Monitoramento de anticorpos bloqueadores pd-1 ligados a células T derivadas de uma gota de sangue periférico
5 de fevereiro de 2020
Desenvolvemos um simples ensaio de citometria de fluxo para avaliar a ligação de anticorpos bloqueadores PD-1 às células T, exigindo apenas uma gota de sangue periférico de pacientes com câncer.
Como este método determina células ligadas a anticorpos de bloqueio PD-1 usando sangue periférico de pacientes, o subconjunto específico responsável por efeitos antitumorais e eventos adversos relacionados à imunidade pode ser identificado. Este método precisa apenas de uma pequena quantidade de amostra de sangue e o processo de análise é bastante simples e rápido. Só precisa de uma máquina de citometria de fluxo.
Para começar, colete amostras de sangue inteiros em tubos de coleta de sangue contendo EDTA. Trate cada tubo de citometria de fluxo de poliestireno de fundo redondo de cinco mililitros com um mililitro de soro bovino fetal de 2% em PBS. Vórtice por 10 segundos.
Em seguida, transfira 20 microliters de amostras de sangue inteiros para os tubos de fundo redondos de cinco mililitros tratados. Adicione 20 microliters de 2% FBS em PBS e 10 microliters de reagente de bloqueio de receptor FC específico humano. Misture bem e incubar por 15 minutos em temperatura ambiente.
Em seguida, adicione 500 microliters de tampão de lise de glóbulos vermelhos. Misture bem e incubar por 10 minutos em temperatura ambiente. Adicione quatro mililitros de 2%FBS em PBS e gire células a 400 vezes g por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Remova o supernatante por aspiração. Repita o processo de lavagem e aspiração. Resuspend as células em 100 microliters de 2%FBS em PBS e divida em dois tubos de 50 microliters cada.
Adicione anticorpos marcadores de superfície. Misture bem e incubar por 20 minutos à temperatura ambiente no escuro. Lave as amostras duas vezes em 2% FBS em PBS como anteriormente.
Resuspensar as células em 200 microlitres de 2%FBS em PBS. Insira os tubos no citômetro de fluxo e adquira células seguindo o protocolo recomendado. Registo 10.000 eventos como o portão de linfócitos e os dados de fluxo de exportação como arquivos FCS para análise.
Abra arquivos no software de análise e clique no arquivo de controle isótipo para visualizar as células em uma dispersão para a frente versus plot de dispersão lateral e linfócitos de portão. Selecione células únicas usando FSCH versus FSCW e SSCH versus SSCW e exiba-as em um plot CD3 versus CD8 ou CD3 versus CD4. Gate as células T CD8 e CD4 T-cells, respectivamente.
Selecione as células fechadas e exiba-as em um plot PD-1 versus IgG4 humano. E, em seguida, com base no controle do isótipo, selecione o Q3 para identificar células CD8 e CD4 T ligadas a anticorpos pc8 e CD4. Neste estudo, a estratégia de gating e a análise da citometria de fluxo detectaram anticorpos de bloqueio PD-1 ligados às células T obtidas a partir de uma gota de sangue periférico do paciente.
A trama PD-1 versus IgG4 humana mostra o status de ligação de anticorpos de bloqueio PD-1 em células T. Pontos laranjas e pontos pretos indicam anticorpos anti-IgG4 e manchas de controle de isótipo, respectivamente. Antes da administração do anticorpo de bloqueio PD-1, não havia células T de CD8 ou CD4 t positivas IgG4 ou CD4 e a expressão PD-1 foi confirmada por um anticorpo detectante PD-1.
Após a administração nivolumab ou pembrolizumabe, o IgG4 pode ser detectado em células T por anticorpo anti-IgG4, enquanto o PD-1 detectando anticorpos EH12.1 não reconhece nenhum PD-1 em células T. Os portões vermelho, azul e verde indicam total vinculação, vinculação parcial e perda de ligação, respectivamente. Depois que os pacientes descontinuaram nivolumab e pembrolizumabe, o status de anticorpos de bloqueio PD-1 ligados às células T CD8 diminuiu.
Houve parcial vinculação e, finalmente, perda total de vinculação. Por favor, certifique-se de misturar a amostra de sangue com lise RBC também. Além disso, misturar a lise RBC antes da coloração do marcador de superfície é o passo chave neste método.
Se o pesquisador tiver acesso a uma máquina avançada de citometria de fluxo, as células T ligadas a anticorpos PD-1 podem ser avaliadas com mais e mais marcadores relacionados a essa estratégia podem ser aplicados para traçar fenótipos de células T responsáveis por eventos adversos causados por anticorpos bloqueadores de PD-1. A amostragem de pacientes com eventos adversos desenvolvidos é importante para avaliar a utilidade dessa estratégia.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um ensaio de citometria de fluxo desenvolvido para avaliar a ligação de anticorpos bloqueadores de PD-1 a linfócitos T utilizando uma amostra mínima de sangue de pacientes com câncer. O método permite a identificação de subpopulações específicas de células imunes envolvidas nos efeitos antitumorais e nos eventos adversos relacionados ao sistema imunológico.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Pesquisa em Câncer
- Citometria de Fluxo
Antecedentes
- PD-1 é uma proteína reguladora que desempenha um papel fundamental na regulação das respostas imunológicas.
- O bloqueio de PD-1 pode aumentar a imunidade antitumoral.
- Os métodos atuais para avaliar as interações de PD-1 podem ser complexos e exigem maiores volumes de sangue.
- Este estudo tem como objetivo simplificar o processo mantendo a precisão.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um ensaio simples para avaliar anticorpos bloqueadores de PD-1.
- Utilizar um pequeno volume de sangue periférico para análise.
- Identificar subpopulações de células imunes associadas a efeitos terapêuticos e eventos adversos.
Métodos Utilizados
- Coleta de amostras de sangue total em tubos com EDTA.
- Tratamento de tubos de citometria de fluxo com soro bovino fetal em PBS.
- Vórtex das amostras para mistura adequada.
- Análise utilizando um citômetro de fluxo.
Resultados Principais
- O ensaio identifica com sucesso células T ligadas ao anticorpo bloqueador de PD-1.
- O requisito mínimo de amostra sanguínea aumenta a viabilidade para testes em pacientes.
- Os resultados indicam potencial para identificar eventos adversos relacionados ao sistema imunológico.
- O método é rápido e eficiente, adequado para aplicações clínicas.
Conclusões
- Este ensaio de citometria de fluxo oferece uma abordagem simples para avaliar anticorpos bloqueadores de PD-1.
- Ele facilita a identificação de subpopulações relevantes de células imunes.
- O método possui implicações potenciais para aprimorar o monitoramento da imunoterapia contra o câncer.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A monitorização confiável da ligação do anticorpo bloqueador de PD-1 às células T é essencial para compreender o engajamento terapêutico e os eventos adversos relacionados ao sistema imunológico em pipelines de imuno-oncologia. Este ensaio de citometria de fluxo minimamente invasivo permite a visualização direta de células T ligadas ao anticorpo a partir de uma única gota de sangue periférico, apoiando a avaliação farmacodinâmica em tempo real. A abordagem aumenta a confiança preditiva em pontos decisivos importantes nos portfólios de pesquisa translacional e clínica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação direta do envolvimento da via PD-1 em linfócitos T derivados de pacientes.
- Auxilia na desmistificação mecanicista ao identificar subconjuntos de células imunes associados à eficácia e eventos adversos.
- Facilita a validação funcional do alvo por meio da detecção quantitativa do estado de ligação do anticorpo.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Oferece um formato padronizado e reprodutível de ensaio para avaliar as interações entre anticorpos e células T.
- Fornece resultados quantitativos adequados para comparações entre amostras e estudos longitudinais.
- Prepara sistemas biológicos validados para análises imunológicas e estudos de biomarcadores em etapas subsequentes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com estratégias translacionais de biomarcadores ao permitir o monitoramento imunológico em amostras de pacientes.
- Apoia a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica e clínica de imunoterapias.
- Informa decisões de avanço ajustadas ao risco ao vincular leituras farmacodinâmicas a desfechos clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este ensaio integra-se ao fluxo de trabalho de imuno-oncologia desde a descoberta inicial até a pesquisa translacional e clínica, permitindo o monitoramento em tempo real do engajamento de anticorpos terapêuticos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias para agentes direcionados ao PD-1.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas reprodutíveis para a ligação de anticorpos a linfócitos T.
- Análises: Permite comparação estatística do status de ligação entre diferentes pontos temporais e coortes de pacientes.
- Pesquisa Translacional: Facilita o alinhamento de biomarcadores e o monitoramento imunológico em amostras clínicas.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma escalável e minimamente invasiva para avaliações farmacodinâmicas contínuas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva no engajamento do alvo e na modulação imunológica.
- Valor Operacional: Otimiza o processamento de amostras e a padronização de ensaios com volume sanguíneo mínimo.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar ao vincular dados farmacodinâmicos a desfechos clínicos.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização ajustada ao risco de ativos em imuno-oncologia com base no monitoramento imunológico em tempo real.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em citometria de fluxo e estratégias de seleção de células imunes.
- Necessita de acesso a instrumentação de citometria de fluxo e software de análise compatível.
- Exige padronização entre equipes nos protocolos de manipulação de amostras e seleção de eventos.
- Adaptável a diversos marcadores imunes para perfis expandidos, conforme suportado pela instrumentação.
- Depende da qualidade da amostra e da correta lise de hemácias para resultados ideais.
