Name: Monitoramento de anticorpos bloqueadores pd-1 ligados a células T derivadas de uma gota de sangue periférico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Aprenda a monitorar anticorpos bloqueadores de PD-1 ligados a células T usando citometria de fluxo com apenas uma gota de sangue periférico. Este método identifica subconjuntos imunes envolvidos em efeitos antitumorais e eventos adversos relacionados à imunoterapia.

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Este trabalho foi apoiado por subsídios para S.K. da Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (JP17K16045) e pela Agência japonesa de Pesquisa e Desenvolvimento Médico (JP18cm0106335 e 19cm0106310).

A amostragem foi realizada durante os procedimentos clínicos de rotina. Todas as amostras humanas foram obtidas após o consentimento informado foi fornecido pelos sujeitos, de acordo com a Declaração de Helsinque e com a aprovação do conselho de revisão ética da Faculdade de Pós-Graduação em Medicina, Universidade de Osaka, Japão (15383 e 752).
1. Preparação e coloração de amostras de sangue inteiro
<ol><li>Colete amostras de sangue inteiras em tubos de coleta de sangue contendo ácido tetraástico de diamina de etileno (EDTA). NOTA: A coleta de sangue pode ser realizada usando uma agulha normal ou uma lança de sangue.</li>
	<li>Transfira 20 μL de amostras de sangue inteiro para tubos de citomete trimeteno de poliestireno de 5 mL. NOTA: Para reduzir a ligação não específica das células aos tubos, 1 mL de 2% de soro bovino fetal (FBS) em soro amortecido com fosfato (PBS) é adicionado em tubos e vórtices por 10 s antes da aplicação às amostras.</li>
	<li>Adicione 20 μL de 2% de FBS em PBS.</li>
	<li>Adicione 10 μL de reagente de bloqueio fcr específico para humanos. Misture bem e incuba por 15 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Adicione 500 μL de tampão de lise de glóbulos vermelhos. Misture bem e incuba por 10 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Adicione 4 mL de 2% de FBS em PBS e gire células para baixo a 400 x g (1.500 rpm) por 5 min a 4 °C. Remova supernatant por aspiração.</li>
	<li>Repita o processo de lavagem e aspiração descrito na etapa 1.6.</li>
	<li>Resuspender as células em 100 μL de 2% de FBS em PBS e dividir em dois tubos de 50 μL cada.</li>
	<li>Adicione anticorpos de marcador de superfície(Tabela 1). Misture bem e incuba rastou por 20 min à temperatura ambiente no escuro. NOTA: Ao traçar o perfil da célula T, o número de marcadores pode ser aumentado com base na qualidade da máquina de citometria de fluxo.</li>
	<li>Lave amostras 2x como descrito na etapa 1.6.</li>
	<li>Resuspender as células em 200 μL de 2% de FBS na PBS.</li>
</ol>2. Análise Citométrica de fluxo
<ol><li>Insira tubos no citometro de fluxo e adquira células, basicamente seguindo o protocolo recomendado9.</li>
	<li>Registre 10.000 eventos como o portão linfócito (Figura 1A) e dados de fluxo de exportação como arquivos .fcs para análise.</li>
	<li>Abra arquivos no software de análise. Visualize as células em uma dispersão para frente (FSC) (A) vs. dispersão lateral (SSC) (A) e linfócitos de portão(Figura 1A).</li>
	<li>Depois de selecionar células individuais usando fSC (H) vs. FSC (W) e SSC (H) vs. SSC(W)( Figura 1B) e exibi-las em um cd3 vs. CD8 ou cd3 ou cd4 gráfico, portão das células CD8 T e células CD4 T, respectivamente (Figura 1C).</li>
	<li>Depois de selecionar as células fechadas e exibi-las em um enredo PD-1 vs. IgG4 humano, identifique as células CD8 e CD4 T ligadas ao Corpo de PD-1 com base no controle do isotipo(Figura1D).</li>
</ol>

<ol><li>Gong, J., Chehrazi-Raffle, A., Reddi, S., Salgia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+PD-1+and+PD-L1+inhibitors+as+a+form+of+cancer+immunotherapy%3A+a+comprehensive+review+of+registration+trials+and+future+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Development of PD-1 and PD-L1 inhibitors as a form of cancer immunotherapy: a comprehensive review of registration trials and future considerations.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 8(2018).</li>
<li>Borghaei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nivolumab+versus+Docetaxel+in+Advanced+Nonsquamous+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (17), 1627-1639 (2015).</li>
<li>Brahmer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nivolumab+versus+Docetaxel+in+Advanced+Squamous-Cell+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Squamous-Cell Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (2), 123-135 (2015).</li>
<li>Herbst, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pembrolizumab+versus+docetaxel+for+previously+treated%2C+PD-L1-positive%2C+advanced+non-small-cell+lung+cancer+%28KEYNOTE-010%29%3A+a+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial.</a> The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).</li>
<li>Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-Related+Adverse+Events+Associated+with+Immune+Checkpoint+Blockade%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immune-Related Adverse Events Associated with Immune Checkpoint Blockade.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).</li>
<li>Weber, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+Profile+of+Nivolumab+Monotherapy%3A+A+Pooled+Analysis+of+Patients+With+Advanced+Melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Safety Profile of Nivolumab Monotherapy: A Pooled Analysis of Patients With Advanced Melanoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (7), 785-792 (2017).</li>
<li>Champiat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+immune+checkpoint+blockade+dysimmune+toxicities%3A+a+collaborative+position+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Management of immune checkpoint blockade dysimmune toxicities: a collaborative position paper.</a> Annals of Oncology. 27 (4), 559-574 (2016).</li>
<li>Brahmer, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+study+of+single-agent+anti-programmed+death-1+%28MDX-1106%29+in+refractory+solid+tumors%3A+safety%2C+clinical+activity%2C+pharmacodynamics%2C+and+immunologic+correlates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (19), 3167-3175 (2010).</li>
<li>Bommareddy, P. K., Lowe, D. B., Kaufman, H. L., Rabkin, S. D., Saha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-parametric+flow+cytometry+staining+procedure+for+analyzing+tumor-infiltrating+immune+cells+following+oncolytic+herpes+simplex+virus+immunotherapy+in+intracranial+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Methods%22%5BJournal%5D)">Multi-parametric flow cytometry staining procedure for analyzing tumor-infiltrating immune cells following oncolytic herpes simplex virus immunotherapy in intracranial glioblastoma.</a> Journal of Biological Methods. 6 (2), 112(2019).</li>
<li>Osa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+implications+of+monitoring+nivolumab+immunokinetics+in+non-small+cell+lung+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Clinical implications of monitoring nivolumab immunokinetics in non-small cell lung cancer patients.</a> JCI Insight. 3 (19), 59125(2018).</li>
<li>Zelba, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantification+of+T-cells+expressing+PD-1+in+patients+on+anti-PD-1+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Accurate quantification of T-cells expressing PD-1 in patients on anti-PD-1 immunotherapy.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 67 (12), 1845-1851 (2018).</li>
<li>Simoni, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bystander+CD8%28%2B%29+T+cells+are+abundant+and+phenotypically+distinct+in+human+tumour+infiltrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bystander CD8(+) T cells are abundant and phenotypically distinct in human tumour infiltrates.</a> Nature. 557 (7706), 575-579 (2018).</li>
<li>Chiu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+general+method+for+quantifying+IgG-based+therapeutic+monoclonal+antibodies+in+human+plasma+using+protein+G+purification+coupled+with+a+two+internal+standard+calibration+strategy+using+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Development of a general method for quantifying IgG-based therapeutic monoclonal antibodies in human plasma using protein G purification coupled with a two internal standard calibration strategy using LC-MS/MS.</a> Analytica Chimica Acta. 1019, 93-102 (2018).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Neste artigo, relatamos um método usando um címetro de fluxo para detectar anticorpos bloqueadores PD-1 ligados a células T derivadas de uma gota de sangue periférico, que originalmente desenvolvemos para detecção de nivolumab10. Embora essa técnica seja muito simples e fácil de executar, dois pontos importantes devem ser notados para obter resultados precisos. Uma delas é que para detectar moléculas PD-1, deve-se usar um anticorpo apropriado que compete com nivolumab e pembrolizumabe. Essa questã...

Os anticorpos de bloqueio pd-1 tornaram-se a escolha padrão para o tratamento de vários tipos de câncer, incluindo câncer de pulmão não-pequeno celular (NSCLC)1,2,3,4. Eles mostram um notável efeito terapêutico em um subconjunto de pacientes com câncer que não responderam às quimioterapias citotóxicas convencionais. No entanto, os inibidores de ponto de verificação imunológica (ICIs), que incluem anticorpos pd-1-bloqueio, podem causar um espectro único e distinto de eventos adversos, denominados eventos adversos relacionados à imunológica (irAEs)5. Embora os irAEs possam afetar quase todos os tecidos, eles são mais comumente observados no trato gastrointestinal, glândulas endócrinas, pele e fígado, e podem causar distúrbios pruritos, erupção cutânea, náusea, diarreia e tireoide6,7. Em geral, a maioria dos irAEs aparecem dentro de 1 a 2 meses após o início das ICIs. No entanto, em alguns casos, eles podem ocorrer mais de 1 ano após o início do tratamento ou mesmo após a cessação do tratamento6,7. Eles também causam vários sintomas que podem ser difíceis de discriminar outras patologias. Assim, pode ser desafiador diagnosticar prontamente os irAEs e tratá-los adequadamente. os irAEs podem afetar todos os tecidos, e seu início é fortemente influenciado pelas células imunes circulantes, especialmente as células T ligadas a anticorpos bloqueadores PD-1. Portanto, um método simples e minimamente invasivo para monitorar células T direcionadas a anticorpos é importante em ambientes clínicos.
Aqui, desenvolvemos um método simples para avaliar a vinculação de anticorpos pd-1 a células T usando uma gota de sangue inteiro periférico de pacientes com câncer que receberam nivolumab ou pembrolizumabe. Usando essa abordagem, pudemos monitorar cada um dos seguintes: 1) a duração da ligação de anticorpos às células T, 2) a ocupação de moléculas de PD-1 por anticorpos terapêuticos e 3) o status de ativação e características imunológicas das células T. Este método é uma modificação de uma técnica8relatada anteriormente . A quantidade de sangue necessária é quase a mesma necessária para um teste de glicose, e a abordagem não requer enriquecimento mononuclear celular ou co-culturing com anticorpos pd-1-bloqueio. Confirmamos que esse método também pode ser realizado utilizando amostras congeladas, incluindo células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs) e células de derrame pleural, derrame pericárdico, fluido de lavage broncoaveolar e fluido cerebrorraquidiano, sugerindo que essa estratégia pode ser útil no contexto de um estudo multicêntrico. Esse método pode facilitar o diagnóstico precoce dos irAEs, e também ajudar a determinar os tratamentos imunossupressores adequados para controlar seus sintomas e identificar os horários ideais para iniciar terapias subsequentes após inibidores de PD-1.

<table><tbody><tr><td>10X Tampão de Lise RBC (Multi-espécies)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4300-54</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>APC/Cyanine7 anti-humano CD4 Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>300518</td><td>Clone RPA-T4</td></tr><tr><td>BD FACS Canto II Citômetro de Fluxo</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 510 anti-humano CD8a Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>301048</td><td>Clone RPA-T8</td></tr><tr><td>Fosfato de Dulbecco Salino tampão</td><td>nacalai tesque</td><td>14249-95 Tubos de</td><td></td></tr><tr><td>poliestireno de fundo redondo Falcon</td> de 500 mL <td>STEMCELL Technologies</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Reagente bloqueador FcR de</td> 5 mL, humano <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td>2</td></tr><tr><td>mL FLOWJO</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco Soro Fetal Bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12676029</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Camundongo IgG1 monoclonal - Controle de isotipo</td><td>abcam</td><td>ab81200</td><td></td></tr><tr><td>Camundongo monoclonal Anti-Humano IgG4 Fc</td><td>abcam</td><td>ab99825</td><td>Clone HP6025</td></tr><tr><td>Pacific Blue Mouse Anti-Humano CD3</td><td>BD</td><td>558117</td><td>Clone UCHT1</td></tr><tr><td>PE-Cy7 Mouse anti-Humano CD279 (PD-1)</td> <td>BD</td><td>561272</td><td>Clone EH12.1</td></tr><tr><td>PE-Cy7 Mouse IgG1 &kappa; Controle de Isotipo</td><td>BD</td><td>557646</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoramento de anticorpos bloqueadores pd-1 ligados a células t derivadas de uma gota de sangue periférico

Monitoring PD-1-Blocking Antibodies Bound to T Cells Derived from a Drop of Peripheral Blood

Os inibidores de checkpoint imunológico, incluindo anticorpos de bloqueio pd-1, melhoraram significativamente os resultados do tratamento em vários tipos de câncer. A eficácia farmacológica dessas imunoterapias é duradoura, estendendo-se até mesmo além da descontinuação de suas injeções, devido às persistentes concentrações sanguíneas. Aqui desenvolvemos um simples ensaio de citometria de fluxo para avaliar o status de ligação de células T dos anticorpos pd-1 de bloqueio nivolumab e pembrolizumabe. Como um teste de glicose, este ensaio requer apenas uma única gota de sangue periférico. Visualizar anticorpos ligados em células T é mais confiável do que medir concentrações sanguíneas de anticorpos. Além disso, se necessário, podemos potencialmente analisar muitos marcadores imunológicos distintos em células T ligadas a anticorpos bloqueadores PD-1. Assim, trata-se de uma estratégia simples e minimamente invasiva para analisar o efeito farmacológico dos anticorpos bloqueadores de PD-1 em pacientes com câncer.

A estratégia de gating e a análise de citometria de fluxo(Figura 1)podem detectar a ligação de anticorpos PD-1 a células T obtidas a partir de uma queda de sangue periférico do paciente NSCLC. Antes que o anticorpo de bloqueio PD-1 seja administrado, nenhuma célula de CD8 ou CD4 Positivo humana está presente, e a expressão PD-1 pode ser confirmada por um anticorpo PD-1 -detecting (EH12.1) (Figura 2A). Após a administração nivolumab ou pembrolizu...

Desenvolvemos um simples ensaio de citometria de fluxo para avaliar a ligação de anticorpos bloqueadores PD-1 às células T, exigindo apenas uma gota de sangue periférico de pacientes com câncer.

Monitoramento de anticorpos bloqueadores pd-1 ligados a células T derivadas de uma gota de sangue periférico

Immune checkpoint inhibitors, including PD-1&#8211;blocking antibodies, have significantly improved treatment outcomes in various types of cancer. The ...

Como este método determina células ligadas a anticorpos de bloqueio PD-1 usando sangue periférico de pacientes, o subconjunto específico responsável por efeitos antitumorais e eventos adversos relacionados à imunidade pode ser identificado. Este método precisa apenas de uma pequena quantidade de amostra de sangue e o processo de análise é bastante simples e rápido. Só precisa de uma máquina de citometria de fluxo.Para começar, colete amostras de sangue inteiros em tubos de coleta de sangue contendo EDTA. Trate cada tubo de citometria de fluxo de poliestireno de fundo redondo de cinco mililitros com um mililitro de soro bovino fetal de 2% em PBS. Vórtice por 10 segundos.Em seguida, transfira 20 microliters de amostras de sangue inteiros para os tubos de fundo redondos de cinco mililitros tratados. Adicione 20 microliters de 2% FBS em PBS e 10 microliters de reagente de bloqueio de receptor FC específico humano. Misture bem e incubar por 15 minutos em temperatura ambiente.Em seguida, adicione 500 microliters de tampão de lise de glóbulos vermelhos. Misture bem e incubar por 10 minutos em temperatura ambiente. Adicione quatro mililitros de 2%FBS em PBS e gire células a 400 vezes g por cinco minutos a quatro graus Celsius.Remova o supernatante por aspiração. Repita o processo de lavagem e aspiração. Resuspend as células em 100 microliters de 2%FBS em PBS e divida em dois tubos de 50 microliters cada.Adicione anticorpos marcadores de superfície. Misture bem e incubar por 20 minutos à temperatura ambiente no escuro. Lave as amostras duas vezes em 2% FBS em PBS como anteriormente.Resuspensar as células em 200 microlitres de 2%FBS em PBS. Insira os tubos no citômetro de fluxo e adquira células seguindo o protocolo recomendado. Registo 10.000 eventos como o portão de linfócitos e os dados de fluxo de exportação como arquivos FCS para análise.Abra arquivos no software de análise e clique no arquivo de controle isótipo para visualizar as células em uma dispersão para a frente versus plot de dispersão lateral e linfócitos de portão. Selecione células únicas usando FSCH versus FSCW e SSCH versus SSCW e exiba-as em um plot CD3 versus CD8 ou CD3 versus CD4. Gate as células T CD8 e CD4 T-cells, respectivamente.Selecione as células fechadas e exiba-as em um plot PD-1 versus IgG4 humano. E, em seguida, com base no controle do isótipo, selecione o Q3 para identificar células CD8 e CD4 T ligadas a anticorpos pc8 e CD4. Neste estudo, a estratégia de gating e a análise da citometria de fluxo detectaram anticorpos de bloqueio PD-1 ligados às células T obtidas a partir de uma gota de sangue periférico do paciente.A trama PD-1 versus IgG4 humana mostra o status de ligação de anticorpos de bloqueio PD-1 em células T. Pontos laranjas e pontos pretos indicam anticorpos anti-IgG4 e manchas de controle de isótipo, respectivamente. Antes da administração do anticorpo de bloqueio PD-1, não havia células T de CD8 ou CD4 t positivas IgG4 ou CD4 e a expressão PD-1 foi confirmada por um anticorpo detectante PD-1.Após a administração nivolumab ou pembrolizumabe, o IgG4 pode ser detectado em células T por anticorpo anti-IgG4, enquanto o PD-1 detectando anticorpos EH12.1 não reconhece nenhum PD-1 em células T. Os portões vermelho, azul e verde indicam total vinculação, vinculação parcial e perda de ligação, respectivamente. Depois que os pacientes descontinuaram nivolumab e pembrolizumabe, o status de anticorpos de bloqueio PD-1 ligados às células T CD8 diminuiu.Houve parcial vinculação e, finalmente, perda total de vinculação. Por favor, certifique-se de misturar a amostra de sangue com lise RBC também. Além disso, misturar a lise RBC antes da coloração do marcador de superfície é o passo chave neste método.Se o pesquisador tiver acesso a uma máquina avançada de citometria de fluxo, as células T ligadas a anticorpos PD-1 podem ser avaliadas com mais e mais marcadores relacionados a essa estratégia podem ser aplicados para traçar fenótipos de células T responsáveis por eventos adversos causados por anticorpos bloqueadores de PD-1. A amostragem de pacientes com eventos adversos desenvolvidos é importante para avaliar a utilidade dessa estratégia.

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Este artigo descreve uma técnica simples para induzir aloantígenos específicos de anergia em células mononucleares do sangue periférico. A técnica pode ser aplicada clinicamente para gerar células não-alorreativas doador. Infusão dessas células poderia melhorar a reconstituição imunológica e reduzir a toxicidade após o transplante alogênico de células-tronco hematopoiéticas.

Indução de aloantígenos específicos de anergia em células mononucleares do sangue periférico por Estimulação com aloantígenos Co-estimulatórias bloqueio de sinal

Este vídeo demonstra uma técnica baseada em citometria de fluxo usando dois fluorocromos para identificar células T CD4+ e CD8+, células T γδ, células B, células natural killer (NK) e monócitos em células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs). Ao incubar as células com anticorpos conjugados com fluorocromo contra os marcadores de superfície, os subconjuntos de células são identificados usando uma estratégia ideal de controle citométrico de fluxo.

Um ensaio de citometria de fluxo para identificar subconjuntos de células imunes em células mononucleares do sangue periférico

Aqui descrevemos um protocolo para o isolamento de subconjuntos de precursor células B do sangue do cordão umbilical. A quantidade e qualidade suficientes de ácidos nucleicos podem ser extraídos a partir das células e usadas em ensaios subsequentes utilizando DNA ou RNA.

Isolamento de precursor de células B subconjuntos de Sangue do Cordão Umbilical

Foi desenvolvido um ensaio in vitro para investigar o papel das vias de imunorreguladores na regulação da secreção de citoquinas por células T CD4 + específicas para o HIV.

In Vitro Ensaio para avaliar o impacto da imunorreguladora Pathways on específica para o HIV CD4 T efetoras celular Função

Apresentado aqui é um método simples para o isolamento e análise de citometria de fluxo de células mononucleares de sangue periférico que se infiltram no glioma que produz dados quantitativos tempo-dependente do número e estado de activação das células do sistema imunológico que entram no microambiente do tumor cerebral precoce.

Isolamento e Análise de Citometria de Fluxo infiltrantes Glioma Células Mononucleares do Sangue Periférico

O protocolo descreve uma técnica para estudar a capacidade das células T policlonais humanas de primário para formar sinápticas interfaces usando bilayers do lipid planar. Usamos esta técnica para mostrar a capacidade de formação de sinapse diferencial de células T humanas primárias derivado dos gânglios linfáticos e sangue periférico.

Avaliação da Interface sináptica de células T humano primário do sangue periférico e tecido linfoide

A caracterização de células tumorais circulantes (CTCs) é um tema popular na pesquisa translacional. Este protocolo descreve um ensaio semiautomático da imunofluorescência (se) para a caracterização do PD-L1 e a enumeração dos CTCs em amostras pacientes do cancro do pulmão da não-pequena pilha (NSCLC).

Caracterização e enumeração semiautomáticas de PD-L1 de células tumorais circulantes de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas por imunofluorescência

Este protocolo detalha a preparação clinicamente implementável de biosamples de PBMC e plasma de alta qualidade no local do ensaio clínico que pode ser usado para análise de biomarcadores translacionais.

Preparação de pelotas de células mononucleares de sangue periférico e plasma de uma única coleta de sangue em locais de ensaio clínico para análise de biomarcadores

O uso de reagentes de referência para ensaio de liberação de citocinas permite perfis de segurança in vitro mais reprodutíveis e padronizados de anticorpos monoclonais imunoterapêuticos. Aqui, descrevemos como os ensaios de liberação de citocinas podem ser usados juntamente com um painel de reagentes de referência para prever a segurança de alguns anticorpos monoclonais terapêuticos.

Usando reagentes de referência para confirmar a robustez dos ensaios de liberação de citocinas para a previsão da segurança do anticorpo monoclonal

Os inibidores de checkpoint são alvos importantes no desenvolvimento de terapias para a batalha contra o câncer. Este relatório apresenta uma nova vacina contra o câncer baseada em peptídeo PDL1, PDL1-Vaxx, que induz a produção de anticorpos policlonais neutralizantes que bloqueia a formação do complexo PD-1/PDL1. Este trabalho também detalha o desenvolvimento e teste de um ensaio baseado em esferas fluorescentes para análise desta atividade.

Análise de fluxo dual-reporter baseada em esferas fluorescentes magnéticas do bloqueio de anticorpos induzido pela vacina do peptídeo PDL1-Vaxx da interação PD-1/PD-L1

Este protocolo descreve um ensaio de bloqueio para inibidores de PD-1/PD-L1 usando tecnologia de ressonância plasmônica de superfície. Ele emprega uma estratégia de imobilização em duas etapas e um sistema tampão personalizado para medir com precisão as unidades de resposta, facilitando a avaliação das taxas de bloqueio de compostos ou produtos biológicos. Além disso, suporta a identificação de alto rendimento de inibidores de PD-1/PD-L1.

Identificação de inibidores de PD-1/PD-L1 com tecnologia de ressonância plasmônica de superfície

Aprenda a monitorar anticorpos bloqueadores de PD-1 ligados a células T usando citometria de fluxo com apenas uma gota de sangue periférico. Este método identifica subconjuntos imunes envolvidos em efeitos antitumorais e eventos adversos relacionados à imunoterapia.

Monitoramento de anticorpos bloqueadores pd-1 ligados a células T derivadas de uma gota de sangue periférico

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