Name: Preparação do Cromossomo Meioético Se espalha de espermatocitocitos de zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Aprenda a preparar espalhamentos de cromossomos meióticos de espermatócitos de zebrafish. Este protocolo de espalhamento de superfície nuclear permite visualizar a arquitetura cromossômica durante a prófase I usando microscopia de superresolução.

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Agradecemos a Trent Newman e Masuda Sharifi por comentários sobre o manuscrito e An Nguyen por ajudarem a otimizar métodos para espalhar e manchar cromossomos de meiocitos de zebrafish. Este trabalho foi apoiado pelo NIH R01 GM079115 concedido à S.M.B.

<ol><li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+aneuploidy%3A+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).</li>
<li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination%2C+Pairing%2C+and+Synapsis+of+Homologs+during+Meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).</li>
<li>Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+telomere+bouquet+is+a+hub+where+meiotic+double-strand+breaks%2C+synapsis%2C+and+stable+homolog+juxtaposition+are+coordinated+in+the+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio.</a> PLoS Genetics. 15, e1007730(2019).</li>
<li>Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+distribution+pattern+and+synapsis+initiation+during+spermatogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).</li>
<li>Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+progression+of+recombination+in+human+males%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Temporal progression of recombination in human males.</a> Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).</li>
<li>Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytological+studies+of+human+meiosis%3A+sex-specific+differences+in+recombination+originate+at%2C+or+prior+to%2C+establishment+of+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks.</a> PLoS One. 8, e85075(2013).</li>
<li>Pratto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination+initiation+maps+of+individual+human+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recombination initiation maps of individual human genomes.</a> Science. 346, 1256442(2014).</li>
<li>Brown, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+synapsis+proceeds+from+a+limited+number+of+subtelomeric+sites+in+the+human+male%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male.</a> American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).</li>
<li>Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+cell+aneuploidy+in+zebrafish+with+mutations+in+the+mitotic+checkpoint+gene+mps1%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1.</a> Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).</li>
<li>Saito, K., Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+cytogenetic+characterization+of+zebrafish+meiotic+prophase+I+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants.</a> Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).</li>
<li>Sansam, C. L., Pezza, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connecting+by+breaking+and+repairing%3A+mechanisms+of+DNA+strand+exchange+in+meiotic+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Febs+Journal%22%5BJournal%5D)">Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination.</a> Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).</li>
<li>Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mlh1+Deficiency+in+Zebrafish+Results+in+Male+Sterility+and+Aneuploid+as+Well+as+Triploid+Progeny+in+Females%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females.</a> Genetics. 175, 1561-1569 (2007).</li>
<li>Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Meiotic+Chromosome+Spreads+from+Mouse+Spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e55378(2017).</li>
<li>Moens, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+chiasmata+and+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Genome%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: chiasmata and interference.</a> Genome. 49, 205-208 (2006).</li>
<li>Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+chromosome+synapsis+and+recombination+in+male+guppies%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies.</a> Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).</li>
<li>Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH+and+DAPI+staining+of+the+synaptonemal+complex+of+the+Nile+tilapia+%28Oreochromis+niloticus%29+allow+orientation+of+the+unpaired+region+of+bivalent+1+observed+during+early+pachytene%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%22%5BJournal%5D)">FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene.</a> Chromosome Research. 17 (6), 773(2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui descrevemos métodos para sondar a localização de telômeros e proteínas associadas ao cromossomo na superfície nuclear se espalha de espermatocitoses isolados de testículos de zebrafish. Esperamos que esses métodos sejam aplicáveis para análise de espermatocitocitos em outras espécies teleast com ajuste ao tamanho dos testículos.
Embora apenas alguns anticorpos tenham sido elevados para proteínas meioticas de zebrafish, tivemos sucesso usando os seguintes anticorpos levantados para proteín...

A reprodução sexual prossegue através da combinação de dois gametes haploides, cada um carregando metade do complemento cromossomo de uma célula somática. Meiosis é uma divisão de células especializadas que produz gametas haploides através de uma rodada de replicação de DNA e duas rodadas sucessivas de segregação de cromossomos. Na profase I, os cromossomos homônimos (homologs) devem passar por pareamento, recombinação e sinapse, sendo este último caracterizado pela formação do complexo sinaponômico que compreende dois eixos homolog a ponteados pelo filaverso transversal, Sycp1(Figura 1A,B). A não execução desses processos pode levar à produção de gametes aneuploides, que são uma das principais causas de abortos em humanos1. Nosso conhecimento da coordenação entre emparelhamento, recombinação e sinapse tem sido facilitado por estudos em uma ampla gama de organismos, como levedura, C. elegans,rato e Drosophila,entre outros2. Embora o processo geral de emparelhamento cromossomo homônimo seguido de segregação seja bem conservado, sua dependência da recombinação e sinopse e da ordem desses eventos varia.
A formação de quebra de fio duplo meiotic (DSB), que inicia a recombinação homóloga, ocorre perto de telômeros agrupados no buquê durante leptotene e a sinopse segue logo após3,4. Essa configuração de formação dsb e iniciação de sinapse também é uma característica da meiose masculina em humanos, mas não no rato5,6,7,8,sugerindo que os zebrafish podem servir de modelo para a spermatogênese humana. Há também várias vantagens práticas de estudar a meio-peixe-zebra. Machos e fêmeas passam por gametogênese durante toda a idade adulta, suas gônadas são facilmente acessíveis, e centenas de descendentes são gerados a partir de uma única cruz. Além disso, os embriões são transparentes e se desenvolvem externamente, o que facilita a detecção precoce de aberrações em desenvolvimento embrionário devido aos gametes aneuploides3,9. As desvantagens do uso de zebrafish são de que eles são lentos para atingir a maturidade sexual (~60 dias) e a quantidade de material necessário para propagações de superfície nuclear deve ser coletada de ~10-20 animais adultos, dependendo de seu tamanho.
Os preparativos de disseminação do cromossomo meioético são uma ferramenta vital para estudar dinâmicas cromossãs em todos os organismos modelo, uma vez que as principais assinaturas da dinâmica do cromossomo meioético podem ser sondadas. Em zebrafish, aspectos-chave da progressão do programa de meiotética e organização nuclear foram dissecados através da sondagem de superfícienuclear espalhadas, referidas aqui como spreads cromossomos, com anticorpos para detecção de proteínas e/ou ácidos nucleicos pelo PEIXE3,4,9,10,11. De fato, a localização polarizada de telômeros agrupados no buquê pode ser preservada na preparação de spread(Figura 1C). Recentemente, usamos cromossomo de espermatoósico de zebrafish, se espalha junto com métodos de detecção de fluorescência e microscopia de superresolução para elucidar a progressão detalhada da dinâmica do telômero de zebrafish, emparelhamento de cromossomo homólogo, localização de quebra de fio duplo e sinopse nas principais transições meioticas3. Aqui apresentamos métodos para preparar spreads cromossomos de espermatocitocitos dos testículos de zebrafish e, posteriormente, manchá-los com sondas de ácido nuclecítico de peptídeo fluorescente (PNA) a repetidas sequências de telômero e detecção de imunofluorescência de proteínas associadas ao cromossomo.

<table><tbody><tr><td>Tubos de centrífuga de 1,5 mL Várias</td><td>marcas comerciais disponíveis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suporte para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Várias marcas comerciais disponíveis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% de formaldeído, sem metanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>2 mL</td><td>Várias marcas comerciais disponíveis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 x 50 mm lamínulas de vidro</td><td>Corning</td><td>2980-245</td><td></td></tr><tr>Tubos <td></td><td>de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>centrífuga cónicos de 50 mL</td> Saco de autoclave <td>ThermoFisher Scientific</td><td>363696</td><td></td></tr><tr><td>Várias</td><td>marcas comerciais disponíveis</td><td></td><td>Utilizado para fazer lamínulas de plástico.</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1605-100</td><td>Prepare uma solução estoque de 100 mg / ml em água destilada estéril.</td></tr><tr><td>Filtro de Células, 100 &micro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>CF405M cabra anti-frango IgY (H+L),</td><td>Biotium</td><td>203775-500uL</td> altamente adsorvido <td>Uso a 1:1000</td></tr><tr><td>Frango anti-zfSycp1</td><td>Gerado pelo laboratório Burgess</td><td>N/A</td><td>Uso a 1:100</td></tr><tr><td>Colagenase de Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Frasco Coplin</td><td>Vários marcas comerciais disponíveis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNase I, grau II do pâncreas bovino</td><td>Roche Diagnostics</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10014CV</td><td></td></tr><tr><td>Dumont No. 5 Forceps Fine</td><td>Science Tools</td><td>11252-30</td><td>São necessários dois para dissecar os testículos.</td></tr><tr><td>Eppendorf Tubes, 5 mL</td><td>VWR International</td><td>89429-308</td><td></td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP228-100</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-frango IgY (H+L) de cabra, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11039</td><td>Use a 1:1000</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário IgY (H+L) anticorpo secundário IgY anti-frango de cabra, Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11042</td><td>Use a 1:1000</td></tr><tr><td>Cabra anti-hDMC1</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8973</td><td>Não funciona em nossas mãos</td></tr><tr><td>Cabra anti-coelho IgG (H+L) anticorpo secundário de adsorção cruzada, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11008</td><td>Use a 1:1000</td></tr><tr><td>Cabra anti-coelho IgG (H+L) anticorpo secundário de admissão cruzada, Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11012</td><td>Use a 1:1000</td></tr><tr><td>Soro</td> <td>de cabraSigma-Aldrich</td><td>G9023-10mL</td><td></td></tr><tr><td>Sal de heparina sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393-100KU</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de umidade</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-112-3683</td><td></td></tr><tr><td>Forno de hibridização</td><td>VWR International</td><td>230401V (Modelo 5420)</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora Agitador</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Model Classic C25</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimerbly-Clark Professional</td><td>34155</td><td>Usado para a câmara</td></tr><tr><td>de umidade KH2PO4</td><td>Microscópio Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Várias marcas comerciais disponíveis</td><td></td><td>Qualquer microscópio padrão capaz de pelo menos ~1.65X de ampliação é suficiente.</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-hamsterSCP3</td><td>Abcam</td><td>ab97672</td><td>Não funciona em nossas mãos</td></tr><tr><td>Mouse anti-hMLH1</td><td>BD Biosciences</td><td>550838</td><td>Não funciona em nossas mãos</td></tr><tr><td>Mouse anti-hRPA</td><td>Sigma-Alrich</td><td>MABE285</td><td>Não funciona em nossas mãos</td></tr><tr><td>Na2HPO4 &middot; 7 H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Photo-Flo 200 solução</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>74257</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferência de plástico</td><td>Várias marcas comerciais disponíveis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PNA TelC-Alexa647</td><td>PNA Bio Inc</td><td>F1013</td><td>Prepare conforme o fabricante' s instruções.</td></tr><tr><td>PNA TelC-Cy3</td><td>PNA Bio Inc</td><td>F1002</td><td>Prepare de acordo com as instruções do fabricante.</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36970</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant com DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36971</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-hRPA</td><td>Bethyl</td><td>A300-244A</td><td>Use a 1:300</td></tr><tr><td>Rabbit anti-hSCP3</td><td>Abcam</td><td>ab150292</td><td>Use a 1:200</td></tr><tr><td>Rabbit anti-hRad51</td><td>GeneTex</td><td>GTX100469</td><td>Use em 1:300</td></tr><tr><td>Citrato de Sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>Supercut Tesoura, ângulo de 30&deg;, 10 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-822-353</td><td>Também pode usar qualquer tesoura pequena.</td></tr><tr><td>Kit Sylgard</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9897184</td><td>Prepare de acordo com as instruções do fabricante.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td>Dilua em água destilada estéril para fazer uma solução de trabalho a 20%. Armazene em temperatura ambiente. O Triton X-100 forma um precipitado quando diluído em água; O precipitado se dissolve durante a noite.</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Worthington</td><td>Bioquímica LS003708</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de tripsina da clara de ovo de galinha</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9253-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6531</td><td>Diluir em água destilada estéril para fazer uma solução de trabalho a 20%. Armazene em temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Tesoura de Mola Vannas - 4 mm (micro tesoura)</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>15018-10</td><td></td></tr></tbody></table>

preparação do cromossomo meioético se espalha de espermatocitocitos de zebrafish

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

A meiose é o processo celular-chave necessário para criar gametes haploides para reprodução sexual. Os organismos modelo têm sido fundamentais para entender os eventos cromossomos que ocorrem durante a profase do meioético, incluindo a combinação, a sinapse e eventos de recombinação que garantem a segregação adequada do cromossomo. Embora o mouse tenha sido um modelo importante para entender os mecanismos moleculares subjacentes a esses processos, nem todos os eventos meioticéticos neste sistema são análogos à meiose humana. Recentemente demonstramos o potencial excitante do zebrafish como um modelo de espermatogênese humana. Aqui descrevemos, em detalhes, nossos métodos para visualizar cromossomos meioóticos e proteínas associadas em preparações de propagação de cromossomos. Esses preparativos têm a vantagem de permitir a análise de alta resolução das estruturas cromossais. Primeiro, descrevemos o procedimento de dissecação de testículos de zebrafish adultos, seguido de dissociação celular, lise e disseminação dos cromossomos. Em seguida, descrevemos o procedimento para detectar a localização de proteínas cromossomos mestióticas, por detecção de imunofluorescência, e sequências de ácido nucleico, por fluorescência na hibridização situ (FISH). Essas técnicas compreendem um conjunto útil de ferramentas para a análise citológica da arquitetura de cromatina meiotic no sistema de zebrafish. Pesquisadores da comunidade de zebrafish devem ser capazes de dominar rapidamente essas técnicas e incorporá-las em suas análises padrão da função reprodutiva.

Traçamos um método para preparar a disseminação de espermatocitos de zebrafish. Quando realizado corretamente, nosso procedimento rende núcleos bem espalhados, não sobrepostos. Para recuperar tais núcleos, é importante ter a quantidade adequada de material inicial (ou seja, testículos), tratar testículos por tempo suficiente na trippsina e um número adequado de tratamentos de DNase I. Esses spreads podem então ser manchados para telômeros e proteínas mestióticas para estudar a progressão ...

Os spreads de superfície nuclear são uma ferramenta indispensável para estudar eventos cromossomos durante a meiose. Aqui demonstramos um método para preparar e visualizar cromossomos meioóticos durante a profase I de espermatotatocitos de zebrafish.

Preparação do Cromossomo Meioético Se espalha de espermatocitocitos de zebrafish

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

O zebrafish está emergindo como um excelente modelo de vertebrado para estudar os eventos cromossômicos da meiose, incluindo pareamento de cromossomos homólogos, sinápsia e recombinação. Este protocolo de expansão da superfície nuclear nos permitiu visualizar características-chave da arquitetura cromossomo meiotic usando microscopia de super resolução. Os pesquisadores podem esperar centenas de núcleos bem espalhados por deslizamento com menos detritos do que outros protocolos de propagação de zebrafish.A parte mais desafiadora tecnicamente deste procedimento é a dissecação dos testículos de zebrafish, pois está próximo da pele e também está ligado a outros órgãos. Visualizar o procedimento de dissecção permitirá que os pesquisadores saibam o que esperar quando virem a gônada embutida no tecido do animal. Depois de eutanásia de zebrafish macho, decapitar um peixe de cada vez com uma tesoura pequena e, em seguida, usar micro tesouras para cortar ao longo da linha média ventral para expor a cavidade corporal.Coloque o peixe em uma placa de Petri revestida de silicone e cubra por uma piscina rasa de 1X PBS. Sob um microscópio a ampliação de 1,65X, disseco os testículos usando fórceps.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Este é um método para a geração de embriões diplóides gynogenetic zebrafish (embriões cuja única contribuição genética vem da mãe), bloqueando a segunda divisão meiótica imediatamente após a fertilização com esperma de luz ultravioleta inativado. EP embriões não são totalmente homozigótica devido à recombinação durante a primeira divisão meiótica, porém eles são homozigotos em todos os loci que não foram separadas de suas centrômero por recombinação.

Fazendo Zebrafish Diplóide Gynogenetic por pressão inicial

Um protocolo é descrito para a preparação de espalhamentos cromossômicos mitóticos de alta qualidade por um método de gota rápida e seca ao ar adequado para a detecção de FISH de sondas de DNA de cópia única e alta.

Um cromossomo Dropping Ar seco rápido Método de Preparação Adequado para FISH em plantas

A mitose é crítica para todos os organismos vivos e os defeitos geralmente levam ao câncer e distúrbios do desenvolvimento. Usando este protocolo de imagem e o peixe-zebra como sistema modelo, os pesquisadores podem visualizar a mitose em um organismo vertebrado vivo e a infinidade de defeitos que surgem quando os processos mitóticos são defeituosos.

Observando mitótico Division e Dinâmica em um embrião de peixe-zebra ao vivo

Um protocolo modificado para a manipulação ploidy usa um choque de calor para induzir uma tenda de um ciclo na citocinese no embrião. Este protocolo é demonstrado no peixe-zebra, mas podem ser aplicados a outras espécies.

Manipulação de ploidia de embriões Zebrafish com choque térmico 2 Tratamento

Meiose é o processo de desenvolvimento pelo qual gâmetas são formadas através de uma única rodada de replicação de DNA e duas rodadas sucessivas de segregação do cromossomo. Mamíferos meiose pode ser examinado, utilizando uma técnica para preparar os cromossomas se espalha. Aqui, vamos demonstrar um método de preparação de superfície-propagação núcleos de espermatócitos de rato.

Preparação de cromossomas se espalha a partir do Mouse espermatócitos

O principal objetivo deste estudo foi adaptar-se a agulha imerso procedimento de vitrificação (NVI) para cryopreserve toda zebrafish testículos. Além disso, a repetibilidade do método em cinco estirpes diferentes zebrafish foi testada.

Criopreservação de Zebrafish espermatogónias por toda agulha testículos imersos refrigeração ultra rápida

Oogénese nos mamíferos é conhecido por ser propenso a erro, especialmente devido à missegregation do cromossomo. Este manuscrito descreve métodos de preparação de cromatina espalhado para prófase rato, metáfase I e II-encenado oócitos. Estas técnicas fundamentais permitem o estudo de proteínas da cromatina-limite e a morfologia do cromossomo durante a ovogênese mamífera.

Preparações de espalhamento de cromatina para a análise da progressão de oócitos de camundongo da prófase para a metáfase II

Aqui apresentamos um método simples e eficiente para isolar células germinativas vivas e pós-meiotic de testículos de camundongos adultos. Usando uma baixa citotoxicidade, corante de DNA com proteção violeta e classificação celular ativada por fluorescência, pode-se isolar populações de células espermatogênicas altamente enriquecidas para muitas aplicações a jusante.

Isolamento de células spermatogênicas murinas usando um corante de ligação de DNA permeável celular-permeável violeta

Aqui, apresentamos um método simples para separar células foliculares e oócitos em folículos ovarianos de zebrafish, o que facilitará investigações do desenvolvimento ovariano em zebrafish.

Separação de células foliculares e oócitos em folículos ovarianos de zebrafish

As tecnologias CRISPR-Cas revolucionaram o campo da edição do genoma. No entanto, encontrar e isolar a edição de linha germinal desejada continua sendo um grande gargalo. Portanto, este protocolo descreve um método robusto para rastrear rapidamente espermatozoides de peixe-zebra injetados com CRISPR F0 para edições germinativas usando técnicas padrão de PCR, digesto de restrição e eletroforese em gel.

Triagem de espermatozoides para o isolamento rápido de edições germinativas em peixes-zebra

Erros meióticos nas sinapses e recombinação são comuns aos oócitos de mamíferos. A análise rigorosa das proteínas envolvidas nesses processos é essencial para entender como e por que a oogênese geralmente dá errado. As técnicas apresentadas aqui permitem o monitoramento abrangente da recombinação e sinapses para avaliar a qualidade do oócito em camundongos.

Preparação de Spreads Cromossômicos Meióticos de Oócitos de Camundongos para Avaliação de Sinapse e Recombinação

Aprenda a preparar espalhamentos de cromossomos meióticos de espermatócitos de zebrafish. Este protocolo de espalhamento de superfície nuclear permite visualizar a arquitetura cromossômica durante a prófase I usando microscopia de superresolução.

Preparação do Cromossomo Meioético Se espalha de espermatocitocitos de zebrafish

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