Name: Ex Vivo pressurizado Hipocampal Capilar-Parenchymal Arteriole Preparação para estudo funcional (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Aprenda a isolar arteríolas e capilares do hipocampo murino para estudos de miografia pressurizada e sinalização vascular ex vivo. Este método elimina efeitos de tecidos adjacentes e permite análises funcionais precisas.

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Os autores gostariam de agradecer a Jules Morin por comentários perspicazes sobre o manuscrito. Esta pesquisa foi financiada por prêmios da organização sem fins lucrativos CADASIL Together We Have Hope, do Center for Women's Health and Research e do NHLBI R01HL136636 (FD).

Todos os experimentos foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Universidade do Colorado, Anschutz Medical Campus e foram realizados de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde.
1. Soluções
<ol><li>Use solha-tampão de MOPS para a dissecação e para manter amostras em 4 °C antes de sua utilização. Não gaseie a solução. Prepare MOPS soro fisiológico amortecida com seguinte composição: 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 5 mM glicose, 3 mM MOPS, 0.02 mM EDTA, 2 mM pyruvate, 10 mg/mL bovine serum albumin, pH 7.3 em 4 °C.</li>
	<li>Use o líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF) como solução de banho e solução de pipeta. Gás tanto aCSF e Ca2 +-aCSF livre com 5% CO2,20% O2,e N2 saldo. Prepare a solução com a seguinte composição: 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3,1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 4M glicose, 2 mM CaCl2, pH 7.3 (com aeração com 5% CO2,20% O2, e N2 saldo).</li>
	<li>Obtenha a dilatação máxima em nominalmente Ca2+-free aCSF (0 mM [Ca2+]o,5 mM EGTA).</li>
</ol>2. Preparação da câmara do órgão
<ol><li>Insira capilares de vidro borosilicato (diâmetro externo = 1,2 mm; diâmetro interno = 0,69 mm; comprimento = 10 cm) em um puxador de vidro. Puxe o capilar para fazer uma ponta longa e fina em uma extremidade.</li>
	<li>Para um lado da câmara, adicione uma cânula que pode se conectar a uma bomba peristaltic em miniatura para pressurizar luminally o vaso. um microscópio de dissecação, quebre a ponta da cânula para que seja pequena o suficiente para caber no vaso de interesse, mas grande o suficiente para permitir que as soluções fluam através da ponta. Certifique-se de que a ponta é de aproximadamente 10-15 μm de diâmetro.</li>
	<li>Encha a cânula usando uma seringa com um filtro de 0,22 μm anexado com aCSF oxigenado. Certifique-se de que não há bolhas de ar ou detritos na cânula.</li>
	<li>Adicione mais duas cânulas ao lado oposto da câmara. Não quebre suas dicas.</li>
</ol>3. Dissecção e isolamento do hipocampo
<ol><li>Eutanásia e decapita rasto um rato. Para este experimento, use um mouse C57BL6/J de 8 semanas de idade para comparar diferenças entre machos e fêmeas. Injetar o rato com pentobarbital e decapitar com tesoura cirúrgica.</li>
	<li>Usando pequenas tesouras de dissecação, corte a pele ao longo da linha média no topo de sua cabeça. Mova a pele para os lados.</li>
	<li>Começando no lado caudal do crânio, corte o crânio ao longo da linha média até que as lâmpadas olfativas sejam alcançadas. Retire partes do crânio até que o cérebro seja exposto.</li>
	<li>Retire lentamente o cérebro, começando perto do nariz do rato. Separe o cérebro das lâmpadas olfativas, nervos cranianos e medula espinhal cortando as estruturas com a pequena tesoura de dissecação.</li>
	<li>Coloque o cérebro em uma placa de dissecação com solução MOPS suficiente para submergi-lo completamente. Usando um microscópio de dissecação, coloque o cérebro no centro da placa de dissecação com o lado ventral voltado para baixo.</li>
	<li>Usando uma lâmina de barbear, corte o cérebro ao meio ao longo da fissura longitudinal. Segure a lâmina para que a borda afiada seja paralela à parte inferior da placa de dissecação. Pressione a lâmina através do cérebro em um golpe. Mova um hemisfério para o lado da placa.</li>
	<li>Realize os seguintes passos para cada hemisfério separadamente ou em paralelo.<ol>
<li>Coloque um hemisfério no centro da placa para que a linha média está voltada para baixo. Em seguida, use a lâmina de barbear para cortar ao longo da fissura transversal para remover o cerebelo e tronco cerebral. Empurre a lâmina diretamente através do tecido.</li>
		<li>Gire o hemisfério para que o lado medial esteja enfrentando(Figura 1A). Use uma espátula para manter o cérebro no lugar. Usando uma segunda espátula, insira a ponta abaixo do corpo caloso e colher por baixo para remover o tálamo, septo e hipotálamo, cobrindo o hipocampo(Figura 1B).</li>
		<li>Certifique-se de que o hipocampo é agora visível como uma estrutura curvaperto do lado posterior do cérebro. Usando uma espátula para manter o ceceto no lugar, use a segunda espátula para colher o hipocampo para fora do cerebelo (Figura 1C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfira o hipocampo para uma nova placa de dissecação cheia a meio caminho com a solução MOPS. Descarte o resto do cérebro.</li>
</ol>4. Isolamento arteriole hipocampal
<ol><li>Complete as seguintes etapas para cada hipocampo.<ol>
<li>Afixe um dos hipocampos usando pequenos pinos em cada extremidade da seção. A artéria hipocampal está virada para cima.</li>
		<li>Usando fórceps muito afiados, estica delicadamente seções pequenas do hipocampo. Isso vai soltar o tecido em torno das artérias, tornando mais fácil dissecá-los.</li>
		<li>Busca através do tecido hipocampal dorsal para identificar a artéria transversal externa (Figura 1C)16,27.</li>
		<li>Pegue suavemente a artéria transversal externa e lentamente puxá-la para longe do tecido para coletar as artérias e capilares que perfundem a região CA3 do hipocampo.</li>
		<li>Uma vez que não há mais vasos para serem removidos do tecido, descarte os hipocampi. Mantenha os vasos no gelo em placas enquanto não está em uso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Hippocampal capilar-parenchymal arteriole cannulation
<ol><li>Encontre uma arteriosle com um galho que termina com capilares. Transfira-o para a câmara de órgãos. Certifique-se de que o arteriole é de cerca de 15-30 μm quando totalmente dilatado(Figura 1D).</li>
	<li>Monte cuidadosamente o vaso sanguíneo, empurrando a ponta da cânula através da parede arteriole abaixo da área alvo. Cuidadosamente deslize o vaso para a cânula até que haja tecido suficiente para colocar o empate.</li>
	<li>Faça um nó solto com 12-0 suturas de nylon para que ele se encaixa sobre o vaso sanguíneo e cânula. Use um nó de meio engate para garantir laços. Em seguida, puxe as extremidades para apertar o nó e proteger o arteriole para a cânula. Remova todas as filiais estranhas da embarcação abaixo do laço delicadamente puxando os com fórceps.</li>
	<li>Faça outra gravata e fixá-lo do outro lado da arteriole para selá-lo.</li>
	<li>Abaixe a cânula com a embarcação unida até que esteja lisa de encontro ao coverslip na parte inferior da câmara. Tenha cuidado para não baixar a cânula demais ou ele vai quebrar.</li>
	<li>Usando uma cânula no lado oposto da câmara, abaixe-a de modo que o ponto dele pine para baixo o laço na extremidade do arteriole.</li>
	<li>Use a terceira cânula para fixar o galho capilar para o coverslip. Coloque a ponta perto do final do ramo, deixando as extremidades dos capilares expostos (não debaixo da cânula).</li>
</ol>6. Miografia de pressão
<ol><li>Mova a câmara do escopo de dissecação para o microscópio com o software de gravação.</li>
	<li>Conecte a tubulação de entrada e saída à câmara para perfusão. Inicie a perfusão com aCSF aquecido (37 °C) a uma taxa de fluxo de 4 mL/min.</li>
	<li>Anexar a cânula pressurização a uma bomba peristaltic emparelhado com um transdutor de pressão e trazer a pressão interna para 20 mm Hg.</li>
	<li>Comece o software de gravação. Ajuste as configurações de microscópio e imagem para alcançar a imagem mais clara possível. Comece a gravação uma vez que as configurações são otimizadas para o software de detecção.</li>
	<li>Aumentar a pressão do navio até 40 mm Hg ao gravar o diâmetro arterial com um software de detecção de borda.</li>
	<li>Permita que ~15-20 min lave a solução MOPS para fora da câmara com aCSF, e deixe a preparação da HiCaPA equilibrar e desenvolver o tom miogênico.</li>
	<li>Para testar a viabilidade de um navio, aplique a solução 1 μM NS309 à perfusão de banho (ver Figura 2A,B e a seção resultados representativos). O segmento arteriolar deve dilatar, demonstrando cerca de 30-40% de tom miogênico como descrito anteriormente3,14,20.</li>
</ol>7. Estimulação focal de extremidades capilares
<ol><li>Uma vez que o tom de base para o arteriole foi estabelecido e a função endotelial avaliada, teste a resposta da estimulação capilar.</li>
	<li>Usando um puxador de vidro, faça cânulas de modo que haja um ponto fino em uma extremidade. Quebre a ponta fora de uma cânula de modo que a droga testada possa fluir através da ponta lisamente em 5 psi.</li>
	<li>Preencha a cânula com a solução de droga de interesse e adicioná-lo a um micromanipulador de 3 eixos ligado ao microscópio. Conecte a tubulação do sistema de ejeção de pressão à cânula.</li>
	<li>Lentamente abaixe a cânula no banho perto dos capilares, tomando cuidado para não atingir qualquer parte do navio ou hardware na câmara. Manobrar a ponta da cânula ao lado das extremidades dos capilares sem tocá-los. Mantenha a ponta da cânula apenas fora do coverslip para impedir que a embarcação seja estimulada se a cânula escapa.</li>
	<li>Quando estiver pronto para estimular os capilares, abaixe a cânula para o deslizamento de capa e ao lado dos capilares. Ative o sistema de ejeção de pressão com o tempo de ejeção desejado (aqui 20 s). Uma vez que a estimulação é terminada, levante a cânula ligeiramente para evitar uma estimulação mais adicional.</li>
	<li>Repita a estimulação, se necessário. Alterar a cânula do sistema de ejeção de pressão para testar diferentes compostos de drogas.</li>
	<li>Para confirmar que apenas os capilares estão sendo estimulados, preencha a cânula com a solução de 1 μM NS309 e repita os degraus acima. NOTA: As células endotélias capilares não expressam canais K+ ativados pelo NS309, de modo que a arteriole não deve responder à estimulação. Se o arteriole dilata, então a cânula terá de ser reposicionada ou o diâmetro do buraco terá de ser menor (ver Figura 2A,B e a seção de Resultados Representativos).</li>
</ol>

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<li>Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Cannulation+of+Cerebral+Parenchymal+Arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), 1-11 (2016).</li>
<li>Bayliss, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+local+reactions+of+the+arterial+wall+to+changes+of+internal+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure.</a> The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).</li>
<li>Montagne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+breakdown+in+the+aging+human+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier breakdown in the aging human hippocampus.</a> Neuron. 85 (2), 296-302 (2015).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+heparin+oligosaccharides+rapidly+target+the+hippocampus+in+sepsis%2C+potentially+impacting+cognitive+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (19), 9208-9213 (2019).</li>
<li>Kim, K. J., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+in+vitro+approach+to+study+neurovascular+coupling+mechanisms+in+the+brain+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation.</a> The Journal of Physiology. 590 (7), 1757-1770 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A preparação pressurizada hicapa (hipocampal capilar-parenchymal arteriole) descrita no presente manuscrito é uma extensão do nosso procedimento bem estabelecido para isolar, pressurizar e estudar as artérias parenchymal29. Recentemente, relatou que os canais Kir2.1 em células endotélias capilares cerebrais sentido aumenta em [K+]o associado com a ativação neural, e gerar um sinal hiperpolarizante ascendente que dilata artérias rioacima 20. Revelar est...

A circulação pial na superfície do cérebro tem sido objeto de muito estudo, em parte por causa de sua acessibilidade experimental. No entanto, a topologia da vasculatura cerebral cria regiões distintas. Em contraste com a robusta rede pial rica em anastomoisés com capacidade substancial para redirecionar o fluxo sanguíneo, as artérias parenchymal intracerebrais (PAs) apresentam fornecimento colateral limitado, cada um deles perfusando um volume discreto de tecido nervoso1,2. Isso cria um efeito de gargalo sobre o fluxo sanguíneo que, combinado com características fisiológicas únicas3,4,5,6,7,8, faz das artérias intracerebrais um local crucial para o fluxo sanguíneo cerebral (CBF) regulamento9,10. Apesar dos desafios técnicos inerentes ao isolamento e à cannulação das As, a última década tem visto um aumento do interesse em estudos funcionais ex vivo usando embarcações pressurizadas11,12,14,15,16, 17. Uma das razões para esse aumento do interesse é o considerável esforço de pesquisa realizado sobre o acoplamento neurovascular (NVC), o mecanismo que sustenta a hiperemia funcional cerebral18.
Regionalmente, a CBF pode aumentar rapidamente após a ativação neural local19. Os mecanismos celulares e as propriedades de sinalização que controlam o NVC são incompletamente compreendidos. No entanto, identificamos um papel previamente inesperado para os capilares cerebrais durante o NVC na detecção de atividade neural e traduzi-lo em um sinal elétrico hiperpolarizante para dilatar artérias a montante20,21,22. Os potenciais de ação23,24 e a abertura dos canais K+ (BK) ativados por grande conduta Ca2+(BK) nos pés arrumados ascíticos25,26 aumentam a concentração interstitial de íons de potássio [K+]o, o que resulta na ativação de canais retrógrados fortes K+ (Kir) no endotelium vascular dos capilares. Este canal é ativado por Kexterno + mas também pela própria hiperpolarização. Espalhando-se através de junções gap, a corrente hiperpolarizadora, em seguida, regenera em células endotélias capilares adjacentes até a arteriole, onde causa relaxamento miócito e aumento cbf20,21. O estudo deste mecanismo nos levou a desenvolver uma preparação pressurizada de arteriole capilar-parenchymal (CaPA) para medir o diâmetro arteriolar durante a estimulação capilar com agentes vasoativos. A preparação do CaPA é composta por um segmento de arteriole intracerebral cannulado com uma ramificação capilar intacta a jusante. As extremidades capilares são comprimidas contra o fundo de vidro de câmara por uma micropipette, o que oclude e estabiliza toda a formação vascular20,21.
Anteriormente fizemos inovações instrumentais por imagem capa preparações do córtex do rato20,21 e arterioles da amígdala de rato13 e hipocampo16,17. Como a vasculatura hipocampal recebe mais atenção devido à sua suscetibilidade a condições patológicas, aqui fornecemos um método passo a passo para a preparação da CaPA do hipocampo do camundongo (HiCaPA) que não só pode ser usado em estudos funcionais de NVC, mas também em biologia molecular, imunoquímica e eletrofisiologia.

<table><tbody><tr><td>0,22&micro; m Filtros de seringa</td><td>CELLTREAT Scientific Products</td><td>229751</td><td></td></tr><tr><td>12-0 Nylon (12cm) Preto</td><td>Microcirurgia Instruments, Inc</td><td>S12-0 NYLON</td><td></td></tr><tr><td>Controlador Automático de Temperatura</td> Warner <td>Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de Borossilicato Diâmetro Externo: 1,2 mm, Diâmetro Interno: 0,68 mm</td><td>Sutter Instruments</td><td>B120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 di-hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Escopo de dissecção</td><td>Olympus</td><td>SZ11</td><td></td></tr><tr><td>ECOLINE VC-MS/CA 4-12 &mdash; bomba completa com acionamento e cabeça de bomba MS/CA 4-12</td><td>Ismatec</td><td>ISM 1090</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Fina - Ferramentas de</td><td>Ciência Fina</td> Sharp <td>14063-09</td><td></td></tr><tr><td>Aquecedor de Água Inline</td><td>Warner Instruments</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>Integra&trade; Miltex&trade; Fórceps de Tecido</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-460-117</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio heptahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>MgCl Anidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>ML 133 cloridrato</td><td>Tocris</td><td>4549</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>NS309</td><td>Tocris</td><td>3895</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III - Sistemas de Dispensação de Microinjeção Intracelular, 2 canais</td><td>Parker Hannifin</td><td>052-0500-900</td><td></td></tr><tr><td>Servo Controlador de Pressão com Bomba Peristáltica</td> Sistemas <td>de Vida Instrumentação</td><td>PS-200</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de Sódio</td><td>Pinça</td><td></td> Super Fina Sigma-Aldrich P3662 <td></td></tr><tr><td></td><td>Tesoura Cirúrgica Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>- Sharp-Blunt</td><td>Ferramentas Fine Science</td><td>14001-13</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de Micropipeta Vertical</td><td>Narishige</td><td>PP-83</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo pressurizado hipocampal capilar-parenchymal arteriole preparação para estudo funcional

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

De alterações comportamentais sutis à demência em estágio avançado, o comprometimento cognitivo vascular geralmente se desenvolve após a isquemia cerebral. Acidente vascular cerebral e parada cardíaca são doenças extremamente sexualmente dimórficas, e ambos induzem isquemia cerebral. No entanto, o progresso na compreensão do comprometimento cognitivo vascular e, em seguida, o desenvolvimento de tratamentos específicos para o sexo, tem sido parcialmente limitado por desafios na investigação da microcirculação cerebral de modelos de camundongos em estudos funcionais. Aqui, apresentamos uma abordagem para examinar a sinalização capilar-a-arteriole em uma preparação de arteriole capilar-parenchymal hipvivo (HiCaPA) do cérebro do rato. Descrevemos como isolar, cannuar e pressurizar a microcirculação para medir o diâmetro arteriolar em resposta à estimulação capilar. Mostramos quais controles funcionais apropriados podem ser usados para validar a integridade de preparação hicapa e exibir resultados típicos, incluindo testar o potássio como um agente de acoplamento neurovascular e o efeito do inibidor recentemente caracterizado da família do canal de potássio retificada kir2, ML133. Além disso, comparamos as respostas nos preparativos obtidos de camundongos machos e fêmeas. Embora esses dados reflitam investigações funcionais, nossa abordagem também pode ser usada em biologia molecular, imunoquímica e estudos de eletrofisiologia.

A pequena condução endotelial (SK) e a condução intermediária (IK) Ca2+sensíveis aos canais K+ exercem uma influência dilatória sobre o diâmetro das PAs. Aplicação de banho de 1 μM NS309, um agonista sintético do canal IK e SK, causou quase dilatação máxima (Figura 2A,B). No entanto, as células endotélias capilares não possuem canais IK e SK e não hiperpolarizam em resposta ao NS30920. Como result...

O presente manuscrito detalha como isolar as artérias hipocampais e capilares do cérebro do rato e como pressioná-las para a miografia de pressão, imunofluorescência, bioquímica e estudos moleculares.

Ex Vivo pressurizado Hipocampal Capilar-Parenchymal Arteriole Preparação para estudo funcional

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

Nosso método permite o estudo de vasos sanguíneos localizados em estruturas que de outra forma seriam difíceis de imaginar na Vivo, como o hipocampo. Como os vasos sanguíneos são removidos do tecido cerebral, a sinalização entre os capilares e a arteriola pode ser estudada sem efeitos fora do alvo no tecido circundante. Para isolar o hipocampo, use uma pequena tesoura de dissecção para cortar a pele ao longo da linha média na parte superior da cabeça do rato e mover a pele para os lados.Começando pelo lado caudal do crânio, corte o crânio ao longo da linha média até que as lâmpadas olfativas sejam alcançadas e remova partes do crânio até que o cerebrum seja exposto. Começando perto do nariz do rato, remova lentamente o cérebro, usando a tesoura para cortar as lâmpadas olfativas, nervos cranianos e medula espinhal. Submergir o cérebro, lado ventral para baixo em SALina tamponada MOPS, no centro de uma placa de dissecção, e coloque a placa sob um microscópio de dissecção.Segurando a borda afiada paralela à parte inferior do prato, use lâmina de barbear para cortar o cérebro ao meio ao longo da fissura longitudinal em um golpe. Coloque um hemisfério no centro da placa com a linha média voltada para baixo e empurre a lâmina de barbear diretamente através do tecido ao longo da fissura transversal para remover o cerebelo e o tronco cerebral. Gire o hemisfério para que o lado medial esteja voltado para cima e use uma espátula para manter o cérebro no lugar.Insira a ponta de uma segunda espátula abaixo do caloso corpus, cavando sob o tecido para remover o tálamo, o septo e o hipotálamo do hipocampo. O hipocampo deve agora ser visível como uma estrutura curva perto do lado posterior do cerebrum. Usando uma espátula para segurar o cerebrum no lugar, use a segunda espátula para tirar o hipocampo do cerebrum.Em seguida, transfira o hipocampi para uma nova placa de dissecção, preenchida a meio caminho com uma nova solução de MOP. Para o isolamento da artéria hipocampal, coloque pequenos pinos em cada extremidade de um hipocampo para fixar a amostra da artéria hipocampal para cima. Usando fórceps muito afiados, estique suavemente pequenas seções do hipocampo para afrouxar o tecido ao redor das artérias.E procure através dos tecidos hipocampais dorsais para identificar as artérias transversais externas. Quando a artéria estiver localizada, pegue a artéria transversal externa do hipocampo e lentamente puxe-a para longe do tecido para coletar as artérias e capilares. A artéria de cada hipocampo é removida separadamente.Quando não houver mais vasos a serem removidos, coloque as amostras no gelo e descarte o tecido hipocampal restante. Para a canulação das artérias, localize e arteriole com um ramo que termina com capilares e coloque a arteriola em uma câmara de órgãos. Empurre cuidadosamente a ponta da cânula através da parede da arteriola abaixo da área alvo para montar o vaso sanguíneo.Em seguida, deslize cuidadosamente o vaso para a cânula até que haja tecido suficiente para colocar a gravata. Use suturas de nylon 12-0 para fazer um nó solto que caberá sobre o vaso sanguíneo e a cânula, e use um nó meio engate para fixar as amarras, puxe as pontas para apertar o nó para fixar a artéria na cânula. Segure outro empate na outra extremidade da arteriola para selá-la.No lado oposto da câmara, abaixe uma segunda cânula até que o ponto da cânula abaixe a gravata na extremidade da artéria. Em seguida, use uma terceira cânula para fixar o ramo capilar no deslizamento de cobertura, colocando a ponta perto da extremidade do ramo, deixando as extremidades dos capilares expostas. Como a microcirculação cerebral é extremamente frágil, certifique-se de minimizar o alongamento e manuseio dos vasos durante o procedimento de cannulação para garantir a sobrevivência das artérias.Para análise de mografia de pressão, transfira a câmara para um estágio de microscópio leve com software de gravação e conecte a tubulação de entrada e saída à câmara para profusão. Inicie a profusão com 37 graus Celsius Fluido cefalorraquidiano artificial a uma taxa de fluxo de quatro mililitros por minuto, e conecte a cânula de pressão à bomba peristáltica emparelhada com um transdutor de pressão. Leve a pressão interna para 20 milímetros de Mercúrio e inicie o software de gravação.Ajuste o microscópio e as configurações de imagem para alcançar a imagem mais clara possível. E use o software de detecção de borda para verificar se a arteriola tem cerca de 15 a 30 micrômetros de diâmetro quando estiver totalmente dilatada. Uma vez que as configurações tenham sido otimizadas, inicie a gravação e aumente a pressão intravascular no vaso até 40 milímetros de Mercúrio, enquanto registra o diâmetro da arteriola com o software de detecção de borda.Em seguida, profuse a câmara por 15 a 20 minutos para lavar a solução MOP. Para testar a viabilidade do vaso, aplicar uma solução micromolar NS309 à profusão do banho, o segmento arteriolar deve dilatar, demonstrando um tom miogênico de 30 a 40%. Uma vez estabelecido o tom de linha de base para a arteriola, use um puxador de vidro para fazer cânulas com um ponto fino em uma extremidade, e use fórceps para quebrar a ponta de cada cânula, de modo que a droga de interesse possa fluir suavemente através da ponta a cinco quilos de pressão por polegada quadrada.Encha a cânula com a droga de interesse. E carregue a cânula em um micromanipulador de três eixos ligado ao microscópio. Conecte a tubulação do sistema de ejeção de pressão à cânula, e lentamente baixe a cânula no banho perto dos capilares, tomando cuidado para não atingir nenhuma parte do vaso ou da câmara.Para estimular os capilares, baixe a cânula até o deslizamento ao lado dos capilares e ative o sistema de ejeção de pressão com o tempo de ejeção desejado. No final da estimulação, levante ligeiramente a cânula para evitar mais estímulos. Para confirmar que apenas os capilares estavam sendo estimulados, preencha a nova cânula com um micromolar de solução NS309 e estimule os capilares como demonstrado.Em seguida, obtenha a vasodilatação máxima banhando a preparação com a solução livre de cálcio. A aplicação do banho de um micromolar NS309 causa uma dilatação quase máxima da arteriola devido aos canais de potássio sensíveis ao cálcio no endotélio. As células endoteliais capilares, porém, carecem de canais de condução intermediários e pequenos e não hiperpolarizam em resposta ao agonista, como resultado, estimular extremidades capilares com NS309, não causa dilatação arteriolar a montante, isso indica que o NS309 não atingiu a arteriola, podendo ser usado como controle para acessar a restrição espartacial do composto aplicado aos capillares por pressão.Utilizando a preparação da artéria parênita capilar hipocampal como demonstrado, a aplicação de um fluido cerebrospinal artificial suplementado com 10 milimônios potássio nas extremidades capilares, resulta em uma dilatação arteriolar a montante que não difere entre as preparações de camundongos machos e fêmeas. Além disso, a adição do inibidor Kir2 ML 133, praticamente aboli a dilatação arteriolar induzida capilar, em resposta a 10 milimólars potássio em preparações de camundongos machos e fêmeas. Ao montar a vesssel sanguínea, limite interações diretas com o vaso sanguíneo para minimizar os danos e aumentar a viabilidade do vaso.Uma vez que o vaso sanguíneo tenha sido isolado, diferentes compostos medicamentosos podem ser testados ou o vaso sanguíneo pode ser processado para estudos de biologia olecular, imunoquímica ou eletrofisiologia.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra um método para isolar os tubos endoteliais do parênquima cerebral de camundongos. Por meio de uma combinação de digestão enzimática e dissociação mecânica, o processo produz um tubo intacto com células endoteliais.

Preparando tubos endoteliais cerebrais a partir de arteríolas parenquimatosas de camundongos

Um protocolo para culturas fatia organotípica entorhino-hipocampal, que permite a reprodução de muitos aspectos da lesão cerebral isquêmica, é apresentado. Ao estudar as mudanças do neurovasculature além de alterações nos neurônios, este protocolo é uma ferramenta versátil para estudar mudanças plásticas no tecido neural após lesão.

A Análise de Neurovascular Remodelação em Entorhino-hipocampal culturas Organotípicas Fatia

Este manuscrito descreve um protocolo simples e reprodutível para isolamento de arteríolas intracerebrais (um grupo de vasos sanguíneos que engloba arteríolas parenquimatosas, arteríolas penetrantes e arteríolas pré-capilares) de camundongos, para ser usado em miografia de pressão, imunofluorescência, bioquímica e estudos moleculares.

Isolamento e Canulação da cerebral parenquimatosa Arteríolas

Este manuscrito descreve em vitro protocolos de vídeo microscopia para avaliar a função vascular nas artérias de resistência cerebral de rato. O manuscrito também descreve técnicas para avaliar a densidade de microvessel com perfusão de lectina e tecido fluorescente etiquetada usando Laser Doppler Flowmetry.

Avaliação dos mecanismos de controlo Vascular utilizando a microscopia das artérias de resistência isolada de ratos

Considerando que a imagem multifóton só é eficaz em profundidades limitadas da superfície do tecido, é possível obter imagens com resolução de 3 μm em qualquer profundidade via pCLE. Aqui, apresentamos um protocolo para conduzir imagens de pCLE para medir a dinâmica microvascular no hipocampo de camundongos ictais e selvagens.

Endoscopia pré-clínica de varredura a laser confocal acoplada a fibra in vivo (pCLE) de capilares do hipocampo em camundongos acordados

Capilares do cérebro isolado do tecido do cérebro humano podem ser usados como um modelo pré-clínicos para estudar a função de barreira sob condições fisiológicas e fisiopatológicas. Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para isolar os capilares do cérebro do tecido do cérebro humano fresco.

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Apresentamos um método que pode fornecer mais insights sobre os primeiros eventos subjacentes a neurodegeneração e baseia a técnica de cérebro estabelecido ex vivo , combinando as vantagens dos experimentos in vivo e in vitro . Além disso, representa uma oportunidade única para comparação directa do grupo tratado e não tratado no mesmo plano anatômico.

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Este manuscrito descreve um protocolo simples para o isolamento de arteríolas da retina rato que podem ser usados em, cálcio imaging e pressão miografia Estudos eletrofisiológicos.

Isolamento de arteríolas retina para estudos de fisiologia celular Ex Vivo

A preparação intensiva de "tubos" endoteliais cerebrais intactos de arteriolas parenchímicas cerebrais é ilustrada para o estudo da regulação do fluxo sanguíneo cerebral. Além disso, demonstramos os pontos fortes experimentais deste modelo de estudo endotelial para a medição de imagens de fluorescência e eletrofisiologia das principais vias de sinalização celular, incluindo alterações no potencial intracelular [Ca2+] e membrana.

Isolamento e Análise Funcional do Endotélio Arteriolar do Cérebro do Rato Parenchyma

O protocolo aqui fornece uma amostragem dinâmica detalhada em tempo real do fluido extracelular do hipocampo de ratos acordados usando um sistema de microdiálise.

Coleta Dinâmica em Tempo Real de Fluido Extracelular do Hipocampo de Ratos Conscientes Usando um Sistema de Microdiálise

Aprenda a isolar arteríolas e capilares do hipocampo murino para estudos de miografia pressurizada e sinalização vascular ex vivo. Este método elimina efeitos de tecidos adjacentes e permite análises funcionais precisas.

Ex Vivo pressurizado Hipocampal Capilar-Parenchymal Arteriole Preparação para estudo funcional

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