Name: Combinando microdissecção de captura a laser e qPCR microfluido para analisar perfis transcricional de células únicas: uma abordagem de biologia de sistemas para dependência de opióides (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Aprenda a combinar microdissecção por laser e RT-qPCR microfluido para analisar perfis transcricionais de células únicas do núcleo central da amígdala. Este método permite identificar subfenótipos celulares com especificidade anatômica em neurociência.

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O trabalho aqui apresentado foi financiado através do NIH HLB U01 HL133360 concedido à JS e RV, NIDA R21 DA036372 concedido à JS e EVB, e T32 AA-007463 concedido a Jan Hoek em apoio à SJO's.

Este estudo foi realizado de acordo com as recomendações do Comitê de Cuidados e Uso animal (IACUC) da Universidade Thomas Jefferson e da Faculdade de Medicina da Universidade Drexel. O protocolo foi aprovado pela Universidade Thomas Jefferson e pela Drexel University College of Medicine IACUC.
1. Modelo animal
<ol><li>Insira duas pelotas de sulfato de morfina de liberação lenta de 75 mg ou duas pelotas de placebo subcutâneas em ratos machos adultos sprague-Dawley.<ol>
<li>Use um vestido e luvas apropriadamente para uma pequena cirurgia estéril. Raspe o dorsum de rato com cortadores, se necessário.</li>
		<li>Aplique pomada veterinária nos olhos do animal. Anestesiar o rato com aproximadamente 20 s de inalação de isoflurano. A anestesia é confirmada pela perda de consciência.</li>
		<li>Faça uma incisão midline no dorsum de rato com uma tesoura sem corte esterilizada por contas e separe a derme da parede do corpo com uma sonda esterilizada por contas. Insira as pelotas a derme com fórceps esterilizados por talas. Suturar a incisão fechada com uma agulha estéril. NOTA: Todo o procedimento leva cerca de 5 min por rato. Luvas estéreis frescas são usadas para cada rato.</li>
		<li>Coloque o rato em uma gaiola de isolamento para recuperação pós-cirúrgica. Verifique se há batimentos cardíacos e ritmo respiratório regular. Observe o rato até que a consciência seja recuperada. Avalie para dor pós-cirúrgica.</li>
		<li>Avalie os ratos 8h após a cirurgia e a cada 12 h após a recuperação e infecção. Coloque os ratos em uma gaiola com o resto da coorte quando estiverem totalmente recuperados da cirurgia, cerca de 24h após a cirurgia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injeina naltrexona intraperitoneal (75 mg/kg) às coortes G e de Retirada após 6 dias de exposição à morfina. NOTA: Havia quatro coortes de ratos neste experimento representativo (ver Figura 1).</li>
</ol>2. Colheita de amostras
<ol><li>Colher o cérebro 6 dias após a inserção da pelota ou 24 h após a injeção de naltrexona.<ol>
<li>Coloque o animal em uma câmara de isoflurano por aproximadamente 30 s ou até que ocorra perda de consciência, indicada pela falta de movimento e diminuição da taxa respiratória.</li>
		<li>Use uma guilhotina afiada para decapitar rapidamente o animal.</li>
		<li>Disseque o cérebro do crânio do animal.</li>
		<li>Use uma navalha afiada para fazer as seguintes incisões brutas ao cérebro removido: Primeiro, corte o cerebelo e descarte. Segundo, separe o tronco cerebral do antecérebro com uma incisão transversa. Em terceiro lugar, hemisecte o antecérebro e/ou tronco cerebral com uma incisão sagital média.</li>
		<li>Coloque o cérebro e o tronco cerebral em um molde plástico de incorporação de tecido com 3-4 cm de composto de temperatura de corte ideal (OCT) na parte inferior do molde. Cubra o resto da amostra com OCT.</li>
		<li>Coloque imediatamente o molde de incorporação de tecido plástico com a amostra coberta com OCT em um banho contendo gelo seco e metanol. Não deixe o metanol derramar no molde de incorporação de tecido. Mantenha o molde de incorporação com a amostra cerebral no banho de metanol-gelo até que a coleta de tecidos esteja concluída (~10-15 min no máximo).</li>
		<li>Coloque a amostra cerebral em um congelador de -80 °C o mais rápido possível.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Colher as amostras intestinais simultaneamente.<ol>
<li>Após a rápida decapitação, faça uma incisão média no abdômen do animal com um bisturi.</li>
		<li>Encontre o ceco e seque sua conexão com o cólon ascendente.</li>
		<li>Espremer o conteúdo cecal em um tubo cônico de 15 mL.</li>
		<li>Coloque imediatamente o tubo cônico sobre gelo seco e coloque em um congelador de -80 °C o mais rápido possível. NOTA: O conteúdo do intestino delgado também pode ser coletado usando os mesmos métodos de um controle negativo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Fatiamento
<ol><li>Corte o antecérebro de rato hemissiesado usando um criostato.<ol>
<li>Remova o molde de incorporação de plástico com o antecérebro do congelador -80 °C e coloque em um criostato de -20 °C.</li>
		<li>Remova a amostra hemisecenizada do cérebro hemisecção embutida oct do molde de incorporação. Use uma navalha para cortar os cantos do molde de incorporação de plástico verticalmente, se necessário. Monte o antecérebro para corte coronal caudal em um mandril criostato usando OCT. NOTA: Os marcos anatômicos para identificar o CeA incluem o trato óptico e o terminalis de estria(Figura 2B). O trato óptico se ramifica do quiasma óptico e rastreia dorsal-lateral como o cérebro é cortado rostral para caudal. Quando o trato óptico tem uma morfologia semelhante ao que é visto em um atlas cerebral de ratos bregma -2,12 mm10, as fatias de teste podem ser vistas um microscópio. O trato óptico e a morfologia do terminal istria podem ser verificados em um atlas cerebral de ratos10 para identificar o bregma e se o CeA circunda os terminais de estria.</li>
		<li>Corte seções coronais de 10 μm de espessura do cérebro hemiso torto rostral até caudal até que seções contendo o CeA sejam atingidas. NOTA: A largura e a altura das seções são de aproximadamente 200 mm.</li>
		<li>Coletar seções de 10 μm contendo o CeA, ou a região cerebral preferida, descongelando seções de 10 μm em lâminas de vidro simples. Coloque imediatamente o vidro desliza sobre uma panela de metal apoiada em gelo seco. Coloque as lâminas com seções cerebrais em um congelador de -80 °C o mais rápido possível. NOTA: Várias fatias podem ser colocadas no mesmo slide. Se usar uma mancha de tipo de célula diferente para fatias no mesmo slide, deixe cerca de 100 mm entre as fatias para que uma caneta hidrofóbica possa ser usada para separar soluções de anticorpos específicas do tipo celular no slide. Deixe cerca de 20 mm da borda do escorregador em cada lado da fatia.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Coloração de imunofluorescência
<ol><li>Manche as seções do cérebro para a célula cerebral escolhida (por exemplo, neurônio, microglia, astrócito, etc.) usando imunofluorescência.<ol>
<li>Remova um ou mais slides com seções de 10 μm do CeA do congelador -80 °C.</li>
		<li>Fixar as lâminas com 75% de etanol para 30 s. Remova o excesso de líquido.</li>
		<li>Bloqueie as fatias para 30 s com 2% de antígeno sérico bovino (BSA) em 1x soro de tampão fosfato (PBS). Lave 1x com PBS.</li>
		<li>Adicione uma solução primária de anticorpos ao slide por 2 min. Lave 1x com 2% de solução BSA. NOTA: A solução primária de anticorpos é composta por 2% de anticorpo primário, 1% de RNase Out e 96% da mesma solução BSA PBS para o passo de bloqueio acima (passo 4.1.3). O experimento representativo utilizou um anticorpo anti-NeuN, um anticorpo anti-Cd11β e um anticorpo anti-GFAP nas seguintes quantidades: 3 μL de principal, 1,88 μL de inibidor de RNA e 145,12 μL de solução BSA.</li>
		<li>Adicione a solução de anticorpos secundárias ao slide por 3 min. Lave 1x com PBS. NOTA: A solução de anticorpos secundários é composta por 1 μL de cabra anti-mouse 488 nm de marca fluorescente (1:500), 2,5 μL de inibidor de RNA, 1,3 μL de DAPI (1:10.000) e 196,5 μL de 2% de BSA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Série de desidratação de etanol e xileno
<ol><li>Mergulhe os slides em 75% de etanol para 30 s. Logo em seguida, mergulhe os slides em 95% de etanol para 30 s. Imediatamente depois, mergulhe os slides em 100% de etanol para 30 s. Imediatamente depois, mergulhe os slides em um segundo recipiente contendo 100% de etanol para 30 s.</li>
	<li>Após a série de desidratação do etanol, mergulhe os slides em xileno recém-derramado por 1 min. Imediatamente depois, mergulhe os slides em um segundo recipiente de xileno por 4 min.</li>
	<li>Retire os slides do banho de xileno e deixe o ar secar no escuro por 5 min.</li>
	<li>Coloque os slides em um dessecador por 5 min para secar ainda mais.</li>
</ol>6. Microdissecção de captura a laser
<ol><li>Se manchado, coloque o slide no microscópio e encontre a região de interesse (CeA) usando marcos anatômicos (ou seja, o quiasma óptico e a estria terminal).</li>
	<li>Use fluorescência para identificar o tipo de célula manchada e seu núcleo na região de interesse. Escolha uma célula ou várias células se fizer amostras agrupadas de células únicas. Marque as células de interesse usando o software LCM.</li>
	<li>Coloque a tampa lcm em cima da fatia sobre a região de interesse.</li>
	<li>Use fotos de teste de um laser infravermelho (IR) para ajustar a força, tamanho e duração do laser IR para que o adesivo de tampa LCM derreta apenas sobre a área da célula única selecionada. Isso garante que nenhuma outra célula será coletada além das células selecionadas. NOTA: Neste experimento representativo, 10 grupos celulares do mesmo tipo de célula foram utilizados como uma única amostra para limitar a variabilidade celular-célula na expressão genética entre amostras com o mesmo tratamento. No entanto, este método pode ser usado para verdadeiros experimentos de células únicas1,3.</li>
	<li>Selecione as células individuais a serem coletadas para análise usando as ferramentas de software LCM (Figura 2C). As células selecionadas devem estar na área anatômica do CeA (ou região cerebral de escolha) com base no atlas cerebral de ratos e na bregma10. As células devem estar a pelo menos 3 μm dos núcleos manchados adjacentes.</li>
	<li>Atire o laser ir para coletar as células únicas identificadas.</li>
	<li>Coloque a tampa na estação de controle de qualidade (QC) e visualize-a para garantir que apenas as células desejadas foram selecionadas. Se outras células foram selecionadas erroneamente, um laser ultravioleta pode ser usado para destruir as células indesejadas enquanto a tampa permanece na estação QC.</li>
	<li>Tire uma foto da seção de tecidos de onde a célula foi coletada para documentar sua especificidade anatômica. Registre a distância da fatia da bregma, se for o caso, usando um atlas cerebral de rato como referência10.</li>
	<li>Remova a tampa LCM da estação QC, conecte o dispositivo de extração da amostra e a pipeta de 5,5 μL de tampão de lysis na amostra. NOTA: A solução de buffer de lysis consiste em 0,5 μL de aprimoramento de lysis e 5 μL de tampão de resuspensão.</li>
	<li>Coloque o dispositivo ExtracSure em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL e coloque em uma placa de aquecimento a 75 °C por 15 min.</li>
	<li>Gire a amostra e o tampão de lyse para 30 s em baixa velocidade (0,01-0,02 x g) e coloque a amostra coletada em um congelador de -80 °C.</li>
</ol>7. RT-qPCR microfluido de célulaúnica
<ol><li>Pré-amplificação de mRNA de célula única para 96,96 Dynamic Array Chip<ol>
<li>Combine os primers de genes mRNA qPCR para todos os genes que estão sendo ensaios em uma piscina de primer para pré-amplificação (concentração de 500 nM cada primer). Por exemplo, 1 μL de primers de 100 μM em 80 μL mais 120 μL de tampão de suspensão de DNA. NOTA: As seqüências de primer usadas para o experimento representativo podem ser encontradas em O'Sullivan et al.4.</li>
		<li>Em uma nova placa PCR 96 x 96, adicione 1 μL de 5x VILO a cada poço.</li>
		<li>Remova as amostras de células únicas lcM das amostras armazenadas a -80 °C, deixe descongelar brevemente, centrífuga brevemente a uma velocidade baixa (0,01-0,02 x g),e adicione 5,5 μL da amostra de célula única lysed à placa PCR. Cada amostra é adicionada ao seu próprio poço.</li>
		<li>Coloque a placa PCR com as amostras e VILO no termociclador e aqueça a 65 °C por 1,5 min. Gire a placa por 1 min a 1.300 x g a 4 °C e coloque a placa no gelo.</li>
		<li>Adicione 0,15 μL de mistura mestre de síntese de 10x cDNA, 0,12 μL T4 Gene 32 proteína e 0,73 μL de tampão de suspensão de DNA a cada poço.</li>
		<li>Coloque a placa PCR no termociclador e execute o seguinte protocolo: 25 °C para 5 min, 50 °C para 30 min, 55 °C para 25 min, 60 °C para 5 min, 70 °C para 10 min, 4 °C para terminar.</li>
		<li>Adicione 7,5 μL de mistura mestre de polimerase Taq a cada poço.</li>
		<li>Adicione 1,5 μL da piscina de primer (veja acima) a cada poço.</li>
		<li>Coloque a placa PCR no termociclador e execute o seguinte protocolo de pré-amplificação: 95 °C por 10 min, seguido por 22 ciclos de 96 °C por 5 segundos, 60 °C por 4 min.</li>
		<li>Adicione 0,6 μL de exonuclease I amortecedor de reação 10x, 1,2 μL de exonuclease I e 4,2 μL de tampão de suspensão de DNA a cada poço.</li>
		<li>Coloque a placa PCR no termociclador e execute o seguinte protocolo: 37 °C por 30 min, 80 °C por 15 min.</li>
		<li>Adicione 54 μL de tampão TE a cada poço. Gire a placa PCR a 1.300 x g a 5 min. Armazene a 4 °C se continuar imediatamente até o próximo passo. Armazene a -20 °C se esperar mais de 12h para o próximo passo.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare a placa de amostra para o chip de matriz dinâmica 96.96.<ol>
<li>Em uma nova placa PCR de 96 poços, adicione 0,45 μL de 20x dye de ligação de DNA e 4,55 μL de mastermix ROX baixo para cada poço.</li>
		<li>Adicione 3 μL de amostra pré-amplificada a cada poço, gire a placa PCR a 1.300 x g,em seguida, coloque a placa no gelo.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare a placa de ensaio para o chip de matriz dinâmica 96.96.<ol>
<li>Em uma nova placa PCR de 96 poços, adicione 3,75 μL de 2x ge ensaio de carregamento reagente e 1,25 μL de tampão de suspensão de DNA para cada poço.</li>
		<li>Adicione 2,5 μL de 10 μM qPCR primer a cada poço correspondente. Gire a placa PCR a 1.300 x g por 5 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Carregue e execute o Chip De Matriz Dinâmica 96.96.<ol>
<li>Prime o chip com fluido de linha de controle.</li>
		<li>Coloque o chip em um IFC Controller HX e execute o script Prime (136X).</li>
		<li>Adicione 6 μL da amostra da placa de amostra PCR nos poços de amostra correspondentes no Chip de Matriz Dinâmica 96,96.</li>
		<li>Adicione 6 μL da amostra da placa de ensaio PCR nos poços de ensaio correspondentes no Chip de Matriz Dinâmica 96.96.</li>
		<li>Use agulhas para estourar quaisquer bolhas de ar nos poços do Chip Dynamic Array 96.96.</li>
		<li>Coloque o Chip de Matriz Dinâmica 96.96 no IFC Controller HX e execute o script Load Mix (136x).</li>
		<li>Remova o chip do IFC Controller HX, retire o adesivo protetor e coloque o Chip 96.96 Dynamic Array em uma plataforma RT-qPCR microfluida. Execute o protocolo GE Fast 96 x 96 PCR (30 ciclos). NOTA: A qualidade e a validade do RNA dos resultados são avaliadas por múltiplos métodos, incluindo validação de ensaios via eletroforese em gel, curvas de temperatura de fusão, réplicas de amostras e ensaios e parcelas padrão da série de diluição. Além disso, os achados transcritos podem ser validados por métodos independentes sobre hemiseção cerebral, incluindo blot ocidental e ensaios de imunofluorescência.</li>
	</ol></li>
</ol>8. Medir a abundância bacteriana com RT-qPCR microfluido
<ol><li>Extrair o DNA bacteriano seguindo as instruções do kit de extração de DNA das fezes.</li>
	<li>Estimar a concentração de DNA bacteriano usando qPCR.</li>
	<li>Adicione o DNA bacteriano extraído a uma nova placa PCR. Adicione 1 μL de DNA bacteriano extraído e 9 μL de tampão de suspensão de DNA.</li>
	<li>Prepare a placa de ensaio para o chip de matriz dinâmica 48.48 (ver passos 7.2.1-7.2.2)</li>
	<li>Prepare a placa de amostra para o chip de matriz dinâmica 48.48 (ver passos 7.3.1-7.3.2)<ol>
<li>Em uma nova placa PCR de 96 poços, adicione 0,45 μL de 20x de dine de ligação de DNA e 4,55 μL de mastermix ROX baixo a 48 poços.</li>
		<li>Adicione 3 μL da amostra da placa PCR contendo o DNA bacteriano aos 48 poços e gire a placa PCR a 1.300 x g por 5 min. Armazene a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Carregar e executar o Chip 48.48 Dynamic Array (ver passos 7.4.1-7.4.7).</li>
</ol>

<ol><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inputs+drive+cell+phenotype+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Inputs drive cell phenotype variability.</a> Genome Research. 24, 930-941 (2014).</li>
<li>Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+functional+gene+regulatory+network+phenotypes+underlying+single+cell+transcriptional+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 87-98 (2015).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Transcriptional+Analysis+Reveals+Novel+Neuronal+Phenotypes+and+Interaction+Networks+Involved+in+the+Central+Circadian+Clock%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Transcriptional Analysis Reveals Novel Neuronal Phenotypes and Interaction Networks Involved in the Central Circadian Clock.</a> Frontiers in Neuroscience. 10, 481(2016).</li>
<li>O'Sullivan, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Glia+and+Neuron+Gene+Expression+in+the+Central+Amygdala+in+Opioid+Withdrawal+Suggests+Inflammation+With+Correlated+Gut+Dysbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Glia and Neuron Gene Expression in the Central Amygdala in Opioid Withdrawal Suggests Inflammation With Correlated Gut Dysbiosis.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 665(2019).</li>
<li>Buettner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+analysis+of+cell-to-cell+heterogeneity+in+single+cell+RNA-sequencing+data+reveals+hidden+subpopulations+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells.</a> Nature Biotechnology. 33, 155-160 (2015).</li>
<li>Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+to+explore+immune+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunolology%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity.</a> Nature Reviews Immunolology. 18, 35-45 (2018).</li>
<li>SEQC/MAQC-III Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+assessment+of+RNA-seq+accuracy%2C+reproducibility+and+information+content+by+the+Sequencing+Quality+Control+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium.</a> Nature Biotechnology. 32, 903-914 (2014).</li>
<li>Rowin, J., Xia, Y., Jung, B., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+inflammation+and+dysbiosis+in+human+motor+neuron+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Gut inflammation and dysbiosis in human motor neuron disease.</a> Physiological Reports. 5, (2017).</li>
<li>Tamboli, C. P., Neut, C., Desreumaux, P., Colombel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysbiosis+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Dysbiosis in inflammatory bowel disease.</a> Gut. 53, 1-4 (2004).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%3A+Hard+Cover+Edition%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition</a>. , (2006).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A biologia unicelular demonstrou a heterogeneidade dos fenótipos celulares e a robustez da função tecidual. Esses achados forneceram insights sobre a organização de sistemas biológicos em escalas macro e micro. Aqui, descrevemos a combinação de dois métodos, LCM e qPCR microfluido, para obter medidas de transcriptome unicelular que fornecem especificidade anatômica e precisão transcricional a um custo relativamente baixo (Figura 1). Nosso grupo adota uma abordagem de biologia de sistemas e m...

Medir os perfis de expressão genética de células únicas demonstrou extensa heterogeneidade ferotípica dentro de um tecido. Essa complexidade complicou nossa compreensão das redes biológicas que regem a função tecidual. Nosso grupo e outros têm explorado esse fenômeno em muitos tecidos e condições1,2,3,4,5,6. Esses experimentos não apenas sugerem que a regulação das redes de expressão genética sustenta tal heterogeneidade, mas também que a resolução de células únicas revela uma complexidade na função tecidual que a resolução do nível tecidual não aprecia. De fato, apenas uma pequena minoria de células pode responder a uma condição ou desafio específico, mas o impacto dessas células na fisiologia global pode ser substancial. Além disso, uma abordagem de biologia do sistema que aplica métodos multivariados a conjuntos de dados de alta dimensão de vários tipos e tecidos celulares pode elucidar efeitos de tratamento em todo o sistema.
Combinamos LCM e RT-qPCR microfluido para obter tais conjuntos de dados. Nós tomamos esta abordagem aqui em contraste com a coleta de células únicas através da triagem celular ativada por fluorescência (FACS) e usando sequenciamento de RNA (RNA-seq) para medir sua transcrição. A vantagem do LCM sobre o FACS é que a especificidade anatômica exata das células únicas pode ser documentada com LCM, relativamente e absolutamente. Além disso, enquanto o RNA-seq pode medir mais características que RT-qPCR, microfluido RT-qPCR é menos caro e tem uma sensibilidade e especificidade mais elevadas7.
Neste experimento representativo, investigou-se os efeitos da dependência opióide e da retirada de opióides precipitados de naltrexona na expressão genética neuronal, microglia e astrócito de ratos no núcleo central da amígdala (ACE) e da abundância da microflora intestinal4. Foram analisados quatro grupos de tratamento: 1) Placebo, 2) Morfina, 3) Naltrexona e 4) Retirada (Figura 1). Descobrimos que a dependência de opióides não alterou substancialmente a expressão genética, mas essa retirada de opióides induziu a expressão de genes inflamatórios, tnf em particular. Os astrócitos foram o tipo de célula mais afetada. O microbioma intestinal foi profundamente impactado pela retirada de opióides, como indicado por uma diminuição na relação Firmicutes para Bacteroides, que é um marcador estabelecido de disbiose intestinal8,9.

<table><tbody><tr><td>20X DNA Binding Dye</td><td>Fluidigm</td><td>100-7609</td><td>NA</td></tr><tr><td>2x GE Ensaio Carregamento Reagente</td><td>Fluidigm</td><td>85000802-R</td><td>NA</td></tr><tr><td>48.48 Dynamic Array IFC para</td><td>Fluidigm</td> de Expressão Gênica <td>BMK-M-48.48</td><td>NA</td></tr><tr><td>96.96 Dynamic Array IFC para</td><td>Fluidigm</td> de Expressão Gênica <td>BMK-M-96.96</td><td>NA</td></tr><tr><td>Anti-CD11&beta; Anticorpo</td><td>Genway Biotech</td><td>CCEC48</td><td>Microglia Stain</td></tr><tr><td>Anti-NeuN Anticorpo, clone A60</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB377</td><td>Coloração Neuronal</td></tr><tr><td>ArcturusXT Sistema de Microdissecção de Captura a Laser</td><td>Arcturus</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>NA Biomark HD</td><td>Fluidigm</td><td>NA</td><td>Plataforma RT-qPCR</td></tr><tr><td>Antígeno de Soro Bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4287</td><td></td></tr><tr><td>CapSure Macro LCM Caps</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LCM0211</td><td>NA</td></tr><tr><td>CellDirect One-Step qRT-PCR Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11753500</td><td>Componentes da solução tampão de lise</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62248</td><td>Nucleus Stain</td></tr><tr><td>DNA Suspension Buffer</td><td>TEKnova</td><td>T0221</td><td></td></tr><tr><td>Exonuclease I</td><td>New Englnad BioLabs, Inc.</td><td>M0293S</td><td>NA</td></tr><tr><td>Dispositivo de extração de amostras ExtracSure</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LCM0208</td><td>NA</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Lâminas de microscópio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22-037-246</td><td>Lâminas de vidro liso</td></tr><tr><td>Tubo de reação de paredes finas</td><td>GeneAmp Scientific</td><td>N8010611</td><td></td></tr><tr><td>GFAP Anticorpo monoclonal</td><td>ThermoFisher Scientific ThermoFisher Scientific</td><td>A-21294</td><td>Coloração de Astrócito</td></tr><tr><td>Cabra anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal&trade; Anticorpo secundário recombinante, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A28175</td><td>Seconadry Anticorpo</td></tr><tr><td>IFC Controlador</td><td>Fluidigm</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>NA RNaseOut</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix com baixo Rox</td><td>Bio-Rad</td><td>PN 172-5211</td><td>Rox master mix</td></tr><tr><td>SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit</td><td>ThermoFisher A Scientific</td><td>11754250</td><td>contém a proteína VILO e SuperScript</td></tr><tr><td>T4 Gene 32 New</td><td>Englnad BioLabs, Inc.</td><td>M0300S</td><td>NA</td></tr><tr><td>TaqMan PreAmp Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4391128</td><td>NA</td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td>TEKnova</td><td>T0225</td><td>NA</td></tr></tbody></table>

combinando microdissecção de captura a laser e qpcr microfluido para analisar perfis transcricional de células únicas: uma abordagem de biologia de sistemas para dependência de opióides

Combining Laser Capture Microdissection and Microfluidic qPCR to Analyze Transcriptional Profiles of Single Cells: A Systems Biology Approach to Opioid Dependence

A heterogeneidade transcricional profunda em células únicas anatomicamente adjacentes sugere que a funcionalidade robusta do tecido pode ser alcançada pela diversidade de fenótipo celular. Experimentos de células únicas que investigam a dinâmica da rede de sistemas biológicos demonstram respostas celulares e teciduais a várias condições em resolução biologicamente significativa. Aqui, explicamos nossos métodos para coletar células únicas de locais anatomicamente específicos e medir com precisão um subconjunto de seus perfis de expressão genética. Combinamos a microdissecção de captura a laser (LCM) com a transcrição reversa microfluida quantitativa de reações em cadeia de polimerase (RT-qPCR). Também usamos esta plataforma microfluida RT-qPCR para medir a abundância microbiana de conteúdo intestinal.

A seleção das células únicas foi validada visual mente e molecularmente. Visualmente, a morfologia celular foi vista antes da coleta celular. As células coletadas foram então visualizadas na estação QC e a mancha de núcleos celulares (DAPI) se sobrepôs à fluorescência do marcador de seleção de células únicas. A Figura 2A mostra imagens representativas de um slide com o antecérebro de rato hemissilado contendo o CeA. Imagens subseqüentes (<str...

Este protocolo explica como coletar neurônios únicos, microglia e astrócitos do núcleo central da amígdala com alta precisão e especificidade anatômica usando microdissecção de captura a laser. Além disso, explicamos nosso uso de RT-qPCR microfluido para medir um subconjunto do transcriptome dessas células.

Combinando microdissecção de captura a laser e qPCR microfluido para analisar perfis transcricional de células únicas: uma abordagem de biologia de sistemas para dependência de opióides

Profound transcriptional heterogeneity in anatomically adjacent single cells suggests that robust tissue functionality may be achieved by cellular ...

Este é um método altamente preciso e econômico para entender a expressão genética no nível de célula única. A principal vantagem desta técnica é que podemos encaixar 96 amostras em um lote. Este alto número de amostras nos permite identificar subfenótipos celulares com uma especificidade anatômica.O pipeline deste método pode ser aplicado a qualquer problema biológico, qualquer sistema, qualquer tecido, a fim de perguntar quanto à resposta celular individual de neurônios individuais ou outros tipos de células para doença ou qualquer outro distúrbio, qualquer função. E então vá mais longe e pergunte se essas respostas celulares têm uma arquitetura anatômica. Remova o cérebro da caixa de coleta de tecido e coloque no mandril criostat.Colete 10 seções de míccro contendo o núcleo central da amígdala ou outra região cerebral preferida, descongelando 10 seções de mícrons em lâminas de vidro simples. Coloque imediatamente os slides de vidro sobre uma panela de metal descansando em gelo seco. Coloque os slides com seções cerebrais em um freezer de menos 80 graus Celsius o mais rápido possível.Para realizar uma série de desidratação de etanol e xileno, primeiro mergulhe os slides em 75% de etanol por 30 segundos. Imediatamente depois, mergulhe os slides em 95% de etanol por 30 segundos. Em seguida, mergulhe os slides em 100% etanol por 30 segundos.Por fim, mergulhe os slides diretamente em um segundo recipiente de 100% de etanol por 30 segundos. Após a série de desidratação do etanol, mergulhe os slides em xileno recém-derramado por um minuto. Imediatamente depois, mergulhe os slides em um segundo recipiente de xileno por quatro minutos antes de secar conforme descrito no protocolo de texto.Use fluorescência para identificar o tipo de célula manchada e seu núcleo na região de interesse. Escolha uma célula ou várias células se fizer amostras agrupadas por células únicas. Marque as células de interesse usando microdisseção de captura a laser ou software LCM.Coloque a tampa LCM em cima da fatia na região de interesse e derreta o adesivo da tampa LCM sobre a área da célula única selecionada, conforme descrito no protocolo de texto. Selecione as células individuais a serem coletadas para análise usando as ferramentas de software LCM. As células selecionadas devem estar na área anatômica do núcleo central da amígdala com base no atlas cerebral do rato e no bregma.As células devem ser pelo menos três mícrons dos núcleos manchados adjacentes. Em seguida, dispare o laser infravermelho para coletar as células individuais identificadas. Coloque a tampa na estação QC e visualize-a para garantir que apenas as células desejadas foram selecionadas.Se outras células foram selecionadas erroneamente, um laser ultravioleta pode ser usado para destruir as células indesejadas enquanto a tampa permanece na estação QC. Tire uma foto da seção tecidual de onde a célula foi coletada para documentar sua especificidade anatômica. Regisso a distância da fatia da bregma, se for o caso usando um atlas cerebral de rato como referência.Remova a tampa LCM da estação QC e conecte o dispositivo de extração da amostra. Em seguida, pipeta 5,5 microliters de tampão de lise na amostra. Coloque o dispositivo de extração em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitro e coloque-o em uma placa quente a 75 graus Celsius por 15 minutos.Gire a amostra e o tampão de lise por 30 segundos em baixa velocidade e coloque a amostra coletada em um congelador de menos 80 graus Celsius. Para realizar a pré-amplificação de mRNA de célula única para um chip de matriz dinâmica, adicione primeiro cinco microliters de 5X VILO a cada poço de uma nova placa 96 por 96 PCR. Remova amostras de células únicas LCM a menos 80 graus Celsius e deixe-as descongelar brevemente.Após a centrifugação em baixa velocidade, adicione 5,5 microliters das amostras de células únicas lísedas à placa PCR adicionando cada amostra ao seu próprio poço. Coloque a placa PCR com as amostras e VILO no termociclador e aqueça a 65 graus Celsius por um minuto e meio. Em seguida, gire a placa por um minuto a 1.300 vezes g e quatro graus Celsius e coloque a placa no gelo.Adicione 10X cDNA síntese master mix, T4 Gene 32 Protein, e tampão de suspensão de DNA para cada poço. Coloque a placa PCR que é a placa de exemplo um no termociclador e execute conforme detalhado no protocolo de texto. Após o ciclo, adicione nove microliters de solução de polimerase Taq a cada poço na placa PCR de 96 poços.Nove microlitres consistem em 7,5 microliters de mistura mestre de polimerase Taq e 1,5 microliters da piscina de primer. Agora, coloque a placa PCR no termociclador e execute o programa de pré-amplificação detalhado no protocolo de texto. Seguindo o protocolo de pré-amplificação, adicione seis microliters de solução exonuclease a cada poço na placa PCR de 96 poços.A solução exonuclease consiste em 0,6 microliters de tampão de reação exonuclease 10X, 1,2 microliters de exonuclease-1 e 4,2 microliters de tampão de suspensão de DNA. Coloque a placa PCR no termociclador e execute o programa listado no protocolo de texto. Por fim, adicione 54 microliters de tampão de TE a cada poço da placa de amostra um.Gire a placa PCR a 1.300 vezes g durante cinco minutos. Armazene a quatro graus Celsius se continuar imediatamente para o próximo passo. Em uma nova placa PCR de 96 poços que é a placa de amostra dois, adicione cinco microliters de corante de DNA e solução de mixagem mestre.Adicione três microliters de amostras pré-amplificadas da placa de amostra um nos poços correspondentes na placa de amostra dois. Gire a placa PCR a 1.300 vezes g e, em seguida, coloque a placa no gelo. Em uma nova placa PCR de 96 poços que é a placa de ensaio dois, adicione cinco microliters de solução de carregamento de ensaio para cada poço.A solução de carregamento de ensaios consiste em 3,75 microliters de reagente de carga de ensaio ge 2X e 1,25 microliters de tampão de suspensão de DNA por poço. Em seguida, adicione 2,5 microliters de 10 primer qPCR micromolar da placa de ensaio um para o seu poço correspondente na placa de ensaio dois. Gire a placa PCR a 1.300 vezes g durante cinco minutos.Para carregar e executar o chip de matriz dinâmico, primeiro prime o chip com fluido de linha de controle. Em seguida, coloque o chip em um controlador IFC HX e execute o script 136X prime. Adicione seis microliters da placa de amostra dois nos poços de amostra correspondentes no chip de matriz dinâmica 96 por 96.Agora, adicione seis microliters da placa de ensaio dois nos poços de ensaio correspondentes no chip de matriz dinâmico 96 por 96. Use agulhas para estourar quaisquer bolhas de ar nos poços do chip de matriz dinâmico 96 por 96. Em seguida, coloque o chip no controlador IFC HX e execute o script de mistura de carga 136X.Em seguida, remova o chip do controlador IFC HX. Coloque o chip de matriz dinâmico 96 por 96 em uma plataforma RT-qPCR microfluidic e execute o protocolo GE fast 96 por 96 PCR. A seleção das células únicas foi validada visual e molecularmente. Visualmente, a morfologia celular era vista antes da coleta celular.Aqui estão mostradas imagens representativas de um slide com cérebro de rato hemisected contendo o núcleo central da amígdala. Imagens subsequentes mostram a seleção de células únicas e sua remoção do tecido para análise transcriômica. Molecularmente, marcadores específicos do tipo celular demonstraram aumento da expressão em seu respectivo tipo de célula.Especificamente, observou-se aumento da expressão de NeuN em neurônios, Maf em microglia e Gfap em astrócitos. O mapa de calor mostra a expressão de todas as amostras em 40 genes testados. As linhas são amostras de tração, os números denotam os aglomerados amostrais e as colunas são os genes.Métodos de análise multivariada mostram que os astrócitos no grupo de retirada foram o tipo celular mais afetado. Com base nesses dados no contexto de outros estudos, os astrócitos provavelmente desempenham um papel fundamental na inflamação no núcleo central da amígdala durante a retirada de opioides. A coisa mais importante a se lembrar sobre esta técnica é usar a pipetação adequada para limitar o número de bolhas de ar.Os achados transcricionais desses experimentos podem ser validados usando métodos de medida proteica, como imunofluorescência ou mancha ocidental no mesmo tecido.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Microdissecção a laser foi aplicado para analisar perfil de expressão gênica em compartimentos específicos de Drosophila disco asa submetido a RNAi...

Microdissecção a laser Aplicada ao perfil de expressão gênica de subconjunto de células a partir do Drosophila Asa Disco

Neste artigo descrevemos um método simples para a colheita de células isoladas de ratos culturas primárias neuronais e análise de transcriptoma subsequentes usando a amplificação ARNA. Esta abordagem é generalizável a qualquer tipo de célula.

Análise do transcriptoma de uma única célula

O perfilamento da expressão de RNA em regiões discretas do cérebro de camundongos exige uma estratégia precisa e repetível de coleta de tecidos. Aqui é descrito um protocolo que utiliza o seccionamento coronal do cérebro e a microdissecação assistida por perfurador de tecidos. O rendimento e a qualidade do RNA total obtido a partir das amostras resultantes confirmam a utilidade do método descrito.

Laser não-Abordagem Microscopia de captura para o Microdissecção de regiões cerebrais discretas Mouse para isolamento de RNA total e Seqüenciamento Next-Generation Downstream e perfil de expressão gênica

Nós descrevemos como usar microdissecção a laser de captura (LCM) para obtenção das populações enriquecidas de neurônios do hipocampo ou neurônios individuais a partir de cortes congelados do cérebro do rato feridos para posterior análise de expressão de genes usando quantitativa PCR em tempo real e / ou do genoma inteiro microarrays.

Laser Microdissecção Captura de Populações enriquecida de neurônios ou neurônios individuais para análise de expressão gênica após a lesão cerebral traumática

O isolamento de neurônios de dopamina individuais ou a área tegmental ventral com imunohistoquímica direta ou indireta é demonstrada usando captura a laser microdissection. São discutidos os parâmetros para o isolamento de tecido a partir de uma lâmina de vidro usando um laser de infravermelhos e a partir de lâminas de membrana usando a combinação de um laser infravermelho e ultravioleta.

Captura Laser Microdissection - uma demonstração do Isolamento de Pessoa dopamina Neurônios e região ventral tegmental Entire

Aqui apresentamos um protocolo para microdissecção assistida por laser de tipos específicos de células vegetais para perfil transcricional. Embora o protocolo seja adequado para diferentes espécies e tipos de células, o foco está nas células altamente inacessíveis da linha germinativa feminina, importantes para a reprodução sexual e apomítica no gênero de crucíferas Boechera.

assistida por laser Microdissecção (LAM) como ferramenta para transcricional Profiling de tipos de células individuais

Granel gene expressão medições nuvem célula individual diferenças nas populações de células heterogêneas. Aqui, descrevemos um protocolo para análise de expressão do gene como unicelular e índice classificação por Florescence ativado celular classificação (FACS) pode ser combinado para delinear a heterogeneidade e immunophenotypically caracterizam populações de células molecularmente distinta.

Uma combinatória célula única abordagem para caracterizar o Molecular e imunofenotípica heterogeneidade de tronco humano e populações de Progenitor

Este protocolo descreve a microdissecção da captação do laser para a isolação da cartilagem e do osso das seções congeladas frescas do embrião do rato. Cartilagem e osso podem ser rapidamente visualizados por manchas violetas cresyl e coletados precisamente para produzir RNA de alta qualidade para análise transcriptômica.

Microdissecção de captura a laser da cartilagem embrionária do rato e osso para análise de expressão gênica

Aqui apresentamos um método multiplexado de sequenciamento de mRNA de célula única para perfilar a expressão gênica em tecidos embrionários de camundongos. O método de sequenciamento de mRNA de célula única baseada em gotículas (scRNA-Seq) em combinação com estratégias multiplexing pode perfilar células únicas a partir de várias amostras simultaneamente, o que reduz significativamente os custos de reagente e minimiza os efeitos experimentais do lote.

Análise multiplexada do sequenciamento de mRNA celular único de células embrionárias de camundongos

A combinação de microdissecção de captura a laser e RT-qPCR microfluídica fornece especificidade anatômica e biotécnica na medição do transcriptoma em neurônios únicos e glia. A aplicação de métodos criativos com a abordagem biológica de um sistema para doenças psiquiátricas pode levar a avanços na compreensão e tratamento, como a hipótese anti-recompensa da neuroinflamação no vício.

Investigando Drivers de Anti-recompensa no Comportamento de Dependência com Métodos de Expressão Gênica de Célula Única Anatomicamente Específicos

Este protocolo descreve um método para isolar RNA de regiões histológicas definidas de tecido hepático de camundongo, fixado com paraformaldeído, composto de Temperatura Ótima de Corte, utilizando microdissecação por captura a laser, permitindo análise direcionada de expressão gênica a jusante.

Microdissecação por captura a laser de tecido hepático de camundongo fixado com paraformaldeído para análise de RNA

Aprenda a combinar microdissecção por laser e RT-qPCR microfluido para analisar perfis transcricionais de células únicas do núcleo central da amígdala. Este método permite identificar subfenótipos celulares com especificidade anatômica em neurociência.

Combinando microdissecção de captura a laser e qPCR microfluido para analisar perfis transcricional de células únicas: uma abordagem de biologia de sistemas para dependência de opióides (Vídeo) | JoVE Journal

Combinando microdissecção de captura a laser e qPCR microfluido para analisar perfis transcricional de células únicas: uma abordagem de biologia de sistemas para dependência de opióides

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