST rotulado permite uma maior diversidade de interações paridas mensuráveis utilizando sondas fluorescentes rotuladas ligadas a ligantes com absorções mensuráveis na faixa visível em oposição à UV, limitando o potencial de interferência de sinais de analitos.

Esta é uma saída amostral usando a análise de afinidade. O MST rotulado foi usado para determinar a constante de ligação do Vam7-His8 ao dioctanoyl solúvel (DiC8) PA de um de seus substratos naturais9. A Figura 1 apresenta os traços termoforéticos de um ensaio de uma titulação de 1:1 de DiC8 PA a partir de 500 μM contra 50 nM de Vam7-His8. Fluorescência inicial (tempo antes do laser infravermelho ligado), Tjump (tempo inicialmente após o laser infravermelho ligado) e ...

A termoforese de microescala obtém constantes de ligação rapidamente a baixo custo de material. A termoforese de microescala rotulada ou sem rótulo está comercialmente disponível; no entanto, a termoforese livre de rótulos não é capaz da diversidade de medidas de interação que podem ser realizadas usando rótulos fluorescentes. Fornecemos um protocolo para medições de termoforese rotuladas.

Uso de Termoforese microescala para medir interações proteína-lipídicas

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

A termoforese de microescala rotulada obtém constantes de dissociação, ou KDs, de diversas interações bioquímicas de forma eficiente. Este protocolo e o vídeo acompanhado dão a afinidade aproximada por Vam7, a única proteína snare solúvel na levedura, ao ácido fosfídico. Esta é a maneira que Vam7 associa com duas membranas antes de interagir com outras proteínas.Este método obtém KDs rapidamente para diversas interações bioquímicas a baixo custo, com alta reprodutibilidade e com custo mínimo de proteína. Esta técnica é adequada para o desenvolvimento farmacêutico de primeiro estágio, permitindo que KDs facilmente obtidos determinem potenciais compostos de chumbo. Antes de iniciar uma análise, ligue o interruptor de alimentação na parte de trás do dispositivo MST e abra o software de controle.Confirme se o computador está conectado ao dispositivo e ao status conectado e defina o MST antes de 3 segundos, o MST para 30 segundos e a Recuperação de Fluorescência para depois de 1 segundo. Para cada tubo capilar, digite o nome do ligante alvo, o nome do ligante analito, a concentração do alvo e a maior concentração de titulação usando a razão de titulação de preenchimento automático. Selecione uma gama de poderes MST e digite valores para cada potência para testar o ajuste de ligação mais robusto.Para preparar amostras rotuladas de MST, diluir uma solução de Vam7-octahistidina para uma concentração de 200 nanomolares e um corante NTA-Atto 647 para 100 de concentração de nanomolar, ambos em PBS. Misture o Vam7-octahistidina e o corante NTA-Atto 647 a uma proporção volumosa de 1:1 e deixe a mistura sentar-se à temperatura ambiente protegida da luz por 30 minutos. Ao final da incubação, centrifufique a mistura de corante e proteína e armazene a solução a 4 graus Celsius por até algumas horas antes do uso.Em seguida, prepare a amostra, pegue o ligante tingido e exponha o analito. Para termoforese de microescala da amostra, abra o dispositivo e deslize o rack capilar para fora. Coloque os capilares de amostra no rack com a maior concentração na posição um e selecione o canal Vermelho no software de controle.Em seguida, carregue o rack no instrumento. Em seguida, selecione uma faixa de potência MST e inicie a medição do Cap Scan MST e avalie a resposta de mudança. Traços termoforéticos de um teste de uma titulação de 1:1 de DiC8 PA a partir de 500 micromoles contra 50 nanomolar NTA-Atto 647 rotulado domínio Vam7 são mostrados aqui.A fluorescência inicial, o salto de tempo e a termoforese podem ser observados, permitindo que o KD seja calculado a partir de qualquer uma ou uma combinação dessas medidas. Uma curva de saturação pode ser traçada a partir desses resultados, por exemplo, para a termoforese com a saída de salto de tempo, como ilustrado no gráfico. Geralmente, os resultados do MST são determinados por meio da escala de log, levando em conta a concentração de proteínas para determinar a afinidade vinculante selecionando o modelo KD e inserindo a concentração de proteínas.Ao executar este protocolo, certifique-se de que a solução está no centro do capilar e que não há bolhas de ar e que o capilar não tenha poeira ou solução na parte externa do capilar. A calorimetria de titulação isotérmica ou ressonância plasmon superficial poderia ser usada para validar o KD experimental obtido. Se houver potencial vinculação cooperativa, o ITC seria o próximo método lógico realizado, dado os recursos.Essa técnica permitiu que pesquisadores tradicionais de biologia incorporassem técnicas de triagem biofísica em suas pesquisas para determinar relações de caminho. Um exemplo dessa técnica é a lise celular com a proteína alvo expressa endógena, onde a tag GFP é uma nova maneira de realizar um ensaio tradicional de puxar para baixo.

use-of-microscale-thermophoresis-to-measure-protein-lipid-interactions

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este vídeo demonstra a termoforese em microescala para estudar a interação proteína-lipídio. O ensaio detecta a interação entre as moléculas quantificando o movimento termoforético de proteínas marcadas com fluorescência em resposta a um gradiente de temperatura. A molécula fluorescente é misturada com diferentes concentrações das moléculas lipídicas não fluorescentes, e a mistura de moléculas na solução é carregada nos capilares. Um gradiente de temperatura é aplicado às amostras nos capilares...

Termoforese em microescala para estudar interações proteína-lipídio em solução

Este vídeo demonstra uma técnica de microgravimetria dissipativa para investigar a ligação de proteínas a bicamadas lipídicas. Pequenas vesículas unilamelares são adicionadas para revestir a superfície do sensor de quartzo de uma microbalança. Utilizando a ligação dependente de íons cálcio da proteína alvo de ligação a fosfolipídios à bicamada, as mudanças na frequência de oscilação do sensor e a dissipação da oscilação são monitoradas para determinar a natureza da ligação da bicamada...

Técnica de Microgravimetria Dissipativa para Estudo da Interação Proteína-Bicamada Lipídica

Neste vídeo, demonstramos as interações proteína-fosfoinositídeo em um padrão microfluídico usando o ensaio de modulação de pH, usando corante fluorescente sensível ao pH marcado com lipídio fosfatidiletanolamina de uma bicamada lipídica suportada, chamada de plataforma microfluídica. As modulações no pH após a ligação da proteína ao fosfolipídio causam extinção de fluorescência.

Ensaio de modulação de pH em bicamadas lipídicas suportadas para detectar interações proteína-fosfoinositídeo

Termoforese microescala (MST) pode ser amplamente utilizado para a determinação da afinidade de ligação sem purificação da proteína alvo a partir de lisados ​​celulares. O protocolo envolve a sobre-expressão da proteína GFP fundida, a lise das células em condições não desnaturantes, e detecção de sinal MST na presença de várias concentrações do ligando.

Método de purificação de proteína livre de Determinação Affinity Binding por termoforese Microscale

A fluorimetria de varredura diferencial é um método amplamente utilizado para triagem de bibliotecas de pequenas moléculas para interações com proteínas. Aqui, apresentamos um método simples para estender essas análises para fornecer uma estimativa da constante de dissociação entre uma pequena molécula e seu parceiro proteico.

Determinação de interacções proteína-ligante Usando Differential Scanning Fluorimetria

Superfície Plasmon Resonance (SPR) é um método livre de marcador para a detecção de interacções biomoleculares em tempo real. Nisto, um protocolo para uma proteína de membrana: interação experimento receptor é descrita, ao discutir os prós e contras da técnica.

Medições em tempo real de proteína de membrana: Receptor Interações Usando Superfície Plasmon Resonance (SPR)

A termoforese em microescala (MST) é uma tecnologia sensível para caracterizar as interações aptâmero-alvo. Este manuscrito descreve um protocolo MST para caracterizar as interações aptâmero-pequenas moléculas.

Mapear o sítio de ligação de um Aptamer no ATP Usando MicroScale termoforese

Aqui, apresentamos um protocolo para a produção e purificação de proteínas que são rotulados com isótopos estáveis e posterior caracterização das interações da proteína-proteína usando espectroscopia de ressonância magnética Nuclear (RMN) e microescala Experimentos de Thermophoresis (MST).

Interações de proteínas globulares e filamentosas por espectroscopia de ressonância magnética Nuclear (NMR) e Thermophoresis de microescala (MST) de medição

Este artigo descreve os protocolos de preparação de amostras, redução de dados e análise de dados em estudos de eco de giro de nêutrons (NSE) de membranas lipídicas. A rotulagem criteriosa de deutério de lipídios permite o acesso a diferentes dinâmicas de membrana em comprimento mesoscópico e escalas de tempo, sobre as quais ocorrem processos biológicos vitais.

Espectroscopia de Eco de Rotação de Nêutrons como uma sonda única para dinâmicas de membrana lipídica e interações membrana-proteína

Este protocolo combina fotometria de massa com um novo sistema microfluídico para investigar interações proteína-proteína de baixa afinidade. Essa abordagem é baseada na rápida diluição de complexos altamente concentrados em solução, o que permite medições de baixa afinidade e amplia a aplicabilidade da fotometria de massa.

Análise da formação de complexos proteicos em concentrações micromolares por acoplamento de microfluídica com fotometria de massa

Aprenda a usar termoforese microescala marcada para medir constantes de dissociação (KDs) em interações proteína-lipídicas com Vam7 e ácido fosfatídico. Este método rápido e de baixo custo é ideal para desenvolvimento farmacêutico inicial.

Uso de Termoforese microescala para medir interações proteína-lipídicas

Explorar mais vídeos