Sistema de Cocultura Multidimensional para Modelar Progressão do Carcinoma Escamoso Pulmonar
17 de março de 2020
Um sistema de modelo in vitro foi desenvolvido para capturar alterações arquitetônicas teciduais durante a progressão do carcinoma escamoso pulmonar (LUSC) em uma cocultura tridimensional (3D) com fibroblastos associados ao câncer (CAFs). Este sistema organóide fornece uma plataforma única para investigar os papéis de diversas alterações tumorais intrínsecas e extrínsecas que modulam o fenótipo tumoral.
Nosso sistema de cultura captura a plasticidade fenotípica das células carcinoma escamosas do pulmão em resposta às interações tumorais-estroma e como essas interações regulam a morfologia tumoral durante a progressão do carcinoma de células escamosas pulmonares. A principal vantagem do nosso sistema é sua capacidade de modelar a biologia celular escímnea pulmonar em um contexto 3D, preservando a plasticidade das células malignas. Esta cocultura 3D fornece um sistema único para investigar interações células tumorais-estromoma e poderia ser adaptada para monitorar respostas de células escamosas células pulmonares células cancerígenas e fibroblastos associados ao câncer para o tratamento medicamentoso.
Para começar, descongele frascos de matriz de membrana de porão em uma geladeira de quatro graus Celsius durante a noite. Esfrie as pipetas plásticas de dois mililitros e as pontas a menos 20 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, aqueça os reagentes usados para dissociar células TUM622, tampão HEPES, trippsina/EDTA e tampão de neutralização de trippsina em um banho de água de 37 graus Celsius.
Tire a matriz de membrana do porão descongelada da geladeira e coloque o frasco no gelo. Esfrie as placas de cultura tecidual em um refrigerador de plataforma metálica colocado no gelo. Coloque tubos de centrífugas em um rack de resfriamento de metal no gelo.
Calcule a quantidade de células necessárias com base no número de poços e na concentração de células em cada poço a ser preparado. Transfira a suspensão celular TUM622 em um tubo de centrífuga resfriado e gire a 300 vezes g em uma centrífuga de balde pendurado a quatro graus Celsius por cinco minutos. Com uma pipeta aspirada presa a uma ponta não filtrada, aspire o supernatante cuidadosamente, deixando aproximadamente 200 microliters do meio no tubo.
Toque suavemente na lateral do tubo para desalojar e dissociar a pelota e, em seguida, devolvê-la ao rack de resfriamento. Usando as pipetas pré-coloniais de dois mililitros, misture suavemente a matriz no gelo, pipetando para cima e para baixo algumas vezes. Pipeta a uma velocidade uniforme e moderada para que nenhuma bolha seja introduzida na matriz durante este procedimento.
Transfira 1,1 mililitros da matriz para cada tubo de centrífuga. Usando pontas pré-torneadas, pipete a matriz em cada tubo para cima e para baixo cerca de 10 vezes para fazer uma suspensão de célula uniforme. Transfira 310 microliters da suspensão da matriz celular para cada poço de uma placa pré-transformada de 24 poços.
Coloque a pipeta em um ângulo de 90 graus à superfície da placa e adicione a suspensão ao centro do poço. A suspensão se espalha e cobre todo o poço. Para facilitar a análise da imunofluorescência a jusante, transfira 60 microlitadores de suspensão da matriz celular para o centro do poço de um escorregador de câmara de dois poços.
Isso permite que a matriz forme uma estrutura semelhante a uma cúpula com volume muito menor. Devolva a placa e a câmara deslize de volta para a incubadora de cultura tecidual e incubar por 30 minutos para permitir que a matriz se solidifique. Depois disso, examine a placa e deslize sob um microscópio de luz para garantir que as células únicas sejam distribuídas uniformemente dentro da matriz.
Adicione um mililitro de cultura 3D pré-aquecida em cada poço da placa e 1,5 mililitros de cultura 3D em cada poço do escorregador da câmara, em seguida, devolva-os à incubadora. Após a preparação de suspensões celulares de TUM622 e CAFs como descrito anteriormente, conte a densidade celular CAF misturando 10 microlitadores de suspensão celular com 10 microliters de azul tripano. Adicione 10 microliters da mistura a cada uma das duas câmaras no hemótmetro para contar e calcular a densidade celular.
Para co-incorporar células TUM622 e CAFs na matriz de membrana do porão, primeiro calcule o número desejado de células usadas para chapeamento com base nas informações de densidade celular. Os CAFs são semeados a uma proporção de 2:1 de células TUM622. Transfira o volume calculado de TUM622s, bem como a suspensão celular CAF para o mesmo tubo de centrífuga.
Gire para baixo e aspire todos os meios. Resuspend na matriz de membrana do porão e placa 310 microliters da mistura em cada poço de uma placa de 24 poços. Para imunofluorescência, transfira 60 microlitres de misturas TUM622 e CAF para lâminas de câmara, conforme descrito anteriormente.
Para a cocultura TUM622 com CAFs sobrepostos na matriz de membrana do porão, primeiro configure monocultura TUM622 como descrito anteriormente, transfira o dobro do número de suspensão de CAF para um tubo de centrífuga e gire a 300 vezes g por cinco minutos à temperatura ambiente. Aspirar o supernasce e resuspensar os CAFs em meio de cultura, transferir o dobro do número de células CAF que foram resuspengidas em meio de cultura em cada um dos poços contendo as células TUM622 incorporadas. As células TUM622 típicas na cultura 2D são arredondadas com grandes núcleos, enquanto os CAFs são planos e alongados.
Semeadas na cultura 3D, as células tum622 individuais eram capazes de formar organoides com morfologias acinarlike quando incorporadas. Entre os dias cinco e sete, um lúmen tornou-se aparente nas estruturas acinarlike e permaneceu oco depois disso. Cada acinus, composto por uma monocamada de células ao redor do lúmen oco, exibia a polaridade basal apical adequada semelhante à do epitélio pulmonar in vivo.
Essas estruturas acinarlike eram hiperplásticas e continuaram a crescer até 24 dias antes da matriz extracelular se desintegrar completamente. Nas coculturas TUM622-CAF, seja sobreposta ou co-incorporação, a presença de CAFs aumentou consideravelmente o número e o tamanho dos esferoides formados. Curiosamente, quando tum622 acini entrou em proximidade com cafs, eles induziram o acini a se tornar invasivo e migrar em direção aos CAFs, formando estruturas semelhantes a lágrimas.
Para garantir uma formação robusta de estruturas acinarlike, é fundamental manter a matriz de membrana do porão em sua forma líquida durante todo o processo de incorporação das células. Os organoides TUM622 podem ser usados para uma variedade de análises a jusante, incluindo, mas não se limitando a imunofluorescentes, imunohistoquímica, citometria de fluxo, RNA e extração de proteínas, e também podem ser modificados para triagem de medicamentos. Usando esse sistema como plataforma, pode-se investigar como as alterações intrínsecas das células tumorais, bem como as alterações extrínsecas celulares no microambiente tumoral podem influenciar a arquitetura epitelial do tumor e a formação de carcinoma.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um sistema modelo in vitro para explorar alterações arquitetônicas nos tecidos durante a progressão do carcinoma escamoso de pulmão (LUSC). O cultivo tridimensional em co-cultura com fibroblastos associados ao câncer (CAFs) permite investigar alterações intrínsecas e extrínsecas às células tumorais que influenciam o fenótipo tumoral.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Oncologia
- Biologia Celular
Contexto
- O carcinoma de células escamosas de pulmão (LUSC) exibe plasticidade fenotípica.
- As interações entre tumor e estroma desempenham um papel fundamental na regulação da morfologia tumoral.
- Sistemas de cultura 3D são essenciais para modelar a biologia tumoral complexa.
- Compreender essas interações pode auxiliar no desenvolvimento de terapias direcionadas.
Objetivo do Estudo
- Modelar a biologia de células escamosas pulmonares em um contexto tridimensional.
- Investigar as interações entre células tumorais e fibroblastos associados ao câncer.
- Avaliar a adaptabilidade do sistema para respostas ao tratamento com medicamentos.
Métodos Utilizados
- Desenvolvimento de um sistema de co-cultura 3D.
- Descongelamento e preparação da matriz da membrana basal.
- Dissociação de células TUM622 utilizando tampões específicos.
- Monitoramento das interações tumor-estroma in vitro.
Resultados Principais
- O sistema capta efetivamente a plasticidade das células de CEP.
- As interações com CAFs influenciam significativamente a morfologia tumoral.
- É viável a adaptação para o monitoramento de tratamento com fármacos.
- O modelo fornece informações sobre a biologia tumoral e as respostas ao tratamento.
Conclusões
- O sistema de co-cultivo tridimensional é uma ferramenta valiosa para o estudo do CSCUP.
- Compreender as interações entre tumor e estroma pode orientar estratégias terapêuticas.
- Este modelo pode aprimorar o desenvolvimento de tratamentos oncológicos direcionados.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A modelagem das interações entre tumor e estroma em um contexto tridimensional fisiologicamente relevante preenche uma lacuna crítica na descoberta de fármacos para carcinoma de células escamosas de pulmão, onde sistemas convencionais em 2D não conseguem capturar a desorganização da arquitetura epitelial nem fenótipos invasivos. Esta plataforma de organoides permite a desaceleração mecanicista de alvos ao preservar a plasticidade fenotípica das células cancerosas e recapitular influências microambientais dinâmicas, aumentando a confiança preditiva em campanhas de validação de alvos e triagem fenotípica. A adaptabilidade do sistema para análises posteriores o posiciona como uma capacidade reutilizável em todo o fluxo de trabalho, desde a descoberta inicial até a fase pré-clínica, reduzindo a taxa de falhas biológicas em portfólios de oncologia.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas modelando como as interações entre tumor e estroma regulam a arquitetura epitelial durante a progressão da carcinoma.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos mediante a observação de morfologias invasivas induzidas por CAFs e da formação de estruturas semelhantes a acinos em um sistema relevante para a doença.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao capturar a plasticidade fenotípica de células de carcinoma de pulmão escamoso em resposta a sinais do microambiente.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para triagem de compostos, mantendo morfologias semelhantes a ácinos com polaridade apical-basal adequada durante períodos prolongados de cultivo.
- Valor Operacional: Padroniza leituras de ensaios por meio de parâmetros estruturais quantificáveis, como tamanho e número de esferoides e formações invasivas com aspecto de gota em resposta a sinais do estroma.
- Valor de Escalabilidade: Facilita a reutilização da plataforma para monitoramento de tratamentos farmacológicos, já que o cultivo em co pode ser adaptado para avaliar as respostas de células tumorais e fibroblastos associados ao câncer frente a intervenções terapêuticas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Translacional: Modela a dinâmica de sistemas relevantes à doença ao recapitular características-chave da arquitetura tecidual do carcinoma de pulmão escamoso e das interações estromais observadas na tumorigênese.
- Continuidade Pré-clínica: Conecta a descoberta à validação pré-clínica ao permitir a análise de mecanismos intrínsecos e extrínsecos às células tumorais que promovem a disruptura epitelial, orientando decisões de avanço ajustadas ao risco.
- Alinhamento de Biomarcadores: Apoia a descoberta translacional de biomarcadores por meio da compatibilidade com fluxos de trabalho downstream de imunofluorescência, imunohistoquímica e extração de RNA e proteínas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a testagem da hipótese do alvo até a identificação de compostos promissores e a validação pré-clínica, apoiado por sua capacidade de modelar interações dinâmicas entre tumor e estroma e permitir leituras fenotípicas quantitativas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao revelar como o co-embutimento ou sobreposição de CAF potencializa a formação de esferoides e induz morfologias invasivas em forma de lágrima nos acínios TUM622.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio da formação reprodutível de cocultivos tridimensionais, permitindo a avaliação padronizada dos efeitos de compostos em sistemas de cocultivo tumor-estroma.
- Análises: Permite medidas quantitativas da formação de estruturas semelhantes a acínios, desenvolvimento de lúmen, tamanho dos esferoides e padrões de migração invasiva para comparação entre condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Relaciona-se com estudos pré-clínicos ao modelar a desorganização da arquitetura epitelial e a invasão induzida pelo estroma, processos-chave na progressão de carcinomas relevantes para intervenções terapêuticas.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma plataforma adaptável, e não como uma técnica de uso único, compatível com aplicações de imunofluorescência, citometria de fluxo e triagem de fármacos em diversos projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva ao modelar a plasticidade fenotípica de células tumorais e alterações morfológicas dependentes do estroma em um sistema tridimensional de carcinoma de pulmão escamoso.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio de proporções definidas de células (2:1 CAF:TUM622), protocolos padronizados de manipulação da matriz e fenótipos estruturais quantificáveis.
- Valor Estratégico: Melhora decisões de prosseguimento ou interrupção ao reduzir riscos dos alvos por meio da observação de invasão induzida pelo microambiente e da ruptura epitelial, diminuindo o risco de falhas biológicas em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Permite priorização ajustada ao risco ao identificar alvos cuja modulação afeta as interações entre tumor e estroma e as transições de acinar para invasivo em um modelo fisiologicamente relevante.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em cultura de células primárias, manipulação de matriz extracelular tridimensional e técnica estéril para a montagem de culturas em co-cultivo.
- Depende do acesso à matriz da membrana basal, equipamentos com controle de temperatura (4°C, 37°C) e microscopia óptica invertida para avaliação da morfologia.
- Necessita padronização entre equipes nos protocolos de preparação celular, mistura da matriz e semeadura, para garantir a formação consistente de estruturas semelhantes a acinos entre diferentes usuários.
- Requer considerações de adaptação ao estender o método a outros tipos de fibroblastos ou modelos tumorais além das CAFs associadas ao carcinoma de pulmão de células escamosas TUM622.
- As limitações práticas incluem a necessidade de manter a matriz no estado líquido durante a inclusão e a janela de cultura limitada antes da desintegração da matriz (~24 dias), conforme suportado pelo material de origem.
