Combinando microdissecção de captura a laser e qPCR microfluido para analisar perfis transcricional de células únicas: uma abordagem de biologia de sistemas para dependência de opióides
8 de março de 2020
Este protocolo explica como coletar neurônios únicos, microglia e astrócitos do núcleo central da amígdala com alta precisão e especificidade anatômica usando microdissecção de captura a laser. Além disso, explicamos nosso uso de RT-qPCR microfluido para medir um subconjunto do transcriptome dessas células.
Este é um método altamente preciso e econômico para entender a expressão genética no nível de célula única. A principal vantagem desta técnica é que podemos encaixar 96 amostras em um lote. Este alto número de amostras nos permite identificar subfenótipos celulares com uma especificidade anatômica.
O pipeline deste método pode ser aplicado a qualquer problema biológico, qualquer sistema, qualquer tecido, a fim de perguntar quanto à resposta celular individual de neurônios individuais ou outros tipos de células para doença ou qualquer outro distúrbio, qualquer função. E então vá mais longe e pergunte se essas respostas celulares têm uma arquitetura anatômica. Remova o cérebro da caixa de coleta de tecido e coloque no mandril criostat.
Colete 10 seções de míccro contendo o núcleo central da amígdala ou outra região cerebral preferida, descongelando 10 seções de mícrons em lâminas de vidro simples. Coloque imediatamente os slides de vidro sobre uma panela de metal descansando em gelo seco. Coloque os slides com seções cerebrais em um freezer de menos 80 graus Celsius o mais rápido possível.
Para realizar uma série de desidratação de etanol e xileno, primeiro mergulhe os slides em 75% de etanol por 30 segundos. Imediatamente depois, mergulhe os slides em 95% de etanol por 30 segundos. Em seguida, mergulhe os slides em 100% etanol por 30 segundos.
Por fim, mergulhe os slides diretamente em um segundo recipiente de 100% de etanol por 30 segundos. Após a série de desidratação do etanol, mergulhe os slides em xileno recém-derramado por um minuto. Imediatamente depois, mergulhe os slides em um segundo recipiente de xileno por quatro minutos antes de secar conforme descrito no protocolo de texto.
Use fluorescência para identificar o tipo de célula manchada e seu núcleo na região de interesse. Escolha uma célula ou várias células se fizer amostras agrupadas por células únicas. Marque as células de interesse usando microdisseção de captura a laser ou software LCM.
Coloque a tampa LCM em cima da fatia na região de interesse e derreta o adesivo da tampa LCM sobre a área da célula única selecionada, conforme descrito no protocolo de texto. Selecione as células individuais a serem coletadas para análise usando as ferramentas de software LCM. As células selecionadas devem estar na área anatômica do núcleo central da amígdala com base no atlas cerebral do rato e no bregma.
As células devem ser pelo menos três mícrons dos núcleos manchados adjacentes. Em seguida, dispare o laser infravermelho para coletar as células individuais identificadas. Coloque a tampa na estação QC e visualize-a para garantir que apenas as células desejadas foram selecionadas.
Se outras células foram selecionadas erroneamente, um laser ultravioleta pode ser usado para destruir as células indesejadas enquanto a tampa permanece na estação QC. Tire uma foto da seção tecidual de onde a célula foi coletada para documentar sua especificidade anatômica. Regisso a distância da fatia da bregma, se for o caso usando um atlas cerebral de rato como referência.
Remova a tampa LCM da estação QC e conecte o dispositivo de extração da amostra. Em seguida, pipeta 5,5 microliters de tampão de lise na amostra. Coloque o dispositivo de extração em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitro e coloque-o em uma placa quente a 75 graus Celsius por 15 minutos.
Gire a amostra e o tampão de lise por 30 segundos em baixa velocidade e coloque a amostra coletada em um congelador de menos 80 graus Celsius. Para realizar a pré-amplificação de mRNA de célula única para um chip de matriz dinâmica, adicione primeiro cinco microliters de 5X VILO a cada poço de uma nova placa 96 por 96 PCR. Remova amostras de células únicas LCM a menos 80 graus Celsius e deixe-as descongelar brevemente.
Após a centrifugação em baixa velocidade, adicione 5,5 microliters das amostras de células únicas lísedas à placa PCR adicionando cada amostra ao seu próprio poço. Coloque a placa PCR com as amostras e VILO no termociclador e aqueça a 65 graus Celsius por um minuto e meio. Em seguida, gire a placa por um minuto a 1.300 vezes g e quatro graus Celsius e coloque a placa no gelo.
Adicione 10X cDNA síntese master mix, T4 Gene 32 Protein, e tampão de suspensão de DNA para cada poço. Coloque a placa PCR que é a placa de exemplo um no termociclador e execute conforme detalhado no protocolo de texto. Após o ciclo, adicione nove microliters de solução de polimerase Taq a cada poço na placa PCR de 96 poços.
Nove microlitres consistem em 7,5 microliters de mistura mestre de polimerase Taq e 1,5 microliters da piscina de primer. Agora, coloque a placa PCR no termociclador e execute o programa de pré-amplificação detalhado no protocolo de texto. Seguindo o protocolo de pré-amplificação, adicione seis microliters de solução exonuclease a cada poço na placa PCR de 96 poços.
A solução exonuclease consiste em 0,6 microliters de tampão de reação exonuclease 10X, 1,2 microliters de exonuclease-1 e 4,2 microliters de tampão de suspensão de DNA. Coloque a placa PCR no termociclador e execute o programa listado no protocolo de texto. Por fim, adicione 54 microliters de tampão de TE a cada poço da placa de amostra um.
Gire a placa PCR a 1.300 vezes g durante cinco minutos. Armazene a quatro graus Celsius se continuar imediatamente para o próximo passo. Em uma nova placa PCR de 96 poços que é a placa de amostra dois, adicione cinco microliters de corante de DNA e solução de mixagem mestre.
Adicione três microliters de amostras pré-amplificadas da placa de amostra um nos poços correspondentes na placa de amostra dois. Gire a placa PCR a 1.300 vezes g e, em seguida, coloque a placa no gelo. Em uma nova placa PCR de 96 poços que é a placa de ensaio dois, adicione cinco microliters de solução de carregamento de ensaio para cada poço.
A solução de carregamento de ensaios consiste em 3,75 microliters de reagente de carga de ensaio ge 2X e 1,25 microliters de tampão de suspensão de DNA por poço. Em seguida, adicione 2,5 microliters de 10 primer qPCR micromolar da placa de ensaio um para o seu poço correspondente na placa de ensaio dois. Gire a placa PCR a 1.300 vezes g durante cinco minutos.
Para carregar e executar o chip de matriz dinâmico, primeiro prime o chip com fluido de linha de controle. Em seguida, coloque o chip em um controlador IFC HX e execute o script 136X prime. Adicione seis microliters da placa de amostra dois nos poços de amostra correspondentes no chip de matriz dinâmica 96 por 96.
Agora, adicione seis microliters da placa de ensaio dois nos poços de ensaio correspondentes no chip de matriz dinâmico 96 por 96. Use agulhas para estourar quaisquer bolhas de ar nos poços do chip de matriz dinâmico 96 por 96. Em seguida, coloque o chip no controlador IFC HX e execute o script de mistura de carga 136X.
Em seguida, remova o chip do controlador IFC HX. Coloque o chip de matriz dinâmico 96 por 96 em uma plataforma RT-qPCR microfluidic e execute o protocolo GE fast 96 por 96 PCR. A seleção das células únicas foi validada visual e molecularmente. Visualmente, a morfologia celular era vista antes da coleta celular.
Aqui estão mostradas imagens representativas de um slide com cérebro de rato hemisected contendo o núcleo central da amígdala. Imagens subsequentes mostram a seleção de células únicas e sua remoção do tecido para análise transcriômica. Molecularmente, marcadores específicos do tipo celular demonstraram aumento da expressão em seu respectivo tipo de célula.
Especificamente, observou-se aumento da expressão de NeuN em neurônios, Maf em microglia e Gfap em astrócitos. O mapa de calor mostra a expressão de todas as amostras em 40 genes testados. As linhas são amostras de tração, os números denotam os aglomerados amostrais e as colunas são os genes.
Métodos de análise multivariada mostram que os astrócitos no grupo de retirada foram o tipo celular mais afetado. Com base nesses dados no contexto de outros estudos, os astrócitos provavelmente desempenham um papel fundamental na inflamação no núcleo central da amígdala durante a retirada de opioides. A coisa mais importante a se lembrar sobre esta técnica é usar a pipetação adequada para limitar o número de bolhas de ar.
Os achados transcricionais desses experimentos podem ser validados usando métodos de medida proteica, como imunofluorescência ou mancha ocidental no mesmo tecido.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este protocolo descreve um método para coletar neurônios isolados, micróglias e astrócitos do núcleo central da amígdala com alta precisão utilizando microdissecção a laser. Também detalha a aplicação da RT-qPCR em microfluídica para analisar o transcriptoma dessas células.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Expressão Gênica
Contexto
- Compreender a expressão gênica no nível de célula única é essencial para a pesquisa em neurociência.
- Um alto rendimento de amostras permite a identificação de subfenótipos celulares.
- A especificidade anatômica é importante para estudar as respostas celulares no cérebro.
- Este método pode ser aplicado a diversos problemas biológicos em diferentes tecidos.
Objetivo do Estudo
- Coletar tipos específicos de células da amígdala com precisão.
- Medir a expressão gênica em células individuais.
- Explorar as respostas celulares a doenças ou perturbações.
Métodos Utilizados
- Microdissecção a laser com captura para coleta de células.
- RT-qPCR em microfluídica para análise do transcriptoma.
- Processamento de amostras de alto rendimento.
- Aplicação do método a diversos contextos biológicos.
Resultados Principais
- Coleta bem-sucedida de neurônios isolados, micróglias e astrócitos.
- Identificação de subfenótipos celulares com especificidade anatômica.
- Aplicabilidade comprovada do método em diferentes tecidos.
- Informações sobre as respostas individuais das células a perturbações.
Conclusões
- Este método fornece uma ferramenta poderosa para a pesquisa em neurociência.
- Ele aprimora nossa compreensão da expressão gênica em tipos celulares específicos.
- A abordagem pode ser adaptada para diversas questões de pesquisa em biologia.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite o perfilamento transcricional de alta resolução de células individuais anatomicamente definidas, apoiando a validação de alvos por meio da redução de riscos fenotípicos na descoberta de fármacos em neurociência. Ao associar a heterogeneidade celular às respostas funcionais em regiões cerebrais relevantes para a doença, aumenta a confiança preditiva na seleção precoce de alvos. A plataforma escalonável de qPCR em microfluídica permite leituras quantitativas reprodutíveis que orientam decisões de seguir/não seguir em dependência de opioides e outras indicações do SNC relacionadas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmácia
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar a heterogeneidade transcricional em células anatomicamente adjacentes para esclarecer fenótipos funcionais e reduzir ambiguidades mecanicistas nas hipóteses de alvo.
- Valor Operacional: Permite o isolamento de neurônios, micróglias e astrócitos do núcleo central da amígdala com especificidade anatômica para esclarecimento de vias.
- Valor Estratégico: Facilita a identificação de subfenótipos celulares que orientam a priorização de alvos e a triagem de portfólios na descoberta de fármacos para o SNC.
Desenvolvimento de Ensaios e Triagem
- Valor Científico: Gera dados quantitativos de expressão gênica de células individuais para permitir triagem confiável de compostos em sistemas celulares validados.
- Valor Operacional: Fornece um fluxo de trabalho padronizado e de alto rendimento (96 amostras por lote) para perfis transcricionais reprodutíveis em diferentes condições experimentais.
- Valor Estratégico: Produz leituras escalonáveis e multiplexadas que apoiam a reprodutibilidade do ensaio e a comparação de dados entre funções em pipelines de descoberta.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Relaciona respostas transcricionais específicas de tipos celulares (por exemplo, ativação de astrócitos na abstinência) com mecanismos da doença, apoiando a validação pré-clínica alinhada a biomarcadores.
- Valor Operacional: Permite continuidade da descoberta ao trabalho pré-clínico, fornecendo dados moleculares validados de célula única com resolução anatômica.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avanço com ajuste de risco ao revelar quais tipos celulares são mais afetados em estados patológicos, como os astrócitos na abstinência de opioides.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta ao permitir análises hipótese-dirigidas de célula única, desde o isolamento do tecido até a leitura transcricional, apoiando esforços iniciais de validação de alvos e identificação de compostos promissores na neurociência.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao isolar células individuais de regiões anatômicas definidas e medir seus perfis de expressão gênica.
- Triagem: Fornece saídas transcricionais quantitativas prontas para ensaios com alta reprodutibilidade, permitindo avaliação confiável das respostas celulares a perturbações.
- Análises: Gera dados multiplexados de expressão gênica (40 genes) adequados para análise multivariada e triagem comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados em nível de célula única a mecanismos de doença em nível tecidual, como a inflamação mediada por astrócitos na amígdala durante a abstinência.
- Reutilização Empresarial: Representa uma plataforma reutilizável para perfis transcricionais em diferentes tecidos e modelos de doenças, não se restringindo à dependência de opioides.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir o ruído biológico por meio da especificidade anatômica e celular na validação de alvos.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio da RT-qPCR em microfluídica com alto rendimento de amostras (96-plex) e variabilidade técnica mínima.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir a eliminação precoce de riscos dos alvos por meio de insights mecanicistas obtidos de populações raras de células.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização ajustada ao risco ao identificar quais tipos celulares conduzem respostas transcricionais relevantes para a doença.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em microdissecção com captura a laser, corte de tecidos e mapeamento anatômico do cérebro utilizando atlas cerebral de rato e referência de bregma.
- Depende de infraestrutura de RT-qPCR em microfluídica, incluindo chips de matriz dinâmica, controlador IFC HX e equipamentos de termociclagem para pré-amplificação e qPCR.
- Necessita de protocolos padronizados para manipulação de amostras, lise e controle de contaminação para manter a integridade de células isoladas e a precisão dos dados.
- Envolve etapas de otimização, como minimização de bolhas de ar durante o carregamento do chip e validação por meio de marcadores moleculares (por exemplo, NeuN, Maf, Gfap) para confirmar a especificidade do tipo celular.
- Limitado pela qualidade e rendimento de RNA extraído de células isoladas por microdissecção com captura a laser, exigindo processamento cuidadoso das amostras para evitar degradação durante a extração e armazenamento.
