Name: Análise da população lateral em linhas celulares tumorais sólidas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Aprenda a analisar a população lateral em linhas celulares tumorais sólidas para identificar células-tronco cancerígenas. Este método rápido e econômico auxilia no estudo das propriedades de stemness e na compreensão da biologia tumoral.

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Este trabalho foi financiado pela Fundação de Ciências Naturais da China 81572599, 81773124 e 81972787; Fundação de Ciência Natural da Cidade de Tianjin (China) 19JCYBJC27300; Tianjin People's Hospital & Nankai University Collaborative Research Grant 2016rmnk005; Fundos de Pesquisa Fundamentais para as Universidades Centrais, 63191153 da Universidade de Nankai.

1. Preparação celular
<ol><li>Digestão celular e neutralização<ol>
<li>Células tumorais de sementes (como células MDA-MB-231) em uma placa de 6 poços, e cultivadas em uma incubadora de 37 °C fornecida com 5% de CO2.</li>
		<li>Células de colheita quando sua densidade atinge cerca de 90%. Aspire bem o meio de cultura e lave as células 2x com 3 mL de soro fisco tamponado (PBS). NOTA: Para examinar os efeitos dos inibidores da via de sinalização (por exemplo, inibidor FRA1) ou ativadores FRA1 (por exemplo, ativador STAT3) sobre as características de tronco das células tumorais, as células tumorais são semeadas em uma placa de 6 poços e pré-tratadas com inibidores ou ativadores por um certo período de tempo antes da colheita.</li>
		<li>Adicione 500 μL de 0,25% trypsin-EDTA a cada poço da placa de 6 poços, coloque a placa em uma incubadora a 37 °C por 1-3 minutos (min) e bata suavemente na placa para desprender as células. NOTA: A digestão prolongada afetará o perfil de PS devido a alterações na viabilidade celular.</li>
		<li>Adicione 3 mL de PBS suplementado com 2% de soro bovino fetal (FBS) a cada poço da placa de 6 poços para terminar a digestão e in pipetar suavemente as células para cima e para baixo 3-5x para dispersar as aglomerados celulares.</li>
		<li>Adicione 0,5 mL de suspensão celular a um poço de uma nova placa de poço 6 e examine-a sob um microscópio. Se forem observadas aglomerações celulares, passe a suspensão celular através de um coador de células de 70 μM. NOTA: Este é um passo opcional.</li>
		<li>Transfira as células para um tubo de centrífuga de 15 mL. Células centrífugas a 200 x g por 5 min para células de pelotização. Remova o supernasce e resuspensá-los em 3 mL de PBS complementados com 2% de FBS. Pipeta as células para cima e para baixo 3-5x para misturar completamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Contagem de células<ol>
<li>Adicione 50 μL da suspensão celular em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL e misture-o com uma solução azul trypan de 50 μL. Pipeta 10 μL da mistura para contar o número de células vivas usando um método padrão, como um hemócito.</li>
		<li>Diluir as células em PBS suplementadas com 2% de FBS a uma concentração final de 1 x 106 células/mL. Adicione 1 mL da suspensão celular a um tubo de teste de fundo redondo de poliestireno de 5 mL e prepare dois tubos de amostra.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Coloração celular com Hoechst 33342
<ol><li>Adicione Hoechst 33342 a um tubo para alcançar uma concentração final apropriada. NOTA: Por exemplo, a concentração apropriada de Hoechst 33342 é de 3 μg/mL para células MDA-MB-231.</li>
	<li>Adicione um bloqueador (por exemplo, Fumitremorgin C, Verapamil ou Reserpine) a outro tubo a uma concentração final apropriada e incubar o tubo a 37 °C por 30 minutos antes de adicionar a mesma concentração de Hoechst 33342 como descrito na etapa 2.1. NOTA: Para células MDA-MB-231, o bloqueador apropriado é Reserpine (40 μM). A reserpina é usada como controle de bloqueio para verificar a ausência de células na área de CONTROLADORia fechada.</li>
	<li>Prepare vários tubos contendo células e adicione Hoechst 33342 a diferentes gradientes de concentração. Após um ensaio de citometria de fluxo, escolha a concentração adequada de acordo com o perfil e proporção de SP. NOTA: Este é um passo opcional usado para definir a concentração adequada de Hoechst 33342.</li>
	<li>Prepare vários tubos contendo células, adicione o bloqueador a diferentes gradientes de concentração, incuba os tubos a 37 °C por 30 minutos e adicione Hoechst 33342 a uma concentração apropriada. Após o ensaio de citometria de fluxo, escolha a concentração adequada de acordo com a ausência de células na área de SP fechada. NOTA: Esta é uma etapa opcional usada para definir a concentração adequada do bloqueador.</li>
	<li>Coloque os tubos em uma incubadora de 37 °C e incuba-os por 60 minutos, agitando os tubos a cada 10 minutos. NOTA: A agitação dos tubos é importante para a coloração, pois garante o contato completo entre as células e o corante para melhores resultados de coloração.</li>
	<li>Após a incubação, centrifugar as células a 200 x g, 4 °C por 5 min, e aspirar o supernasce cuidadosamente, pois as células formam pelotas muito soltas e instáveis.</li>
	<li>Células resuspend de cada tubo em 1 mL de PBS gelado suplementado com 2% de FBS e pipeta as células para cima e para baixo 3-5x para misturar completamente. Adicione 1 μL de 1 mg/mL de iodeto de propidium (PI) à suspensão de cada tubo para identificar células mortas. NOTA: Todos os procedimentos nesta etapa devem ser realizados a 4 °C para inibir o efflux de Hoechst 33342 das células tumorais. Os tubos devem ser protegidos da exposição direta à luz.</li>
</ol>3. Análise por citometria de fluxo
NOTA: As instruções de uso do software do citómetro de fluxo (ver Tabela de Materiais) estão descritas nesta seção e as Figuras Suplementares 1-10.
<ol><li>No software do citómetro de fluxo, clique no botão FOLDER. Clique no botão Experimentar e clique em Novo Experimento (Figura Suplementar 1A,B).</li>
	<li>Clique no botão OK. "Experiment_001" aparecerá na PASTA (Figura Suplementar 2A,B).</li>
	<li>Clique no botão Experiment_001 para alterar o nome da pasta para um nome específico (por exemplo, "20191118-SP"). Clique em Enter. O novo nome ("20191118-SP") aparecerá em FOLDER (Figura Suplementar 3A,B).</li>
	<li>Clique no botão Novo Espécime para adicionar um espécime à nova pasta de experimento ("20191118-SP"). Clique no botão Novo tubo para adicionar um tubo à amostra. Clique no botão Arrowhead (Figura Suplementar 4A-C).</li>
	<li>Clique no botão Parâmetros e configure os parâmetros do citômetro de fluxo(Figura Suplementar 5).<ol>
<li>Use um espelho dirómico de 610 nm de passagem curta (DMSP) para separar os comprimentos de onda de emissão. Use um filtro de 450/20 nm BP para coletar a fluorescência azul e um EFLP de 675 nm para coletar a fluorescência vermelha. NOTA: Hoechst 33342 está animado com um laser UV a 355 nm e PI está animado em 488 nm.</li>
	</ol></li>
	<li>Execute as amostras de células no citômetro de fluxo. NOTA: As células de SP podem ser classificadas por facs (células ativadas por fluorescência) em condições estéreis. Um total de 100.000-500.000 células devem ser coletadas para os experimentos de acompanhamento.<ol><li>Executar células manchadas com Hoechst 33342 no citómetro de fluxo.<ol>
<li>Coloque tubos contendo células manchadas com Hoechst 33342 no cítmetro.</li>
			<li>Clique no botão Dot Plot para exibir o gráfico de pontos e, em seguida, clique no eixo X e configure-o como " FSC-A"; clique no eixo Y e configure-o para "PI-A". Exibir o gráfico de pontos da área de pulso de dispersão dianteira (FSC-A, eixo X definido para o modo linear) versus a fluorescência PI (conjunto do eixo Y para escala logarítmica). Ajuste as tensões para mostrar as células vivas do lado direito e as células não vivas, que estão brilhantemente manchadas com PI, no canto superior esquerdo. Em seguida, estabeleça um portão de polígono para excluir células mortas e detritos celulares(Figura 1A) clicando no botão Polygon Gate para portão do subconjunto P1, também conhecido como FSC-A, subconjunto PI-A(Figura Suplementar 6A,B).</li>
			<li>Clique no botão Dot Plot para exibir o gráfico de pontos, clique no eixo X e configure-o como " FSC-A"; clique no eixo Y e configure-o para "FSC-W". Exibir o gráfico de pontos de FSC-A (eixo X) versus largura de pulso de dispersão para a frente (eixo FSC-W, Y). Clique com o botão direito do mouse no gráfico de pontos, clique no botão P1 sob o botão Mostrar populações. Clique no botão Portão Retangular para criar um portão retangular para fechar o subconjunto P2 (também conhecido como subconjunto FSC-A, FSC-W). Isso excluirá células com grandes volumes(Figura Suplementar 7A-C e Figura 1A).</li>
			<li>Clique no botão Dot Plot para exibir o gráfico de pontos, clique no eixo X e configure-o como " SSC-A"; clique no eixo Y e configure-o para "SSC-W". Exibir o gráfico de pontos da área de pulso de dispersão lateral (SSC-A, eixo X) versus largura de pulso de dispersão lateral (SSC-W, eixo Y). Clique com o botão direito do mouse no gráfico do ponto e clique no botão P2 no botão Mostrar populações. Em seguida, clique no botão Portão Retangular para criar um portão retangular para fechar o subconjunto P3 (também conhecido como subconjunto SSC-A, SSC-W). Isso obterá uma população celular com granularidade uniforme (Figura Suplementar 8A-C e Figura 1A).</li>
			<li>Clique no botão Dot Plot para exibir o gráfico de pontos, clique no eixo X e configure-o como " Hoechst Red-A"; clique no eixo Y e configurá-lo para "Hoechst Blue-A". Exibir o gráfico de pontos de Hoechst Red-A (eixo X) contra Hoechst Blue-A (eixo Y). Clique com o botão direito do mouse no gráfico de pontos, clique no botão P3 sob o botão Mostrar populações. Clique no botão Polygon Gate para criar um portão de polígono para fechar o subconjunto P4 (também conhecido como subconjunto Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A). Clique com o botão direito do mouse no gráfico de pontos, clique no botão Mostrar hierarquia populacional para mostrar a hierarquia populacional. NOTA: O gráfico de pontos mostrará três populações diferentes: 1) uma população de fase G0-G1 perto do centro do gráfico; 2) uma população de fase S-G2/M perto do canto superior direito; 3) o SP. Em seguida, o SP é fechado para análise posterior (Figura Suplementar 9A-D e Figura 1A). Se o gráfico de pontos de Hoechst Red-A versus Hoechst Blue-A não mostrar um perfil de SP semelhante ao mostrado na Figura 1A,as tensões devem ser ajustadas até que um perfil semelhante seja visto. Enquanto isso, ajuste todos os portões acima de acordo.</li>
			<li>Após determinar a região do portão das células sp, clique em Adquirir Dados para coletar 20.000-100.000 eventos de cada amostra para analisar o percentual de células de SP ( FiguraSuplementar 10).</li>
		</ol></li>
		<li>Execute as células manchadas de Hoechst 33342 tratadas com bloqueador no citômetro de fluxo.<ol>
<li>Coloque tubos contendo bloqueador no cítômetro e execute células usando as mesmas tensões e portões para verificar se as tensões e portões estão selecionados adequadamente. NOTA: Em comparação apenas com a mancha hoechst 33342, apenas uma proporção muito pequena de células, se houver, deve aparecer na área fechada da SP (Figura 1B).</li>
			<li>Colete 20.000-100.000 eventos de cada amostra para analisar a porcentagem de células de SP.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>4. Análise de dados
NOTA: As instruções para o uso do software de análise de citometria de fluxo (ver Tabela de Materiais) estão descritas nesta seção e as Figuras Suplementares 11–16.
<ol><li>Copie os arquivos em formato fcs para um computador, abra o software de análise de citometria de fluxo e arraste um arquivo de amostra para o software (Figura Suplementar 11A,B).
</li>
	<li>Células de portão e obter a porcentagem de células de SP.<ol>
<li>Clique duas vezes neste arquivo de amostra,clique no eixo X e configure-o como "FSC-A"; clique no eixo Y e configure-o para "PI-A". Em seguida, crie um portão de polígono e clique no botão OK para obter o subconjunto FSC-A, PI-A(Figura Suplementar 12A-E).</li>
		<li>Clique duas vezes no arquivo do subconjunto FSC-A, PI-A,clique no eixo X e configure-o como "FSC-A"; clique no eixo Y e configure-o para "FSC-W". Em seguida, crie um portão retangular e clique no botão OK para obter o subconjunto FSC-A, FSC-W(Figura Suplementar 13A-E).</li>
		<li>Clique duas vezes no arquivo do subconjunto FSC-A, FSC-W,clique no eixo X e configure-o como "SSC-A"; clique no eixo Y e configure-o para "SSC-W". Em seguida, crie um portão retangular e clique no botão OK para obter o subconjunto SSC-A, SSC-W(Figura Suplementar 14A-E).</li>
		<li>Clique duas vezes no arquivo subconjunto SSC-A, SSC-W,clique no eixo X e configure-o como "Hoechst Red-A"; clique no eixo Y e configurá-lo para "Hoechst Blue-A". Em seguida, crie um portão de polígono e clique no botão OK para obter o subconjunto Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A(Figura Suplementar 15A-E).</li>
		<li>Abra o Editor de layout clicando no botão Editor de layout aberto. Arraste o arquivo subconjunto SSC-A, SSC-W para o Editor de Layout e clique na janela Clique para salvar o botão de arquivo de layout para salvar os resultados da imagem ( FiguraSuplementar 16A-C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Salve o espaço de trabalho para manter as informações de gating ao fechar o software.</li>
	<li>Realizar análises de teste t com software de análise estatística para comparar a diferença entre dois grupos. Foi definido um valor de P < 0,05 como estatisticamente significante.</li>
</ol>

<ol><li>Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%2C+cancer%2C+and+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem cells, cancer, and cancer stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).</li>
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<li>Hirschmann-Jax, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+%22side+population%22+of+cells+with+high+drug+efflux+capacity+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Existem vários pontos-chave a serem mente para o ensaio de SP. A primeira é a seleção de um bloqueador adequado, como Verapamil ou Reserpine, para cada linha celular, pois a localização do "portão" das células sp é determinada de acordo com a posição em que um grande número de células de SP desaparece após a adição do bloqueador. Para a linha de células MDA-MB-231, a Reserpine funciona bem. No entanto, para outras linhas de celular, diferentes bloqueadores podem funcionar melhor.
A segunda é a...

As células-tronco cancerígenas (CSCs) são subconjuntos de células com capacidade de autoconexão e potencial de diferenciação múltipla, que desempenham um papel vital no crescimento do tumor, metástase e recidiva1,2. Atualmente, os CSCs têm sido identificados para existir em uma variedade de tumores malignos, incluindo câncer de pulmão, cérebro, pâncreas, próstata, mama e fígado3,4,5,6,7,8,9. A identificação de CSCs nesses tumores baseia-se principalmente na presença de proteínas de marcadores superficiais, como alta e/ou baixa expressão de CD44, CD24, CD133 e Sca-19,10, mas um marcador único que pode distinguir CSCs de não-CSCs não foi relatado até agora. Atualmente, várias técnicas são utilizadas para identificar e purificar CSCs em tecido tumoral ou linhas de células tumorais. Essas técnicas são projetadas com base nas propriedades específicas dos CSCs. Entre eles, ensaios e triagem de células da população lateral (SP) são dois dos métodos comumente utilizados.
As células-tronco de SP foram originalmente descobertas por Goodell et al.11, quando caracterizaram células-tronco hematopoiéticas em células de medula óssea do rato. Quando as células de medula óssea do rato foram rotuladas com o corante fluorescente Hoechst 33342, um pequeno grupo de células mal manchadas hoechst 33342 apareceu no gráfico de pontos bidimensionais de um ensaio de citometria de fluxo. Hoechst 33342 é um corante de ligação de DNA e tem pelo menos dois modos de ligação que levam a diferentes características espectrais. Ao visualizar a emissão de fluorescência em dois comprimentos de onda ao mesmo tempo, várias populações podem ser reveladas12. Em seu ensaio, o Hoechst 33342 estava animado a 350 nm e a fluorescência foi medida usando o filtro de banda-pass (BP) de 450/20 nm e o filtro de borda de 675 nm de passagem longa (EFLP)11. Comparado com toda a população de células de medula óssea, esse grupo de células foi enriquecido com células-tronco hematopoiéticas chamadas células-tronco de SP11. As células SP são capazes de expulsar rapidamente Hoechst 33342. O efflux deste corante está relacionado aos transportadores de de ligação ATP (ABC)13, que podem ser inibidos por alguns agentes como Fumitremorgin C14, Verapamil e Reserpine15,16. Depois disso, diferentes proporções de células de SP foram detectadas em uma variedade de tecidos, órgãos, tecidos tumorais e linhas de células tumorais17,18,19. Essas células de SP têm muitas características das células-tronco17,19.
Este manuscrito descreve a rotulagem e coloração de células tumorais cultivadas hoechst 33342 e a análise de células de SP por citometria de fluxo. Além disso, a otimização da concentração de Hoechst 33342 e a seleção adequada do bloqueador para uma linha celular tumoral específica usando esta abordagem são mostradas. Finalmente, os efeitos da promoção da haste ou sinais de inibição na proporção de SP nas células tumorais são demonstrados. Os exemplos experimentais demonstram que a análise de SP pode ser usada para explorar os efeitos de vários sinais, como expressão genética, pequenos inibidores, ativadores, citocinas e quimioterapias, sobre a haste tumoral. Comparado a outros métodos de isolamento e purificação de CSCs, como a classificação de CD44+/CD24– população, análise de aldeído desidrogenase (ALDH) e ensaios de formação da esfera tumoral, este método é mais fácil de manipular e é econômico.

<table><tbody><tr><td>Placa de cultura de células de 6 poços</td><td>CORNING</td><td>3516</td><td>9,5 cm2 (aprox.)</td></tr><tr><td>Colivelin</td><td>MCE</td><td>HY-P1061A</td><td>Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Indústrias Biológicas (BIOIND)</td><td>04-001-1ACS</td><td></td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>BD LSRFortessa</td></tr><tr><td>Software de citômetro de fluxo</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>FACSDiva</td></tr><tr><td>Software de análise de citometria de fluxo</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>FlowJo</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>bisBenzimida H 33342 tricloridrato</td></tr><tr><td>Tubo de ensaio de fundo redondo de poliestireno</td><td>CORNING</td><td>352054</td><td>12 x 75 mm, 5 mL</td></tr><tr><td>Propídio iodeto (PI)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>3,8-Diamino-5- [3- (dietilmetilamônio) propil] -6-fenilfenantridínio diiodeto</td></tr><tr><td>Reserpina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83580</td> <td>(3 &beta;, 16 &beta;, 17 &alfa;, 18 &beta;, 20 &alfa;)-11,17-Dimetoxi-18-[(3,4,5-trimetoxibenzoil)oxi]ioimbano-16-ácido carboxílico éster metílico</td></tr><tr><td>SKLB816</td><td>Fornecido pelo Dr. Shengyong Yang, Universidade</td><td></td><td></td>de Sichuan</tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>cloridrato de Verapamil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td>5-[N-(3,4-Dimetoxifeniletil)metilamino]
Cloridrato de -2-(3,4-dimetoxifenil)-2-isopropilvaleronitrila</td></tr></tbody></table>

análise da população lateral em linhas celulares tumorais sólidas

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

As células-tronco cancerígenas (CSCs) são uma importante causa de crescimento tumoral, metástase e recidiva. O isolamento e identificação dos CSCs são de grande importância para a pesquisa de tumores. Atualmente, diversas técnicas são utilizadas para a identificação e purificação de CSCs a partir de tecidos tumorais e linhas de células tumorais. A separação e análise das células da população lateral (SP) são dois dos métodos comumente utilizados. Os métodos dependem da capacidade dos CSCs de expulsar rapidamente corantes fluorescentes, como hoechst 33342. O efflux do corante está associado aos transportadores de de ligação ATP (ABC) e pode ser inibido pelos inibidores do transporte ABC. Métodos para coloração de células tumorais cultivadas com Hoechst 33342 e análise da proporção de suas células de SP por citometria de fluxo são descritos. Este ensaio é conveniente, rápido e econômico. Os dados gerados neste ensaio podem contribuir para uma melhor compreensão do efeito dos genes ou outros sinais extracelulares e intracelulares nas propriedades de tronco das células tumorais.

Foram realizadas quatro análises experimentais de SP de acordo com esse método. No primeiro, detectamos a proporção de células de SP no MDA-MB-231, que é uma linha tripla negativa de células cancerígenas de mama humana, em condições normais. Após a contagem celular, Hoechst 33342 foi adicionado em um tubo contendo 1 x 106 células a uma concentração final de 3 μg/mL. Reserpine e Hoechst 33342 foram adicionados a outro tubo para concentrações finais de 40 μM e 3 μg/mL, respectivamente. Pi foi adicionado a ambos ...

Um método conveniente, rápido e econômico para medir a proporção de células da população lateral em linhas de células tumorais sólidas é apresentado.

Análise da população lateral em linhas celulares tumorais sólidas

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

A análise de células populacionais laterais é um dos métodos comumente utilizados para isolar e identificar células-tronco cancerígenas de tecidos tumorais e linhas de células tumorais. Este ensaio é conveniente, rápido e econômico. Este método pode contribuir para uma melhor compreensão do efeito de genes ou outros sinais extracelulares e intracelulares sobre as propriedades de tronco das células tumorais.Muitos fatores podem influenciar o percentual de células de SP nesta análise, por isso é fundamental explorar as condições adequadas antes do experimento formal. Células tumorais de sementes em uma placa de seis poços, e incubar-as em uma incubadora Celsius de 37 graus fornecida com 5% de dióxido de carbono. Quando a densidade celular atinge cerca de 90% aspirar o meio de cultura, e lavar as células duas vezes com três mililitros de PBS.Em seguida, adicione 500 microliters de 0,25% trypsin-EDTA a cada poço, e incubar a placa a 37 graus Celsius por um a três minutos. Bata suavemente na placa para desprender as células, adicione três mililitros de PBS suplementados com 2% de FBS em cada poço, e pipete as células para cima e para baixo três a cinco vezes para dispersar os aglomerados celulares. Examine a suspensão da célula sob o microscópio.Se houver aglomerados de células, passe a suspensão através de um filtro de 70 micrômetros. Transfira as células para um tubo de centrífuga de 15 mililitros e centrifuá-las a 200 vezes g por cinco minutos. Remova o supernasce, e resuspense as células em três mililitros de PBS suplementados com 2%FBS, esbofiando as células para cima e para baixo três a cinco vezes para misturar.Conte células sob o microscópio usando um hemótmetro, e dilui-as em PBS complementadas com 2%FPS para uma concentração final de uma vez 10 para as seis células por mililitro. Prepare dois cinco mililitros, poliestireno, tubos de teste de fundo redondo, e adicione um mililitro da suspensão celular a cada tubo. Rotule um tubo como tubo de ensaio e o outro como um tubo de controle bloqueador.Prepare uma solução de bloqueador diluindo-a à concentração apropriada. Adicione-o ao tubo de controle do bloqueador e misture bem, depois incubar o tubo a 37 graus Celsius por 30 minutos. Agite o tubo a cada 10 minutos.Prepare uma solução de Hoechst 33342 diluindo-a para a concentração apropriada. Adicione-o ao tubo de ensaio e ao tubo de controle bloqueador separadamente e misture bem, em seguida, incubar os tubos a 37 graus Celsius por 60 minutos. Agite os tubos a cada 10 minutos.Após a incubação, centrifugar as células por cinco minutos a 200 vezes g e quatro graus Celsius, em seguida, aspirar cuidadosamente o supernante. Resuspend as células em cada tubo com um mililitro de PBS gelado suplementado com 2%FBS, em seguida, pipeta as células para cima e para baixo para misturar. Adicione um microliter de iodeto de propídio de um mililículo por mililitro, ou PI, a cada tubo e misture.Clique na guia Parâmetros no software do citômetro de fluxo. Primeiro, escolha os parâmetros de FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red e PI, respectivamente. Em segundo lugar, escolha a escala logarítmica para o parâmetro PI.Finalmente, escolha escalas de área e largura para os parâmetros FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red e PI, respectivamente. Execute as células do tubo de ensaio primeiro, em seguida, execute as células do tubo de controle bloqueador usando as mesmas tensões e portões. Coletar de 20 a 100.000 eventos de cada amostra para analisar o percentual de células de SP.Este método foi utilizado para detectar a proporção de células de SP na linha de células cancerígenas de mama humana MDA-MB-231. O gráfico de pontos de FSC-A versus PI-A mostrou uma população de células mortas, detritos celulares e a população principal de células negativas do PI, que foi submetida a análises posteriores. Uma única população celular fechada a partir do gráfico de pontos de FSC-A versus FSC-W e o gráfico de pontos de SSC-A versus SSC-W foi usado para analisar a proporção de células de SP, que foi de cerca de 0,9% em células não tratadas e cerca de 0,09% em células tratadas com reserpina.Diferentes concentrações de coloração de Hoechst 33342 foram testadas em células MDA-MB-435, e foi determinado que dois microgramas por mililitro foram ideais para análise de SP. Baixas concentrações dificultaram a distinção das células de SP de outras populações, enquanto altas concentrações fizeram com que as células de SP desaparecessem. Verapamil e reserpine foram testados para determinar o bloqueador adequado para as células MDA-MB-435.Cerca de 0,4% das células expeliram o corante após o tratamento de verapamil, mas a proporção caiu para cerca de 0,1% após o tratamento de reserpine, demonstrando que a reserpina é um bloqueador mais adequado para esta linha celular. Este protocolo também foi utilizado para determinar a proporção de células de SP em células de adenocarcinoma pulmonar humano A549 tratadas com colivelina ativadora STAT3 e em células cancerígenas de mama humanas T47D tratadas com inibidor FRA1 SKLB816. Este ensaio fornece pistas para o efeito regulatório da sinalização de caminhos sobre as características das células-tronco do câncer e facilita a descoberta de novos mecanismos, que podem, em última análise, orientar a terapia-alvo dos tumores.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

O protocolo a seguir descreve um método para isolar a população lateral de células T de células T A população secundária carece de marcadores celulares proeminentes e, portanto, usamos o ensaio de efluxo de corante Hoechst 33342 para isolá-los.

Ensaio de População Lateral: Um Método para Isolar a População Lateral de Células Tumorais de Peixe-Zebra

Neste vídeo, descrevemos o isolamento de uma subpopulação de células-tronco cancerígenas de linhagens celulares de carcinoma escamoso de cabeça e pescoço usando classificador de células ativadas por fluorescência ou FACS. A população lateral isolada de células pode ser usada para análises posteriores a jusante.

Ensaio de discriminação da população do lado do câncer: um método para isolar células-tronco cancerígenas usando o ensaio de efluxo de corante Hoechst

Análises aprofundadas de proteomas de células cancerígenas facilitam a identificação de novos alvos de drogas e biomarcadores diagnósticos. Descrevemos um fluxo de trabalho experimental para análise quantitativa de (fosfo-)proteomas em subpopulações de células cancerígenas derivadas de tumores líquidos e sólidos. Isso é conseguido combinando estratégias de enriquecimento celular com espectrometria de massa quantitativa baseada em Super-SILAC.

Quantitative Mass Spectrometric Profiling de proteomas de células do cancro da derivadas do líquido e tumores sólidos

Compreender o papel das células-tronco cancerígenas na recorrência tumoral e na resistência às terapias tornou-se um tópico de grande interesse na última década. Este artigo descreve o isolamento e a caracterização da subpopulação de células-tronco cancerígenas de linhagens celulares de carcinoma escamoso de cabeça e pescoço (CECP).

Isolamento e Caracterização de uma cabeça e pescoço carcinoma espinocelular subpopulação Tendo-tronco características celulares

Métodos que permitem a caracterização e isolamento de populações de células estaminais a partir de amostras biológicas são fundamentais para o avanço de células-tronco-alvo tratamentos em câncer e além. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento de células estaminais do câncer usando o fenótipo de população lateral desencadeada por corante.

Aprovação do DNA Dye-desencadeada fenótipo de população lateral para detectar e purificar células-tronco de câncer de amostras biológicas

Aqui, descrevemos uma técnica para isolar as células de população lateral de um modelo zebrafish de leucemia linfoblástica aguda induzida por myc-T (T-ALL). Este ensaio de população lateral é altamente sensível e é descrito para T-ALL de peixe-zebra, mas pode ser aplicável a outros tipos de células zebrafish malignas e não malignas.

De células T isolamento da população Side em Myc induzida por leucemia linfoblástica aguda no peixe-zebra

Desenvolvemos um novo protocolo para estudar a dinâmica da população heterocelular em resposta a perturbações. Este manuscrito descreve uma plataforma baseada em imagens que produz conjuntos de dados quantitativos para a caracterização simultânea de múltiplos fenótipos celulares de populações heterocelulares de maneira robusta.

Discriminação e Caracterização de Populações Heterocelulares Usando Técnicas de Imagem Quantitativa

Aqui nós descrevemos um método para separar e enriquecer os componentes do microambiente de imune e não imune a tumor em tumores subcutâneos estabelecidas. Esta técnica permite a análise separada de infiltrar imune tumor e frações não imune tumor que podem permitir a caracterização abrangente do microambiente imune do tumor.

Enriquecimento e caracterização do microambiente que imune e não imune Tumor em tumores murino subcutâneos estabelecidas

A caracterização de células tumorais circulantes (CTCs) é um tema popular na pesquisa translacional. Este protocolo descreve um ensaio semiautomático da imunofluorescência (se) para a caracterização do PD-L1 e a enumeração dos CTCs em amostras pacientes do cancro do pulmão da não-pequena pilha (NSCLC).

Caracterização e enumeração semiautomáticas de PD-L1 de células tumorais circulantes de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas por imunofluorescência

A abordagem apresentada avalia simultaneamente a invasão de células cancerígenas em ensaios esferoides 3D e citotoxicidade de células T. Esferoides são gerados em um elenco multi-microwell livre de andaimes. A cocultura e a incorporação na matriz de colágeno tipo I são realizadas dentro do mesmo dispositivo que permite monitorar a invasão de células cancerígenas e a citotoxicidade mediada por células T.

Monitoramento da invasão celular cancerígena e citotoxicidade de células T na cultura 3D

Aqui, mostramos que os lasers de alta potência de 375 nm e 405 nm podem efetivamente excitar o Hoechst 33342 e servir como uma alternativa viável ao laser de 355 nm para detecção de células da população lateral (SP), expandindo assim a gama de lasers disponíveis em aplicações de citometria de fluxo.

Detecção eficaz de células da população do lado de Hoechst por citometria de fluxo

Aprenda a analisar a população lateral em linhas celulares tumorais sólidas para identificar células-tronco cancerígenas. Este método rápido e econômico auxilia no estudo das propriedades de stemness e na compreensão da biologia tumoral.

Análise da população lateral em linhas celulares tumorais sólidas

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